LfcinB15-Mag12编码基因的合成及在大肠杆菌中表达的方法

专利名称：：LfcinB15-Mag12编码基因的合成及在大肠杆菌中表达的方法
技术领域：
：本发明属于农业畜牧兽医应用领域，具体涉及一种LfcinB15-Mag12编码基因技术。(二)
背景技术：
：抗生素的发展已有50多年的历史。由于它能防止畜禽的疾病发生，提高动物生产能力，提高养殖业效益，所以一直是添加剂预混料的重要组成部分。但是，抗生素添加剂的长期使用，能使许多病原菌产生耐药性，同时在畜产品中产生严重的药物残留，从而对畜禽疾病的进一步防治和人类的健康都产生了不利影响。因此，抗生素添加剂的使用在世界各国越来越被严格限制，从2006年1月1日起，欧盟就全面禁止在饲料中添加以保健促生长为目的的抗生素类词料添加剂。为了寻找抗生素的替代品，生产出既能有效防止畜禽疾病的发生，促进动物生长，又毒副作用小，无残留，无耐药性的绿色饲料添加剂，国内外许多畜牧兽医工作者进行了大量的研究，取得了一定进展。他们研究的抗生素替代品主要有酶制剂、酸化剂、益生菌、益生素、植物提取物、中草药、糖萜素等。但是这些抗生素替代品都存在生产成本过高，效果不明显，提取及生产的技术不成熟等缺点。抗菌肽为动物体内抵御外界微生物侵害、清除体内突变细胞的一类小分子多肽，具有广谱抗菌、无毒性、无耐药性、无残留与污染等优点，而且其热稳定性好，添加剂量小，适合在饲料生产过程中使用，具有与抗生素相同的性能而又完全符合畜产品安全生产的需要，极具有作为新一代饲料添加剂的潜质。近年来对抗菌肽的研究与开发成为研究热点。人们一方面在继续寻找新的阳离子抗菌肽，另一方面对已知的天然抗菌肽进行改造以求获得高效安全的抗菌药物。但是天然抗菌肽种类来源有限，提取困难，且多存在活性不理想或溶血毒性的缺陷，因此，以自然存在的抗菌肽为模板，设计合成衍生物，对研究抗菌肽作用机理、合成活性更强、毒性更低、更稳定、更广谱的抗菌肽具有重要意义，通过基因工程技术构建生物反应器获得抗菌肽的方法显示了广阔前景和巨大潜力。(三)
发明内容本发明的目的在于提供一种根据大肠杆菌密码子偏爱性设计的杂合肽LfcinB15-Mag12的编码基因，并将编码基因正反链分四条多核苷酸链合成，利用基因工程方法在大肠杆菌中成功表达了LfcinB15-Mag12。本发明的目的是这样实现的根据Kco//密码子偏爱性设计编码LfcinB1-15个氨基酸的活性基因片段和Magainin(1-12)的活性基因片段，利用表达载体pET-32a构建重组表达载体pET-32a-LfcinB15-Mag12，在pET-32a的多克隆位点前存在编码6个组氨酸标签的密码子，在pET-32a-LfcinB15-Mag12中，将编码LfcinB15-Mag1227个氨基酸的基因片段克隆在编码组氨酸标签的密码子后、限制性内切酶SalI、Ncol识别位点密码子之间，同时加入终止密码子TAG、TAA，分四段合成序列如下CGGGTATCG-3'片段2:5，-GTAAATTCCTGCACTCTGCTAAAAAATTCTAGTAAG-3，CCCAGTTT-3'片段4:5'-TTTCCAACGCCACTGCCAACGGCGGCATTTGAAAGC-3，下划线部分是加入的终止密码子TAG、TAA，斜体部分是限制内切酶SalI、NcoI识别序列，其余部分是牛乳铁蛋白-马盖宁杂合肽基因。本发明还有这样一些技术特征为便于直接克隆入经双酶切处理的pET-32a中，直接将酶切位点的粘末端设计入LfcinB15-Mag12基因中，即在LfcinB15-Mag12基因的上游及下游分别加入限制性内切酶SalI、NcoI识别位点经酶切后的片段。本发明的技术特点有1.根据大肠杆菌密码子偏爱性，设计了杂合肽LfcinB15-Mag12的编码基因，将编码基因正反链分四条多核苷酸链合成，退火连接后，成功获得了杂合肽LfcinB15-Magl2的编码基因。2.在合成的LfcinB15-Mag12编码基因片段两端直接引入粘性末端，连接入表达载体pET-32a，构建表达载体pET-32a-LfcinB15-Mag12，测序表明与设计完全一致。3.将表达载体pET-32a-LfcinB15-Mag12转化表达宿主五.co//DH5a，0.1mmol/LIPTG、3(TC诱导3h，产生了与预期分子量为23.9kD的特异诱导表达条带，经蛋白质印迹分析，分子量为24kDa的诱导条带为TRX融合蛋白，证明融合蛋白Trx-S-His-LfcinB15-Mag12成功获得表达。,4.对最佳诱导条件进行优化，在确定的最佳诱导条件下，即当菌体密度达到00600=0.6时开始诱导，0.3mmol/LIPTG、3(TC诱导4h，融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的22%。5.经NTA-亲和层析柱纯化回收融合蛋白Trx-S-His-LfcinB15-Mag12，纯度较高，达到95%以上，但产量较低，平均每升诱导细菌培养物仅获得19mg融合蛋白。6.按照酶蛋白质量比为1:100的比例利用肠激酶裂解融合蛋白Trx-S-His-LfcinB15-Mag12，23°C6h即可实现完全裂解，经截留分子量为5kDa的超滤管超滤后得到较纯的杂合肽LfcinB15-Magl2，平均每升诱导细菌培养物获得LfcinB15-Magl2200吗。7.利用薄层平皿琼脂糖纸片扩散法检测重组杂合肽LfcinB15-Mag12的抑菌活性，对金黄色葡萄球菌ATCC25923具有明显的抑制作用，表明本实验获得了具有生物学活性的重组LfcinB15-Mag12，利用基因工程方法首次成功实现了抗菌肽LfcinB15-Mag12的异源表达。本发明根据大肠杆菌密码子偏爱性，设计了杂合肽LfcinB15-Magl2的编码基因，将编码基因正反链分四条多核苷酸链合成，退火连接后，成功获得了杂合肽LfdnB15-Magl2的编码基因。本研究利用基因工程方法在大肠杆菌中成功表达了LfcinB15-Mag12，为基因工程方法规模化生产杂合肽及其它贵重肽类奠定了理论与实践基础，对建立肽类基因工程菌和抗菌肽研究的共性技术具有重要意义。(四)图1为本发明抑菌图；图2为本发明的工艺流程图3为纯化的合成LfcinB15-Mag12编码基因示意图，其中1为DNA分子量标准，2为纯化的用于构建pET-32a-LfcinB15-Mag12的LfcinB15-Mag12基因；图4为PCR方法筛选阳性重组质粒pET-32a与pET-32a-LfcinB15-Mag12示意图，1为DNA分子量标准，2为pET-32a空白对照为模板的PCR扩增产物，3为以含有pET-32a-LfcinB15-Mag12菌落为模板的PCR扩增产物；图5为pET-32a、pET-32a-LfcinB15-Mag12转化子表达产物SDS-PAGE分析示意图，1为蛋白质分子量标准，2为pET-32a转化子表达产物，3为未诱导的pET-32a-LfcinB15-Mag12转化子诱导表达产物，4为pET-32a-LfcinB15-Mag12转化子诱导表达产物。(五)具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明结合图2，本实施例采取的技术路线为1.在合成的LfcinB15-Mag12编码基因片段两端直接引入粘性末端，连接入表达载体pET-32a，构建表达载体pET-32a-LfcinB15-Magl2;2.将表达载体pET-32a-LfcinB15-Mag12转化表达宿主￡.co//BL21(DE3)，O.lmmol/LIPTG、3(TC诱导3h，产生与预期分子量为23.9kD的特异诱导表达条带；3.对最佳诱导条件进行优化，在确定的最佳诱导条件下，既当菌体密度达到0060()=0.6时开始诱导，0.3mmol/LIPTG、30'C诱导4h，融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的22%;4.经NTA-亲和层析柱纯化回收融合蛋白Trx-S-His-LfcinB15-Mag12，纯度达到95%以上，平均每升诱导细菌培养物仅获得19mg融合蛋白；65.按照酶蛋白质量比为1:100的比例利用肠激酶裂解融合蛋白Trx-S-His-LfcinB15-Magl2，23°C6h即可实现完全裂解，经截留分子量为5kDa的超滤管超滤后得到较纯的杂合肽LfcinB15-Magl2，平均每升诱导细菌培养物获得LfcinB15-Magl2200iag;6.利用薄层平皿琼脂糖纸片扩散法检测重组杂合肽LfcinB15-Mag12的抑菌活性。本实施例的具体实现过程1、LfcinB15-Mag12基因编码的合成根据￡.￡^//密码子偏爱性(如表1所示，Grojean等，1982;Hale等，1998)设计编码LfcinB1-15个氨基酸的活性基因片段和Magainin(1-12)的活性基因片段，为表达重组LfcinB15-Mag12，利用表达载体pET-32a构建重组表达载体pET-32a-LfcinB15-Mag12，在pET-32a的多克隆位点前存在编码6个组氨酸标签的密码子，因此在pET-32a-LfcinB15-Magl2中，将编码LfdnB15-Mag1227个氨基酸的基因片段克隆在编码组氨酸标签的密码子后、限制性内切酶SalI、Ncol识别位点密码子之间。同时加入终止密码子TAG、TAA。为便于直接克隆入经双酶切处理的pET-32a中，直接将酶切位点的粘末端设计入LfcinB15-Mag12基因中，即在LfcinB15-Mag12基因的上游及下游分别加入限制性内切酶SalI、NcoI识别位点经酶切后的片段。分四段合成序列如下CGGGTATCG-3，片段2:5，-GTAAATTCCTGCACTCTGCTAAAAAATTCTAGTAAG誦3，片段3:5，-rCG4CTTACTAGAATTTTTTAGCAGAGTGCAGGAATTTACCGATACCCGCACCCAGTTT-3，片段4:5'陽TTTCCAACGCCACTGCCAACGGCGGCATTTGAAAGC陽3'下划线部分是加入的终止密码子TAG、TAA，斜体部分是限制内切酶SalI、NcoI识别序列，其余部分是牛乳铁蛋白-马盖宁杂合肽基因。表1密码子在co//的使用频率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>ValGTG0.00ThrACT0.49GinCAG1.00ValGTA0.35ThrACC0.51GinCAA0.00ValGTT0.65TrpTGG1.00HisCAT0.23ValGTC0.00EndTGA-HisCAC0.77AlaGCG0.19CysTGT0.30LeuCTG1.00AlaGCA0.29CysTGC0.70LeuCTA0.00AlaGCT0.52EndTAG-LeuCTT0.00AlaGCC0.00EndTAA续表l-LeuCTC0.00密码子使用频率密码子使用频率密码子使用频率ArgAGC0.00TyrTAT0.18ProCCG0.87ArgAGA0.00TyrTAC0.82ProCCA0.13SerAGT0.00LeuTTG0.00ProCCT0.00SerAGC0.17LeuTTA0.00ProCCC0.00LysAAG0.18PheTTT0.17LysAAA0.82PheTTC0.831.1、多核苷酸片段2和4的5'端磷酸化化学合成的多核苷酸片段，其5'端为-OH形式，要进行磷酸化处理后才能进行连接反应，T4多核苷酸激酶在ATP存在的条件下，能够将ATP的Y-磷酸基团转移到核苷酸片段的5'端，替换-OH。反应体系基因片段2或410pL10xT4多核苷酸激酶buffer5pLATP脚LT4多核苷酸激酶2pL(20单位)水23fiL总体积50pL水浴37°Clh，65°C20min灭活T4多核苷酸激酶活性。1.2、多核苷酸片段退火与连接反应体系基因片段2磷酸化反应体系溶液10pL基因片段4磷酸化反应体系溶液10pL基因片段l5pL基因片段35pL3mol/LNaCl溶液4pL水6|aL8总体积40nL上述反应体系95"C变性5min，自然降至4(TC，维持2h，加入10x连接酶缓冲液5pL，T4DNA连接酶0.2pL(2单位)，H20补足50pL，16'C连接过夜1.3、LfcinB15-Magl2编码基因的回收1)将多核苷酸片段退火与连接的产物进行2.5%凝胶电泳，利用Qiagen凝胶回收试剂盒回收，按照试剂盒操作手册进行；2)紫外灯下切下含有目的DNA片段的凝胶块，使它尽可能的小，放入预先称重的1.5mL离心管中；3)再次称量装有凝胶块的离心管，计算凝胶块的质量，按每100mg凝胶块加入600nL的比例加入溶胶液，50。C水浴10min，使琼脂糖胶块完全溶解，每2min混匀一次；4)按每100mg凝胶块加入lOOpL的比例加入异丙醇，混匀；5)将凝胶液移入吸附柱，离心lmin，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中；6)在吸附柱中加入75(^L洗涤液，静置2min，离心lmin，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；7)离心lmin，尽量除去洗涤液；8)将吸附柱放入一干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入30-50^iL洗脱液，静置lmin后，离心lmin，将1.5mL离心管(含有DNA)储存于一20。C备用。2、重组载体的构建2.1、质粒pET-32a的酶切处理Sall、和NcoI酶切质粒pET-32a反应体系质粒pET-32a2吗10xSalIbuffer5pLNcollnL(20单位)SalIlpL(20单位)水37(iL总体积50pL37。C水浴3h，65°C20min灭活酶活性。2.2、线性质粒pET-32a的纯化回收将质粒pET-32a的酶切处理反应体系进行0.8%凝胶电泳，按照2.2丄4方法纯化回收线性质粒pET-32a，-2(TC保存备用。2.3、感受态EcoZ/的制备1)取冰冻保存宿主菌，用接种环接种至斜面，复活培养2代，然后挑取单个菌落，转到含有50mL的LB培养基的250mL的三角瓶中，于37。C震荡培养过夜。2)取500nL菌液转接入新鲜的50mLLB培养基中，待菌体密度生长至OD600=0.4时，将菌液转移至一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50mL聚丙烯管中，在冰上放置IO分钟。3)4t:以4100转/min离心10min,回收细胞。4)倒出培养液，将管倒置lmin，以使最后的痕量培养液流尽。5)每50mL初始培养液用30mL预冷的O.lmol/LMgCl2-CaCl2溶液(80mmol/LMgCl2，20mmol/LCaCl2)重悬每份细胞沉淀。6)4°C4100转/min离心10min，回收细胞。7)倒出培养液，将管倒置lmin以使最后的痕量培养液流尽。8)每50mL初始培养物用2mL冰预冷的O.lmol/LCaCl2重悬，备用。2.4、LfcinB15-Mag12编码基因与质粒pET-32a连接及转化LfcinB编码基因与质粒pET-32a的连接体系10x连接酶bufferl^il基因片段1^1(10ng)质粒pET-32a2pl(100ng)T4DNA连接酶0.1H205舉总体积10pL16。C连接过夜，转化Eco"BL21(DE3)。1)用预冷的无菌吸头从每份用CaCl2溶液制备的感受态细胞悬液中吸取200pL转移到无菌离心管中，每管加入DNA(用量不超过10pl的体积，其中的DNA小于50ng)，轻轻旋转以混匀内容物，在冰上放置30min;2)将管放入预加温至42'C的循环水浴中，恰恰放置90s，不要摇动管；3)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2min;4)每管加80(^1SOC培养基，用水浴将培养基加温至37°C，然后将管转移到摇床上，37°C温浴45min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素标记基因；5)将适当体积(每90mm平板达20(^1)以转化的感受态细胞转移至含20mmol/LMgSO4和lOOpg/mL氨卞青霉素的LB琼脂培养基上；6)将平板置于室温至液体被吸收，倒置平板，于37。C培养12-16h。2.5、PCR方法筛选阳性克隆所用引物-Primer1:5'-GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG隱3'，Primer2:5'-CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG-3'，反应体系、2+、10xbuffer(Mg'十)Primer1Primer2dNTP(2.5mmol/L)TaqDNApolymeraseH20总体积2nL0单O.叫0单0单16单20iaL无菌牙签调挑取阳性菌落，在上述反应体系溶液中轻微转动数次，同时以不加入菌落、含有pGEX-4T-2的菌落为模板分别作为阴性、阳性对照，进行PCR扩增，反应条件94°C预变性95。C58°C72°C72°C4°Cmm变性30s退火30s延伸1min延伸5min5min32cyclesPCR扩增产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳检测，阳性克隆进一步测序验证。2.6、SDS碱裂解法小量提取质粒原理碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋DNA结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭和环状的两条互补链又不完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物一起沉淀下来而被除去。试验步骤1)挑取含有目的阳性克隆的单菌落，接种到2mL含有100^ig/mLAmp的LB培养液中，11于37'C震荡培养过夜；2)取lmL培养物于1.5mL离心管中，用微量离心机于4'C最大转速离心30s，将剩余的培养物贮存于4'C，离心后尽可能吸干培养液；3)将细菌沉淀重悬于100nL冰预冷的碱裂解液I中，剧烈震荡；4)加200pL新配置的碱裂解液I1，于每管细菌悬液中，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物，切勿震荡，将离心管放置于冰上；5)4。C离心5min，取上清；6)用2倍体积的无水乙醇于室温沉淀核酸，震荡混合，于室温放置2min;7)4'C离心5min，收集沉淀的核酸；8)小心吸出上清液，将离心管倒置于纸巾上，以使所有液体的液体流出排干，用一次性吸头除去管壁上的液滴；9)加lmL70Q/。乙醇于沉淀中并将盖紧的试管颠倒数次，4。C离心2min，回收DNA，回收沉淀；10)除去管壁上的酒精液滴，将开口的试管放置于室温使酒精挥发，直至试管内无可见的液体存在；11)用5(HiL含有去DNA酶的RNA酶A(胰RNA酶)(20ng/mL)的TE重新溶解核酸，温和震荡几秒钟，贮存于-2(TC。3、融合蛋白的表达及诱导条件的优化3.1、融合蛋白的IPTG诱导表达1)重组质粒按照2.4方法转化E.coliBL21(DE3);2)将转化菌落接种于5mL含100pg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，并在LB/氨节青霉素斜面上画线，同时接种含母本pET-32a载体的转化菌作对照。将斜面培养基于37。C下培养12小时后于4'C保存，液体培养物则于37'C摇床中震荡培养过夜；3)吸取500pL菌液转接入50mL含100pg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37"C摇床培养至OD600=0.6左右，加入100mmol/LIPTG至终浓度0.1mmol/L，30。C诱导3小时；4)取lmL菌液，12000转/min高速离心15s，弃上清；5)加入lOO^iL冰预冷的PBS，吹打均匀，吸取5(aL于另一只离心管中，待SDS-PAGE分析。3.2、SDS-PAGE分析原理生物大分子尤其是蛋白质具有不同的电荷和分子量。在经过阴离子去污剂SDS处理后，蛋白质分子上的电荷被中和，在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，不同的蛋白质按照其分子量大小进行分布，电泳迁移率仅取决于蛋白质的分子量。聚丙烯酰胺凝胶电泳由丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺，在催化剂的作用下，形成三维网状结构。凝胶电泳不仅具有分子筛作用，还有浓縮效应。由于不连续pH梯度作用，样品被压縮成一条狭窄区带，从而提髙了分离效果。采用考马斯亮蓝快速染色，可及时观察电泳分离效果。实验步骤1)将玻璃板洗涤千净，固定于电泳槽上；2)按表2的配方配制15%分离胶，将分离胶注入玻璃夹层中，上部用少量水封面，保持胶面平整，待分离胶聚合后，配制浓縮胶；表2不同浓度分离胶配方<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>4)样品处理:将待分析鉴定的蛋白质样品，加入等体积的2xSDS-PAGE样品处理液，10(TC水浴3-5min,冰浴冷却；5)加样将电泳槽加入电泳缓冲液，小心拔去点样梳，然后用注射器吹打加样孔。将样品高速离心后，用微量加样器分别吸取分析样品，根据蛋白浓度和加样孔体积决定加样量；6)起始用低电压40V恒压电泳，待溴酚蓝指示剂在浓縮胶部分浓縮成一条线后，120V电泳，待溴酚蓝指示剂到达底部边缘时停止电泳；7)染色轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，切角做标记，置于考马斯亮蓝R-250染色液中，染色过夜；8)脱色液脱色至背景干净，条带清晰。3.3、诱导条件的优化3.3.1、诱导剂IPTG最佳浓度的确定将转化菌落接种于5mL含100pg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37'C摇床中震荡培养过夜，向7支装有50mL含lOO^g/mL氨苄青霉素的LB培养基的250mL三角瓶中各加入500nL菌液，37'C摇床培养至OD6(xr0.6左右，向不同三角瓶中加入100mmol/LIPTG至终浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0mmol/L，30。C诱导3小时；取样5pL，SDS-PAGE分析。3.3.2、最佳诱导时间的确定将转化菌落接种于5mL含100|ig/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37'C摇床中震荡培养过夜，向5支装有50mL含100叱/mL氨苄青霉素的LB培养基的250mL三角瓶中各加入500nL菌液，待菌体浓度分别生长至OD600-0.6，加入100mmol/LIPTG至终浓度0.3mmol/L，30°C分别诱导0.5、1、3、5、7h,取样5pL，SDS-PAGE分析。3.4、蛋白质印迹分析原理经过SDS-PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体反应，经过底物显色或放射自显影以检査电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。本试验采用的His抗体直接偶连了辣根过氧化物酶，经过一歩抗原抗体反应就直接可以利用3，3'-二氨基苯胺进行显色反应。3.4.1、蛋白质的电转移1)将诱导表达蛋白样品进行SDS-PAGE电泳；2)打开转移盒并放置在浅盘中，用转移缓冲液将海绵垫完全浸透后，将其放置在转移盒壁上，海绵上再放一张3MMWhatman滤纸，放置凝胶，用一试管或玻璃棒在凝胶表面缓慢移动，以排去凝胶和滤纸间的气泡；3)准备转移膜，按凝胶大小但各边都比凝胶大约lmm剪PVDF膜，成45度慢慢将膜放入蒸馏水中，水会渗进膜中并湿润整个表面，然后在转移缓冲液中平衡15min;4)用转移缓冲液冲洗凝胶表面，直接将已湿润的膜放在凝胶顶部，排去气泡；5)湿润另一张3MMWhatman滤纸，并置于膜的阳极面，排去所有气泡，在滤纸的顶部放另一块己用转移缓冲液细润的海绵；6)组装好转移盒，纤维素膜侧靠正极，胶侧靠负极，加缓冲液，连接电源，横压100V14转移lh;3.4.2、表达蛋白质的免疫印迹检湖IJ-Westernblot检测1)将PVDF膜放入一平皿中加入封闭液(其量以浸过膜即可)，用4%脱脂乳封闭液进行封闭，37'C2h,弃反应液；2)TBST洗涤膜两次；3)TBST1:5000稀释抗体，将膜放入一塑料袋中，按每平方厘米加入O.lmL抗体稀释液，封闭lh;4)TBST洗膜2次，每次5min;5)TBS洗膜2次，每次5min;6)将膜放入发色底物显迹液，条带在10-30min内出现，蒸馏水洗膜，终止反应，凉干。4、融合蛋白的纯化4.1、五.co/Z的裂解1)将含有阳性重组子pET-32a-LfcinB15-Mal2的E.coliBL21(DE3)，分别接种于含100吗/mLAmp的LB液体培养基中，37'C摇床培养过夜；2)分别取上述过夜培养物0.5mL接种于新鲜的LB(含lOO^ig/mLAmp)液体培养基中；3)37i:振荡培养3h左右至OD60(^0.6，力t]10O腿ol/LIPTG至终浓度为0.3mmol/L，30°C继续培养3h;4)加入1/20细胞生长体积的GuNTA-0Buffer(20mMTris-HClpH7.9，0.5MNaCl，10%Glycerol,6MGuanidiumHC1)禾卩PMSF。PMSF用无水乙醇配制成200mM储存液，-20度或4度保存；PMSF使用的工作浓度位lmM;注意PMSF见水分解，需要在使用前加入。5)将细胞悬浮起来，冰上超声破碎细胞，降低粘稠度。6)室温放置30分钟，间或混匀或用磁力搅拌。7)15000转/分(20，000xg以上)，4度离心15分钟以上。取上清，置于冰上备用或-20度保存。4.2、融合蛋白的亲和层析纯化及洗脱1)亲和层析纯化融合蛋白(1)将NTA树脂装入合适的层析柱(QIAgene)，层析用10倍NTA体积的GuNTA-0Buffer洗。(2)将样品加到NTA层析柱中，流速控制在15mL/小时左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况。(3)层析用5倍NTA体积的GuNTA-0Buffer洗，流速控制在30mL/小时左右。15(4)分别用5倍NTA体积GuNTA-20，GuNTA-40，GuNTA-60，GuNTA-lOO，GuNTA-500洗脱，流速控制在15mL/小时左右，收集洗脱液，每管收集一个NTA体积。(5)15y。浓度的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE检测。2)NTA树脂的再生NTA树脂在使用若千次数(3-5次)后，结合效率有所下降，可以用以下方法再生，提高树脂的使用寿命和蛋白质的结合效率。NTA树脂再生前需要从层析柱下端流干所有溶液，估计出NTA的树脂体积，按下列次序将再生试剂加到层析柱里，在等上一再生溶液流干后，再加下一再生溶解。需要自行准备25%，50%，75%，100%(Wv)乙醇和去离子水。NTA再生步骤(1)从层析柱下端流干所有溶液，用2倍NTA树脂体积的StrippingSolutionI洗。(2)用2倍体积的去离子水洗。(3)用3倍体积的StrippingSolutionII洗。(4)用1倍体积的25%乙醇洗。(5)用1倍体积的50%乙醇洗。(6)用1倍体积的75%乙醇洗。(7)用5倍体积的100%乙醇洗。(8)用1倍体积的75%乙醇洗。(9)用1倍体积的50%乙醇洗。(10)用1倍体积的25%乙醇洗。(11)用l倍体积的去离子水洗。(12)用5倍体积的StrippingSolutionIII洗。(13)用3倍体积的去离子水洗。(14)如果立即使用，用5倍体积的NiChargingSolution洗，再用10倍体积的平衡溶液(NTA-0Buffer或GuNTA-0Buffer)洗。(15)如果想长期储存，加入1倍体积的20%乙醇，4度保存，使用前需要执行步骤14。3)透析膜的处理(1)戴手套把透析膜剪成适当长度，蒸馏水中浸泡15min;(2)浸入10mmol/L碳酸氢钠溶液中，加熱至80°C，一边搅拌至少30min;(3)换到10mmol/LNa2'EDTA中浸泡30min，以新鲜的EDTA同样方法处理三次；(4)再用8(TC洗蒸馏水30min，然后换到20%酒精中，4'C保存备用。4.3、洗脱蛋白的透析与浓縮(1)将透析袋用蒸馏水冲洗干净，透析袋夹将一端夹紧，装入5mL洗脱的蛋白样品，排尽空气，透析袋夹夹紧另一端；(2)放入500mL蒸馏水中，磁力搅拌器搅拌4'C透析lh;G)洗脱的ms-LfcinB15-Mag12放入500mLPBS中，磁力搅拌器搅拌4""C透析4h;(4)更换新鲜的缓冲液，继续透析4h;(5)将透析袋放入小烧杯中，包埋于SephadexG-200中，4"C浓缩至适当体积；(6)取样5pL进行SDS-PAGE,分析测定蛋白纯度与亲和层析效果。4.3.1、Bradford法测定蛋白浓度原理考马斯亮蓝G-250是一种蛋白质染料，在酸性条件下呈棕红色，当它所含的疏水性基团与蛋白质通过疏水作用结合后，变为蓝色，该蓝色与蛋白质浓度呈正比。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合后，光吸收峰由465nm转移到595nm。该法测定蛋白质浓度不但灵敏度高，而且测定的浓度范围也较广，实用方便。本法可测定蛋白质范围是l(^g/mL-1.0mg/mL。(1)标准曲线的制作①取4pLBSA蛋白标准品加PBS稀释至100pL，使其终浓度为200將/mL;②取该稀释后的标准品按l、2、4、6、8、10、15|iL分别加到96孔酶标板样品孔中，加PBS补足到20pL，每孔蛋白含量分别为O、0.2、0.4、0.8、U、1.6、2.0、3.0吗，③各孔加入200iiLBradford试剂，浑匀，室温放置5min，④用预热的酶标仪测定A595的吸光值，绘制标准曲线。(2)洗脱蛋白浓度的测定①在配置用于制作标准曲线样品的同时，取适当体积的洗脱蛋白His-LfcinB15-Magi2%孔酶标板样品孔中，加PBS加PBS补足到20pL，②各孔加入20(^LBradford试剂，浑匀，室温放置5min，③用预热的酶标仪测定A595的吸光值，根据标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。5、融合蛋白的裂解与LfcinB15-Mag12的纯化5丄肠激酶裂解融合蛋白Trx-S-His-LfcinB15-Magi2100pLlmg/mL融合蛋白LfcinB15-Mag12中加入1,5pgEnterokinase，加入10x缓冲液10pL，23t:温浴反应，在6h取样5pL，与5fiL2xTricine-SDS样品缓冲液混匀，-20°(:冷冻，待尿素-Tricine-SDS-PAGE分析。5.2、超滤法纯化LfcinBi5-Mag121)利用Enterokinase按照使用说明裂解融合蛋白Trx-S-His-LfcinB15-Mag12，22"C温浴6h;172)将上述反应液装入截留分子量为5kDa的超滤管中，12000转/min4'C离心30min;3)取样按照4.3.1测定蛋白浓度；4)收集滤过液，-20卩保存备用。5.3、尿素-Tricine-SDS-PAGE分析表4尿素-Tricine-SDS-PAGE凝胶配方分离胶间隔胶浓縮胶49.5%(C=6%)凝胶!C液(mL)3,3--49.5%(C=3%)凝胶贮液(mL)-0.600.45凝胶缓冲液(pH8.5)(mL)3.31.01.4尿素(g)3.6--H201.01.401.910%APS(nL)452037.5TEMED(nL)4,5203.751)按表4配方配置凝胶，配置方法与步骤同3.2;2)在样品中加入等体积的2xTrincine样品缓冲液，沸水煮5min，冷却后高速离心，参照3.2进行电泳；3)考马斯亮蓝R-250染色，42°Clh，脱色液脱色至背景清晰(SchaggerandvonJagow，1987;Strom等，1992，1993)6、LfcinB15-Mag12的活性鉴定1)将斜面保存的金黄色葡萄球菌S.aureasATCC25923接种于5mLLB培养基中，37°C摇床培养过夜；2)取培养物0.5mL转接入新鲜的50mLLB中，37。C继续培养2.5h至对数生长中期；3)取5mL菌液，4'C4100转/min离心10min收集菌体；4)PBS重悬菌体，4°C4100转/min离心10min收集菌体；5)加入PBS重悬菌体，调整OD620至0.2左右，此时细菌浓度约为5><107CFU/mL;6)事先准备好灭菌的42'C的低熔点琼脂糖LB培养基，向10mL该培养基中加入取上述菌液50nL(含2.5x106CFU，，立即轻轻混匀，到入90mmxl5mm平板中，此时平板厚度约为lmms7)待培养基凝固后，用直径为3mm的无菌滤纸片2片浸润LfcinB15-Mag12溶液贴于平板上，1片浸润PBS作为对照；8)将平板正面向上37t:培养lh后，倒置继续培养18h，观察抑菌效果。7、多核苷酸的磷酸化、退火、连接及编码基因的纯化18采用固相合成法合成的多核苷酸其3'端为羟基形式，在退火与连接前，先经T4多核苷酸激酶作用使其磷酸化，退火后片段1与2、片段3与4间的缺口经T4DNA连接酶连接，形成完整的编码LfcinB15-Magl2的基因片段，为95bp，经2.5%凝胶电泳、纯化试剂盒回收后，分别得到纯化的基因片段(如图3中2所示)。8、PCR筛选重组表达载体pET-32a的5'与3'通用测序引物分别与pET-32a的57U20、327L20的碱基互补，以该对测序引物筛选重组质粒，2.5%凝胶电泳后，如图4所示，阳性对照，即以含有质粒pET-32a的菌落为模板的PCR产物为270bp的DNA条带，而阳性重组质粒pET-32a-LfcinB15-Mag12扩增产物分别为370bp左右的DNA条带，说明在重组质粒中已连接入目的片段。9、融合蛋白的表达及诱导条件的优化9.1、pET-32a-LfcinB15-Mag12初步诱导表达SDS-PAGE分析用SDS-PAGE鉴定，结果pET-32a-LfcinB15-Mag12转化子分别产生一条大约24kDa特异的蛋白带，与预期蛋白(20.4+3.57KD)大小一致，诱导3h的阴性性对照的非重组pET-32a转化子产生20.4KD条带，而未经IPTG诱导的质粒菌的培养物样品无特异诱导条带出现(图5所示)。10、结论1.本发明根据大肠杆菌密码子偏爱性，采用人工合成的方法，首次设计、合成了抗菌肽LfcinB15-mag12的编码基因2.将合成LfcinB15-mag12的编码基因连接入表达载体pET-32a，构建表达载体pET-32a-LfcinB15-mag12，以E.coliBL(DE3)为表达宿主，经IPTG诱导，经蛋白质印迹分析表明，分子量为24kDa的诱导条带为TRX融合蛋白，证明融合蛋白Trx-S-His-LfcinB15-Mag12成功获得表达，在确定的最佳诱导条件下，融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的22%。3.经亲和层析柱纯化回收融合蛋白，纯度较高，达到95%以上，但产量较低，平均每升诱导细菌培养物仅获得19mg融合蛋白。4.融合蛋白Trx-S-His-LfcinB15-Mag12经Enterokinase作用后，得到具有抑菌活性的重组抗菌肽LfcinB15-Mag12，首次成功实现了杂合肽LfcinB15-Mag12的异源表达，平均每升诱导细菌培养物获得LfcinB15-Mag12200吗，为基因工程方法生产杂合肽LfcinB15-Mag12及其它贵重肽类奠定了理论与实践基础，对建立肽类基因工程菌和抗菌肽研究的共性技术具有重要意义。序列表ggggggggaacattccctctagaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatat60gagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcgga120cggggcgatcctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgcccc180gattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacat240cgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactctgctgct300gttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaa360agagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatca420tcattcttctggtctggtgccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaatt480cgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccatg538ttcaaatgccgtcgttggcagtggcgttgganaaaactgggtgcgggtatePheLysCysArgArgTrpGinTrpArgTrpLysLysLeuGlyAlaGlylieggtaaattcctgcactctgeta犯aaattctagt加GlyLysPheLeuHisSerAlaLysLysPhetcgacaagcttgcggccgcactcgagcaccaccaccaccaccactgagatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataqctagcataaccccttggggcetctaaaegggtcttgaggggttttttgetgaaaggaggaactatatccggattggcgaatgggacgegeectgtageggegcattaagegcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtc肌gctct肌atcgggggctccctttaggg编码LfcinB1-15个氨基酸的活性基因片段和Magainin(1-12)的活性基因片段，为表达重组LfcinB15-Mag12正链CATG，TCGA为粘性末端，扩号内为合成的F1，TAGTAA为终止密码子。红色序列为LfcinB.CalgttcaaatgccgtcgttggcagtggcgttggaaaaaaPheiLysCysArgArgTrp6GinTrpArgTrpLys"LysctgggtgcgggtateggtaaattcctgcactctgetaaaaaaLeuGlyAlaGlyi6lieGlyLysPheLeu2iHisSerAlaLysLys26ttctagtaaPhe反链TTCCAACGCCACTGCCAACGACGGCATTTGAA编码的一段氨基酸序列为LfcinB(1-15)和Magainin(1-12)PheLysCysArgArgTrpGinTrpArgTrpLysLysLeuGlyAlaGlylieGlyLysPheLeuHisSerAlaLysLysPhe权利要求1、一种LfcinB15-Mag12编码基因的合成方法，其特征在于根据E.coli密码子偏爱性设计编码LfcinB1-15个氨基酸的活性基因片段和Magainin(1-12)的活性基因片段，利用表达载体pET-32a构建重组表达载体pET-32a-LfcinB15-Mag12，在pET-32a的多克隆位点前存在编码6个组氨酸标签的密码子，在pET-32a-LfcinB15-Mag12中，将编码LfcinB15-Mag1227个氨基酸的基因片段克隆在编码组氨酸标签的密码子后、限制性内切酶SalI、NcoI识别位点密码子之间，同时加入终止密码子TAG、TAA，分四段合成序列如下片段15’-CATGGCTTTCAAATGCCGCCGTTGGCAGTGGCGTTGGAAAAAACTGGGTGCGGGTATCG-3’片段25’-GTAAATTCCTGCACTCTGCTAAAAAATTC<u>TAGTAA</u>G-3’片段35’-TCGAC<u>TTACTA</u>GAATTTTTTAGCAGAGTGCAGGAATTTACCGATACCCGCACCCAGTTT-3’片段45’-TTTCCAACGCCACTGCCAACGGCGGCATTTGAAAGC-3’下划线部分是加入的终止密码子TAG、TAA，斜体部分是限制内切酶SalI、NcoI识别序列，其余部分是牛乳铁蛋白-马盖宁杂合肽基因。2、根据权利要求l所述的LfcinB15-Magl2编码基因的合成方法，其特征在于所述的直接克隆入经双酶切处理的pET-32a过程中，直接将酶切位点的粘末端设计入LfcinB15-Mag12基因中，即在LfcinB15-Mag12基因的上游及下游分别加入限制性内切酶SalI、NcoI识别位点经酶切后的片段。3、根据权利要求1所述的LfcinB15-Mag12编码基因在大肠杆菌中表达的方法，其特征在于(1)在合成的LfcinB15-Mag12编码基因片段两端直接引入粘性末端，连接入表达载体pET-32a，构建表达载体pET-32a-LfcinB15-Magl2;(2)将表达载体pET-32a-LfcinB15-Mag12转化表达宿主五.co/ZBL21(DE3)，0.1mmol/LIPTG、30'C诱导3h，产生与预期分子量为23.9kD的特异诱导表达条带；G)对最佳诱导条件进行优化，在确定的最佳诱导条件下，既当菌体密度达到OD600=0.6时开始诱导，0.3mmol/LIPTG、30'C诱导4h，融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的22%;(4)经NTA-亲和层析柱纯化回收融合蛋白Trx-S-His-LfcinB15-Mag12，纯度达到95%以上，平均每升诱导细菌培养物仅获得19mg融合蛋白；(5)按照酶蛋白质量比为l:IOO的比例利用肠激酶裂解融合蛋白Trx-S-His-LfcinB15-Mag12，23。C6h即可实现完全裂解，经截留分子量为5kDa的超滤管超滤后得到较纯的杂合肽LfcinB15-Magl2，平均每升诱导细菌培养物获得LfcinB15-Magl2200ng;(6)利用薄层平皿琼脂糖纸片扩散法检测重组杂合肽LfcinB15-Mag12的抑菌活性。全文摘要本发明提供了一种LfcinB15-Mag12编码基因的合成及在大肠杆菌中表达的方法，根据E.coli密码子偏爱性设计编码LfcinB1-15个氨基酸的活性基因片段和Magainin(1-12)的活性基因片段，利用表达载体pET-32a构建重组表达载体pET-32a-LfcinB15-Mag12，在pET-32a的多克隆位点前存在编码6个组氨酸标签的密码子，同时加入终止密码子TAG、TAA。本发明利用基因工程方法在大肠杆菌中成功表达了LfcinB15-Mag12，为基因工程方法规模化生产杂合肽及其它贵重肽类奠定了理论与实践基础，对建立肽类基因工程菌和抗菌肽研究的共性技术具有重要意义。文档编号C12N15/62GK101509007SQ20081020966公开日2009年8月19日申请日期2008年12月10日优先权日2008年12月10日发明者单安山,毕重鹏,鹏高申请人:东北农业大学