人肾素结合蛋白基因的snp位点及其检测方法和诊断用途的制作方法

专利名称：：人肾素结合蛋白基因的snp位点及其检测方法和诊断用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物医药
技术领域：
。更具体地，涉及一种人肾素结合蛋白基因的SNP位点及其检测方法和诊断用途。
背景技术：
：肾素-血管紧张素系统(Renin-AngiotensinSystem,RAS)是体内重要的内分泌调控系统，直接参与血管收縮、代谢及交感神经的调节，是维持水_电解质平衡、调节血管张力、血容量和血压，参与心血管系统生长和重构的重要环节。既往认为RAS主要包括血管紧张素原(Angiotensinogen,AGT)、肾素(Renin)、血管紧张素I(AngiotensinI，AngI)、血管紧张素转换酶(Angiotensin-convertingenzyme,ACE)、I型血管紧张素II受体(AngiotensinIItype1rec印tor，AGTRl)及II型血管紧张素II受体(AngiotensinIItype2rec印tor，AGTR2)。近年来，一些新的研究又陆续为该系统增添了新的成员，例如肾素结合蛋白(Renin-bindingprotein，RENBP)等。鉴于RAS与心血管系统疾病发生密切相关，对该系统的研究日益受到关注。RAS的激活，始动于肾素的释放。肾素主要来源于肾近球细胞，首先肾素mRNA在肾近球细胞内产生前肾素原，然后移去一个单肽并糖基化转变为肾素原。一些肾素原在肾近球细胞内转化为肾素，另一些肾素原则直接进入血液循环。血管组织对肾素原摄取较多，因此血管可能是肾素原转化为肾素的主要部位。局部组织如肾上腺、脑、心脏等也能合成肾素。但是，局部组织产生的肾素是主要来源于血浆摄取，还是主要来源于自身合成还有待于进一步研究。通常认为，血压下降或心输出量减少可引起肾脏的血液灌流量不足，肾灌注减低或肾小管钠浓度减少可剌激肾小球旁细胞释放肾素入血。人肾素结合蛋白(RENBP)是近年来发现的一种蛋白溶酶，由417个氨基酸组成，属N-酰基-D-糖胺2-差向异构酶(NAGE)，通过参与N-乙酰神经胺酸(唾液酸，NeuAc)的合成而参与糖代谢。体外研究发现，肾素结合蛋白可与肾素l:l特异型相结合，结合时需要亮氨酸拉链结构，肾素第232-253氨基酸可能是与肾素结合蛋白作用的位点，两者共同形成高分子量肾素复合物(highmolecularmassrennin)，抑制肾素活性，推测其可能参与RAS系统的调节作用。肾素结合蛋白主要可能由肾小球膜细胞合成，属细胞内酶，在肾小管、集合管、脂肪组织和心脏内皮细胞等有表达，在血浆中不能被测得，究竟RENBP在体内如何与肾素相互作用，其生理功能是什么，目前尚不知晓。国内外对RAS的研究显示，RAS基因变异与高血压、冠心病、动脉粥样硬化等众多心血管疾病的发生和发展密切相关。迄今为止，对RAS基因变异和心血管疾病的研究多集中于AGT基因M235T、ACE基因I/D多态和AGTR1基因1166A/C多态，有相似的结论，也有相左的报道，研究大多在高加索人群中开展，且对该系统其他基因的变异涉猎有限。人RENBP基因位于Xq28，有10个外显子和9个内含子，对人RENBP基因变异的研究刚刚起步。Knoll等在高加索人群中发现了6号内含子-7号外显子连接处的多态，C等位基因频率为0.18。男性携带T等位基因者，血浆肾素原水平增高，但未发现T61C多态与血浆肾素和血压间的相关性。Laan等在遗传进化研究中发现，Saami人和芬兰人中，C等位基因频率分别为0.21和0.19。Sunder-Plassmann等在奥地利人群中未发现T61C多态与高血压危象发病之间的相关性。本发明试图在中国华东地区汉族人群中对人RENBP基因的启动子区和编码区的SNP进行检测，主要探讨人RENBP基因变异和冠心病发病的相关性，明确人RENBP基因变异是否增加冠心病和/或各种亚型的危险性。
发明内容本发明要解决的技术问题之一是提供一种人肾素结合蛋白基因的SNP位点。本发明要解决的技术问题之二是提供一种检测人肾素结合蛋白基因的SNP位点的引物。本发明要解决的技术问题之三是提供一种检测人肾素结合蛋白基因的SNP位点的方法。本发明要解决的技术问题之四是提供一种人肾素结合蛋白基因的SNP位点在诊断冠心病中的用途。在本发明的一方面，提供一种人肾素结合蛋白基因的SNP位点，该位点是人肾素结合蛋白基因启动子区-1590位的A/G多态，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。所述人肾素结合蛋白基因启动子区-1590位的A/G多态是GA基因型多态。在本发明的另一方面，提供一组检测人肾素结合蛋白基因的SNP位点的引物，为SEQIDNO.2SEQIDNO.4所示的碱基序列，SEQIDNO.2和SEQIDNO.3为引物对。在本发明的另一方面，提供一种检测人肾素结合蛋白基因的SNP位点的方法，包括如下步骤1)通过PCR-直接测序法在人肾素结合蛋白基因的调控区和编码区寻找SNP;2)在待测SNP所在片段进行PCR扩增反应；3)进行SNaPshot反应；4)进行毛细管电泳。步骤1)中，PCR-直接测序法采用的引物是SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示序列；步骤2)中，PCR扩增反应的引物是SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示序列；步骤3)中，SNaPshot反应的引物是SEQIDNO.4所示序列。在本发明的另一方面，提供一种人肾素结合蛋白基因的SNP位点(该位点是人肾素结合蛋白基因启动子区-1590位的A/G多态)在诊断冠心病中的用途。本发明中，"SNP"指单核苷酸多态性分子标记，属于第三代遗传标记，在人类基因组DNA序列测序和分析工作完成后，其能为系统地研究基因功能及相关遗传疾病提供有力的应用保障。由于其广泛分布于人类基因组并且相对稳定存在，因而在疾病相关基因定位及疾病的遗传机理研究应用中极具前景。通过发现特定群体中存在的SNP标记，并设计不同方案将发现的SNP进行人群规模化分型筛查，将直接为遗传性疾病的机理研究提供技术基础和手段；同时，对人类遗传性疾病的病因诊断、治疗及防治产生重大影响。本发明在中国华东地区汉族人群中，对人肾素结合蛋白基因的SNP开展了研究。新发现一个启动子区SNP(是人肾素结合蛋白基因启动子区-1590位的A/G多态)。由于人肾素结合蛋白基因位于Xq28，在进行病例对照关联分析时，按照性别不同分开统计。本发明发现，在女性人群中，人肾素结合蛋白基因启动子区-1590位的A/G多态是女性冠心病发病的危险因素。尤其是GA杂合子，与冠心病显著相关，携带GA基因型者，总体冠心病发病危险是GG基因型者的3.9倍。经亚组分析发现，人肾素结合蛋白基因启动子区-1590位的A/G多态与冠心病合并高血压的发病、与心绞痛的发生、及与冠状动脉粥样硬化的病变严重程度均相关，携带GA基因型者的发病危险是GG基因型者的4-5倍。尽管在心肌梗死和冠心病不伴高血压组中，本发明研究未发现基因型分布的显著差异，但由于这二亚组人数太少(22人和38人)，需要更多的样本才能得到可信的结论。而在男性人群，冠心病组的A/_基因型高于对照组(25.2%vs20.9%)，但未达统计学差异。肾素结合蛋白基因的功能，目前尚不清楚，Schmitz等利用基因敲除技术造成的肾素结合蛋白基因缺失鼠，外表正常，肾脏结构无异常，血浆肾素活性和表达均不受影响，推测肾素结合蛋白可能在细胞内调节肾素活性。对于人肾素结合蛋白基因启动子区-1590位A/G多态的功能，至今亦无相关报道。本发明通过Matinspector软件预测该位点可能是一些转录因子结合的位点，A多态可能是V$0CT1_06的结合位点，而G多态可能是V$ARNT_01的结合位点。由此设想，位于启动子区该A/G多态，可能产生和毁坏了一些转录因子的结合位点，影响肾素结合蛋白基因的表达，如果肾素结合蛋白表达量不足，其拮抗肾素的功能下降，局部RAS活性增强，使得冠心病的发病危险增加。根据Framingham的资料，对3584岁的人群随访26年的结果显示男性冠心病的发病率是女性的2倍，60%的冠心病发生于男性，女性出现冠心病的临床症状一般比男性晚10年。女性最常见的症状是心绞痛，而经冠脉造影只有6070%有狭窄，男性则多表现为心肌梗死，冠脉造影90%以上有狭窄。上海地区的流行病学资料也显示，男女冠心病发病性别之比为2.74:1。一直以来，对冠心病发病机理的研究存在着一种假说，推测男性和女性的冠心病发病存在不同的机制和通路，如女性雌激素等性激素水平对心血管系统的保护作用等，女性在绝经期后冠心病发展较快的原因，可能是由于失去了女性激素的保护作用，绝经期可改变血脂的分布、凝血因子和血管内皮的功能。本发明从另一个侧面-基因流行病学角度阐明，男女冠心病发病确实可能存在不同的机制和通路，基因易感性也可能是一个重要的因素。本发明首次公开人肾素结合蛋白基因启动子区存在一个SNP，是人肾素结合蛋白基因启动子区-1590位的A/G多态。该A/G多态可能是女性冠心病发病的危险因素。携带GA基因型者，总体冠心病发病危险是GG基因型者的3.9倍。该多态与冠心病合并高血压的发病、与心绞痛的发生、及与冠状动脉粥样硬化的病变严重程度均相关。因此，人肾素结合蛋白基因启动子区-1590位的A/G多态，可用于冠心病的早期辅助诊断和筛查。图1是本发明实施例中SNaPshot的电泳图像；图1中的引物延伸长度数值为各SNP位点SNaPshot引物长度加1;ddNTP的不同荧光染色红色_T蓝色-G黑色-C绿色-A;图1中NO.6为人RENBP基因启动子区-1590位G/A杂合子，其余编号是其他基因的SNPs，NO.1为C/T杂合子，NO.2为G/A杂合子，NO.3为C/T杂合子，NO.4为G/G纯合子，N0.5为C/T杂合子，N0.7为C/C纯合子，N0.8为G/T杂合子。图2是本发明人肾素结合蛋白基因部分启动子区域序列及发现的新SNP的序列示5意图。图3是本发明实施例的SNP的检测和验证中的测序反应程序示意图。图4是本发明实施例的SNP基因分型中的PCR反应程序示意图。图5是本发明实施例的SNP基因分型中的PCR纯化反应程序示意图。图6是本发明实施例的SNP基因分型中的SNaPshot反应程序示意图。图7是本发明实施例的SNP基因分型中的SNaPshot纯化反应程序示意图。具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述实施例—、实验样本1.冠心病组(CAD):来源于上海交通大学医学院附属瑞金医院心内科病房，依照1979年WHO颁布的缺血性心脏病诊断标准，均经冠状动脉造影确诊和/或有明确急性心肌梗死病史者。冠状动脉造影显示冠状动脉管腔狭窄>70%的，诊断为冠状动脉病变；左主干管腔狭窄>50%的，诊断为二支冠状动脉病变。排除糖尿病、脑梗塞、免疫性疾病、甲状腺疾病、神经系统性疾病、恶性肿瘤和肝肾疾患者。根据分析需要，将冠心病组再划分为3个亚组群，共6个亚组别①冠心病合并高血压组(CAD+HBP)和冠心病不伴高血压组(CAD-HBP);②心肌梗死组(MI)和心绞痛组(AP);③单支病变组和多支病变组。2.原发性高血压组(EH):来源于上海交通大学医学院附属瑞金医院心内科病房和门诊。诊断标准为收縮压等于或高于140mmHg和/或舒张压等于或高于90mmHg，或正在接受抗高血压药物治疗至少l年以上。排除继发性高血压、冠心病、脑梗塞、严重肝肾及甲状腺患疾者。3.对照组(control):来源于上海交通大学医学院附属瑞金医院体检门诊，经病史、体检、心电图等检查无冠心病、高血压、糖尿病和脑梗塞等表现，无严重肝肾、甲状腺、高血脂等患疾者。受试者均被询问详细病史、既往史、心血管、脑血管、糖尿病等家族史，吸烟、饮酒、饮食习惯。病例组详细询问药物使用情况，包括降压药、降脂药、抗凝药及抗血小板药物等。受试者的体格检查包括人体测量、血压、心率和心电图。生化检测指标包括血脂和空腹血糖水平。血糖和血脂由瑞金医院生化室测定其中总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)采用酶法测定；高密度脂蛋白酯(HDL-C)和低密度脂蛋白酯(LDL-C)采用磷钨酸镁沉淀法测定。4.样本准备血样经枸橼酸钠1:9抗凝处理后，采用经典酚-氯仿法抽提人基因组DNA，根据DNA样品的0D值，加入TE将DNA稀释至终浓度20yg/ml。二、SNP的检测和验证挑选12个冠心病例和12个正常对照样本，均无亲缘关系。通过PCR-直接测序法在基因的调控区和编码区寻找SNP。对检测到的SNP在小样本中，再经PCR-直接测序法加以验证。目的片段PCR扩增步骤包括l.PCR反应体系(25iU):10XBuffer(缓冲液)2.5iU，dNTPmix(脱氧核苷三磷酸混合液10mM)0.75ii1，MgCl2(25mM)2ii1，TaqDNA聚合酶(浓度5U/ul)0.2-0.3ii1，弓|物(20iiM)0.75iUX2，DNA模板(20ng/yl)1yl，其余为双蒸水。62.PCR反应程序95。C变性2min;94。C变性30sec，62。C退火lmin，72。C延伸40sec，共35个循环；最后72"延伸5min;4°C。3.PCR产物纯化(SAP和ExonI纯化)纯化体系(7ii1):PCR产物5iU，虫下碱酶(SAP，浓度7.633U/ii1，ABIBiosystem)1iil，夕卜切酶(ExonI，浓度20U/ii1，ABIBiosystem)1ii1。纯化反应37。C孵育15min，80。C15min。4.测序反应1)反应体系测序引物(引物为F:gggaggcatcctctgtgtg(SEQIDNO.2)，R:gagcagagcggtaggagtcat(SEQIDNO.3))(0.8iiM)、PCR产物和荧光测序MIX各2iU，共6ii1。2)测序反应程序见图3。3)乙醇沉淀。4)在ABI3700测序仪上行毛细管电泳，测序时间约2小时/板。5)确定SNP位点。三、SNP的基因分型1.本发明应用SNaPshot法进行基因分型1)工作原理明确需要进行基因分型的SNPs，将6-10个SNPs组合成一个SNaPshot反应体系，利用单碱基延伸反应(SingleBaseExtension,SBE)的原理，针对每个待测SNP，设计长度不同的单向寡核甘酸引物，在AmpliT叫DNA聚合酶和4种不同荧光标记的ddNTP存在的情况下，各条引物与各自互补的DNA模板结合，多条引物在一个反应体系中延伸，构筑了多重SBE反应。聚合酶在引物的3'末端延伸单个碱基反应即告终止，产物的长度为引物长度+l，延伸的碱基就是该样本在该位点的基因型，纯合子表现为单峰，杂合子表现为双峰。在ABIPRISM3700DNA测序仪上样体系中，加入专门设计的橙色荧光标记的GeneScan-120LIZSizeStandard作为长度内标，每5个碱基长度间隔做一个标记，用以标定不同长度的引物而达到区分不同SNP位点的目的。这种方法与测序类似，也叫微测序技术(minisequencing)。由于参与反应的单向寡核甘酸引物长度是可以控制的，因此设计不同长度的单向寡核甘酸引物并使之在同一个反应体系中进行检测是实验成败的关键。单向寡核甘酸引物除了遵循一般引物设计的要求外，还有一些特殊的要求①为避免最终SnaPshot产物的重叠，使各条引物以长度区分，需在引物的5'末端加上不同长度poly(dT)(或poly(dA)，poly(dC)，poly(dGACT))，这样既不影响引物的Tm值和引物特异性延伸反应，又可在ABIPRISM3700毛细管电泳时将各个片断分开。②最短的引物一般设定为20bp，过短对毛细管电泳的迁移率影响较大，过长则增加实验成本。③各引物的Tm值最好接近且高于5(TC，过低则不能形成配对。相邻两个SNP位点的引物之间长度一般相差4-6个核甘酸，如果相邻两个位点的SNP类型不相同(例如A/G与C/T)，引物长度相差4个碱基即可；如果相邻两个位点的SNP类型有重合(例如A/G与A/C)，引物长度最好相差6个碱基，以利判读；⑤引物设计可以从正反二向进行。例如，对于相邻两个位点是相同的SNP类型(例如A/G与A/G)，分别从正反二向设计引物(例如A/G与T/C)可以避免重叠。因此，多重SNaPshot反应即利用引物间长度的差异和单碱基延伸4种不同荧光标记的ddNTP而最终达到区分不同SNPs的作用，一次反应可以同时对610个SNPs进行基因分型，是一种通量较高的基因分型方法。SNaPshot试剂盒由美国生物应用系统公司提供，反应体系由本发明优化稳定。2)实验步骤①待测SNPs所在片段的PCR扩增反应a.PCR反应反应体系(lOiil):10XBufferl.OiUPrimer(20iiM)0.16iilX2dNTPmix(10mM)0.2ii1Mgcl2(25mM)1.2iUTaqDNA聚合酶(浓度5U/ul)0.08ii1DNA模板(20ng/ii1)1.0ii1ddH20补至10ii1PCR反应程序采用Touch-downPCR，见图4，其中*表示每经过一循环温度下降0.5度。b.经TouchdownPCR反应后，取1.5PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定产物，各扩增片断标定浓度后等量混合，组成PCR产物混合物。c.取5illPCR产物混合物，经酶(SAP和ExoI)纯化后作为下一步SNaPshot反应的模板。纯化反应体系PCR产物混合物5ii1SAP(浓度7.633U/ii1)0.065ii1ExoI(浓度20U/ii1)0.05ii1纯化反应程序见图5。②SNaPshot反应反应体系经纯化的PCR产物混合物1y1引物混合物2ill(各单向引物等量混合，终浓度0.5iiM)SnaPshot荧光混合物2ii1(含AmpliTaqDNA聚合酶和4种荧光标记的ddNTP)反应程序见图6。SNaPshot反应产物再经SAP纯化后待用经纯化的SNaPshot反应产物5ii1SAP(浓度7.633U/ii1)0.065ii1纯化反应程序见图7。③3700DNA测序仪的毛细管电泳a.上样体系甲酰胺GeneScan—120LIZSizeStandard0.2ii1纯化的SNaPshot反应产物b.95t:变性5分钟，冷却后在ABIPRISlkf3700DNA测序仪上进行毛细管电泳，运行GeneScan".7分析软件分析实验结果。人肾素结合蛋白基因启动子区-1590位A/G多态的扩增引物资料见表1。SNaPshot电泳图像见图1。表1人肾素结合蛋白基因部分扩增引物资料<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>四、统计分析1.应用SPSS10.0forWindows软件进行数据分析和统计。组间各临床变量均数的差异比较采用t检验；计算各组的基因型频率和等位基因频率，组间频数比较采用xs检验；相关疾病的等位基因和基因型风险率采用比数比(oddsratio,OR)表示，并进行危险度相关性分析。2.应用ARLEQUIN软件进行候选基因内各SNP的连锁不平衡分析，确认各SNP是否符合Hardy-Weinberg平衡(以对照组样本计算，统计基因型为纯合子和杂合子的期望频数，并将期望数与观察数进行x2检验，当P>0.05，认为观察所得的基因型频率符合Hardy-Winberg平衡)；3.调控区结合位点预测利用TRANSFAC4.0matrices和matrics搜寻程序Matlnspector(版本2.2，http://transfac.gbf.de/programs.html)进行可會g的转录因子结合位点的查询。五、结果1、冠心病组、高血压组和对照组间临床和实验室指标比较(表2)表2对照组、原发性高血压组和冠心病组临床和生化指标比较多态位点PCR扩增引物(5，—3')SnaPshot引物(5'—3')CONTROLEHCADn=183n=189n=356性别(男性/女性)Gender105/78105/84266/90(male/fe腿le)年龄age62.23±8.7863.78±10.8363.50±10.36体重指数BMI23.02±2.8225.20±3.07*23.97±3.31*收縮压SBP(mmHg)112.86±12.21168.14±21.71*141.07±22.03*舒张压DBP(皿nHg)74.44±7.87104.06±10.59*84.65±13.75*甘油三脂TG(mmol/L)1.28±0.621.79±1.03*1.89±1.30*胆固醇TC(咖ol/L)4.47±0.794.86±0.98*4.82±1.09*高密度脂蛋白胆固醇HDL-C(mmol/L)1.42±0.331.30±0.41*1.19±0.28*低密度脂蛋白胆固醇LDL-C(咖ol/L)2.84±0.863.17±0.98*2.99±0.97葡萄糖Glucose(咖ol/U4.74±0.555.45±1.76*5.84±1.87**与对照组比较P<0.012、人肾素结合蛋白基因SNP的检测人肾素结合蛋白基因(GenBankAccession#U52112)位于Xq28，有10个外显子和9个内含子，本发明检测人肾素结合蛋白基因共5607bp，其中包括启动子区1942bp，5'非翻译区191bp，编码区1254bp，外显子-内含子交界区1867bp，3'非翻译区16bp，3'末端337bp。结果在启动子区发现一个新的SNP，是人肾素结合蛋白基因启动子区-1590位的A/G多态(PositioninreferenceSeq.99132)，研究未发现曾在高加索人群中报道过的T61C多态(内含子区)。3、人肾素结合蛋白基因SNP的病例-对照关联分析本发明中，对人肾素结合蛋白基因启动子区-1590位的A/G多态开展了病例_对照关联分析。1)经Hardy-Weinberg平衡吻合度检验，人肾素结合蛋白基因启动子区-1590位的A/G多态符合Hardy-Weinberg平衡。2)由于人肾素结合蛋白基因位于Xq28，在统计基因型及等位基因频率时，按性别不同分别计算男性样本中，人肾素结合蛋白基因启动子区_1590位的八/6多态存在6/-和八/-两种基因型，基因型(同等位基因型频率)分布(表4)在各组的比较结果为(1)总冠心病组和对照组相比A/_基因型占25.2%，高于对照组(20.9%)，但未达统计学差异。(2)冠心病各亚组间的比较三群亚组(①冠心病合并高血压组和冠心病不伴高血压组②心肌梗死组和心绞痛组③单支病变组和多支病变组分别与对照组)中，6个组别分别与对照组相比，基因型分布无显著差异；每群亚组间相比，基因型分布亦无显著差异。(3)高血压组和对照组相比基因型分布无统计学差异。表4男性人群中人RENBP基因启动子区-1590位A/G多态基因型(等位基因)分布10多态位点样本数基因型(等位基因频率)与对照组比较<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>P=NS表示显著性检验中P>0.1女性样本中，人肾素结合蛋白基因启动子区-1590位的A/G多态存在GG、GA和AA三种基因型，基因型和等位基因频率分布(表5)在各组的比较结果为(1)总冠心病组和对照组相比GG、GA和AA三种基因型在二组中分别为56、31、3和63、9、6，基因型分布在两组中有显著差异(Fisherexacttest,P=0.001)。A等位基因在总冠心病组中占20.6%，高于对照组的13.5%，但尚未达到统计学意义(x2=2.95，P=0.08)。(2)冠心病各亚组间的比较①冠心病合并高血压组和冠心病不伴高血压组冠心病合并高血压组中，GG、GA和AA三种基因型分布与对照组相比有显著性差异(Fisherexacttest,P=0.0002)，冠心病不伴高血压组(人数较少，仅22人)与对照组相比，基因型和等位基因频率分布无显著差异；两亚组相比，基因型和等位基因频率分布则无显著差异。②心肌梗死组和心绞痛组心绞痛组中，GG、GA和AA三种基因型分布与对照组相比有显著性差异(Fisherexacttest，P=0.0001)，心肌梗死组(人数较少，仅38人)与对照组相比，基因型和等位基因频率分布无显著差异；两亚组相比，基因型和等位基因频率分布则无显著差异。③单支病变组和多支病变组分别与对照组相比，均显示基因型分布有显著差异，前者经Fisher确切概率检验，P值达到0.0002;后者经卡方检验(x2=10.493)P值为0.005。两亚组相比，基因型和等位基因频率分布则无显著差异。(3)高血压组和对照组相比基因型和等位基因频率分布无统计学意义。表5女性人群中人RENBP基因启动子区_1590位A/G多态基因型和等位基因分布<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>P=NS表示显著性检验中P>0.13)人肾素结合蛋白基因启动子区-1590位A/G多态对女性冠心病(及亚组)的发病危险度分析经危险度分析(表6)，人肾素结合蛋白基因启动子区-1590位的A/G多态是女性冠心病发病的危险因素。尤其是GA杂合子，与冠心病显著相关，携带GA基因型者，总体冠心病发病危险是GG基因型者的3.9倍。其中，冠心病合并高血压组中，GA基因型者冠心病发病危险是GG基因型者的4.4倍；心肌梗死组中，GA基因型者冠心病发病危险是GG基因型者的2.8倍，心绞痛组中，GA基因型者冠心病发病危险是GG基因型者的4.7倍；单支病变组中，GA基因型者冠心病发病危险是GG基因型者的3.4倍；多支病变组中，GA基因型者冠心病发病危险是GG基因型者的4.9倍。表6人RENBP基因启动子区-1590位A/G多态对女性冠心病(及亚组)的危险度分析<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>氺OR检验P〈0.05ftOR检验P〈0.014)采用Matinspector软件分析人肾素结合蛋白基因启动子区_1590位A/G多态是否含有转录因子的结合位点，分析结果见表7。表7推测的人RENBP基因启动子区_1590位A/G多态转录结合位点<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>4、结论本发明首次报道人肾素结合蛋白基因启动子区存在一个SNP，是人肾素结合蛋白基因启动子区-1590位的A/G多态，该A/G多态可能是女性冠心病发病的危险因素。携带GA基因型者，总体冠心病发病危险是GG基因型者的3.9倍。该多态与冠心病合并高血压的发病、与心绞痛的发生、及与冠状动脉粥样硬化的病变严重程度均相关。因此，人肾素结合蛋白基因启动子区-1590位的A/G多态，可用于冠心病的早期辅助诊断和筛查。〈110〉上海交通大学医学院附属瑞金医院〈120〉人肾素结合蛋白基因的SNP位点及其检测方法和诊断用途〈130>NP-08-12842〈160>4〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>540〈212>DNA〈213>人属，人禾中(homosapiens,human)〈400>1gccctggcagctggggaggcatcctctgtgtgctcccacccaccctcggcctcggctcat60gctcaggggatgagctttgtgcccagccgggctgtatctacctgccctgctcacaggcct120gtcatgttcac(a/g)attcatgtccagcctccctcctgcctccccagactgagtggtgccctca180gacggaaacgccgtattttcagataaacaccagaggcatgactgatgtggcccttgcctt240gtggagtgtgatgcagccgcggtgagacaagtgagctgaaggaatgcggagggtgggtag300ccccacaggtgccagctacagaagtggggtaggaagaagccttgtaccacccccaccagg360cgaagcgcccacaacgccatttgccaaaggtatggcaaatccgcaaggcccctcggttct420ggggccagccccatgtggcccctggcctccaccagccccagccatgactcctaccgctct■gctctgaaggacactttcccacccctctccttgggcctctgcgaggctaggctccaaggc540〈210>2〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈223〉引物gggaggcatcctctgtgtg19〈210>3〈211>21〈213〉人工序列〈220〉〈22l>misc—feature〈223〉引物gagcagagcggtaggagtcat21〈210>4<211〉42〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈223〉引物ttttttttttttttttttttttcacaggcctgtcatgttcac4权利要求一种人肾素结合蛋白基因的SNP位点，其特征在于，该位点是人肾素结合蛋白基因启动子区-1590位的A/G多态，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。2.如权利要求l所述的人肾素结合蛋白基因的SNP位点，其特征在于，所述人肾素结合蛋白基因启动子区-1590位的A/G多态是GA基因型多态。3.—组检测人肾素结合蛋白基因的SNP位点的引物，其特征在于为SEQIDN0.2SEQIDNO.4所示的碱基序列，SEQIDNO.2和SEQIDNO.3为引物对。4.一种检测人肾素结合蛋白基因的SNP位点的方法，其特征在于，包括如下步骤1)通过PCR-直接测序法在人肾素结合蛋白基因的调控区和编码区寻找SNP;2)在待测SNP所在片段进行PCR扩增反应；3)进行SNaPshot反应；4)进行毛细管电泳。5.如权利要求4所述的检测人肾素结合蛋白基因的SNP位点的方法，其特征在于，步骤1)中，PCR-直接测序法采用的引物是SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示序列；步骤2)中，PCR扩增反应的引物是SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示序列；步骤3)中，SNaPshot反应的引物是SEQIDN0.4所示序列。6.—种如权利要求1所述的人肾素结合蛋白基因的SNP位点在诊断冠心病中的用途。全文摘要本发明公开了人肾素结合蛋白基因启动子区存在的一个SNP位点，是人肾素结合蛋白基因启动子区-1590位的A/G多态，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。此外，本发明还公开了检测人肾素结合蛋白基因SNP位点的方法及其检测引物。另外，本发明还公开了人肾素结合蛋白基因的SNP位点在诊断冠心病中的用途。文档编号C12N15/11GK101768630SQ200810208250公开日2010年7月7日申请日期2008年12月30日优先权日2008年12月30日发明者刘艳,盛海辉,金玮申请人:上海交通大学医学院附属瑞金医院