专利名称：：德国镜鲤杂交优势种群的筛选方法
技术领域：
：本发明涉及一种鲤鱼杂交优势种群的筛选方法。
背景技术：
：德国镜鲤(C>/n>msc^p/oL.mirror)是欧洲野鲤家养后因鳞被基因突变而分离出来的，再经人工培育形成的鲤鱼品种。1984年由联邦德国引入我国，并由中国水产科学研究院黑龙江水产研究所多年选育到F4代，已经适应了我国的养殖条件，并继续表现其生长快的特性，已成为适合我国北方养殖的优良品种，被国家原种和良种审定委员会认定为国家级良种。但由于德国镜鲤选育系(F4)是早在1995年选育完成的，且只选育到了第4代，所以某些遗传性状还不够稳定(如体形、鳞被和抗病力等)；加之20多年来德国镜鲤选育系(F4)在全国各地养殖，已各自形成了独立的繁殖群体，其群体种质、遗传结构、生产性能等与F4代相比可能有不同程度的改变；所以，现有不同德国镜鲤种群间的差异性难以衡量。遗传多样性是每种生物所固有的特性，它是长期适应环境与进化的产物，遗传多样性越高则意味着适应生存能力越强，所蕴涵的育种和遗传改良能力也就越强，也就是说差别越大的群体间杂交所产生的杂种优势越大。选用种群差异性大的群体进行杂交可以减少工作量、縮短育种年限、降低育种成本和提高选育成功率；但是，如何从众多的德国镜鲤种群中筛选出杂交优势种群、确保其杂种的遗传多样性，目前尚没有行之有效的方法。
发明内容本发明的目的是为了提供一种行之有效的德国镜鲤杂交优势种群的筛选方法，以确保其杂种的遗传多样性，从而可以减少工作量、縮短育种年限、降低育种成本和提高选育成功率。德国镜鲤杂交优势种群按以下步骤进行筛选a、形态标记对各种群随机选出的德国镜鲤的可量性状和可数形状进行标记；b、再进行微卫星分子标记(l)DNA的提取与纯化；(2)RCR扩增；(3)产物检测；(4)数据处理；c、数据分析，选择种群差异性大的作为德国镜鲤杂交优势种群。本发明步骤a中可量性状包括体重、全长、体长、体高、头长、头高、尾柄长、尾柄高、吻长、眼径和眼间距。步骤a中可数形状包括左侧线上鳞、左侧线侧鳞、左侧线下鳞、右侧线上鳞、右侧线侧鳞和右侧线下鳞。本发明步骤b(2)中RCR扩增反应体系为25pL:水14jiL、10xPCRbuffer2.5pL、10mmol/L4xdNTPs2pL、2.0mmol/LMgCl21.5pL、lOpmol/pL上下游引物各lpL、T^DNA聚合酶1U和50ng/piLDNA模板lpL;RCR扩增引物为MFW1、MFW2、MFW3、MFW4、MFW5、MFW9、MFW7、MFWll、MFW14、MFW16、MFW19、MFW20MFW24、MFW29和MFW30;引物MFW1中上游引物MFW1F的序歹U为GTCCAGACTGTCATCAGGAG，下游引物MFW1R的序列为GAGGTGTACACTGAGTCACGC，PCR反应条件为95。C预变性5min，94°C变性30s、63.7退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW2中上游引物MFW2F的序列为CACACCGGGCTACTGCAGAG,下游引物MFW2R的序列为GTGCAGTGCAGGCAGTTTGC，PCR反应条件为95'C预变性5min，94'C变性30s、60。C退火30s、72"C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW3中上游引物MFW3F的序列为GATCAGAAGGTACAGAGAAG,下游引物MFW3R的序列为CCTTACAGAAAACCTGTTTGC，PCR反应条件为95""C预变性5min，94°C变性30s、53。C退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW4中上游引物MFW4F的序列为TCCAAGTCAGTTTAATCACCG,下游引物MFW4R的序列为GGGAAGCGTTGACAACAAGC，PCR反应条件为95°C预变性5min，94。C变性30s、60.5。C退火30s、72X:延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW5中上游引物MFW5F的序列为GAGATGCCTGGGGAAGTCAC，下游引物MFW5R的序列为AAAGAGAGCGGGGTAAAGGAG,PCR反应条件为95。C预变性5min，94。C变性30s、62.9退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW7中上游引物MFW7F的序列为TACTTTGCTCAGGACGGATGC，下游引物MFW7R的序列为ATCACCTGCACATGGCCACTC，PCR反应条件为95。C预变性5min，94°C变性30s、61.5退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72'C延伸5min;引物MFW9中上游引物MFW9F的序列为GATCTGCAAGCATATCTGTCG,下游引物MFW9R的序列为ATCTGAACCTGCAGCTCCTC，PCR反应条件为95。C预变性5min，94。C变性30s、58。C退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW11中上游引物MFW11F的序列为GCATTTGCCTTGATGGTTGTG，下游引物MFW11R的序列为TCGTCTGGTTTAGAGTGCTGC,PCR反应条件为95。C预变性5min，94°C变性30s、58.7退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72*€延伸5min;引物MFW14中上游引物MFW14F的序列为CAGAAGCTTCTGGAAATCTGAG,下游引物MFW14R的序列为GCGAGAAGATTGATGGACAAC，PCR反应条件为95°C预变性5min,94"C变性30s、60.1退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW16中上游引物MFW16F的序列为GTCCATTGTGTCAAGATAGAG，下游引物MFW16R的序列为TCTTCATTTCAGGCTGCAAAG,PCR反应条件为95。C预变性5min，94°C变性30s、60.1退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW19中上游引物MFW19F的序列为CAATCCTCCATCATGCAAAC,下游引物MFW19R的序列为GCACAAACTCCACATTGTGCC,PCR反应条件为95'C预变性5min，94"C变性30s、58.4。C退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW20中上游引物MFW20F的序列为CAGTGAGACGATTACCTTGG，下游引物MFW20R的序列为GTGAGCAGCCCACATTGAAC，PCR反应条件为95°C预变性5min，94。C变性30s、56t:退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW24中上游引物MFW24F的序列为GCTCCAGATTGCACATTATAG，下游引物MFW24R的序列为CTACACACACGCAGAGCCTTTC，PCR反应条件为95。C预变性5min，94。C变性30s、60.1退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;弓|物MFW29中上游引物MFW29F的序列为CTACACACACGCAGAGCCTTTC，下游引物MFW29R的序列为GAAGCTTTGCTCTAATCCACG，'PCR反应条件为95°C预变性5min，94°C变性30s、61.6退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW30中上游引物MFW30F的序列为GGTCAACAAGTAGTTGTGCAG，下游引物MFW30R的序列为CCATCTCTGTCATTGCAACAG，PCR反应条件为95。C预变性5min，94°C变性30s、58.7退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min。本发明将形态标记与微卫星分子标记相结合筛选德国镜鲤杂交优势种群，种群伺遗传差异性双重验证，筛选结果更准确。图1是具体实施方式十中德国镜鲤三个种群外部形态特征量度指标的Cluster聚类图；图2是具体实施方式十中引物MFW7的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果图；图3是具体实施方式十中引物MFW24的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果图；图4是具体实施方式十中德国镜鲤三个种群遗传指标的UPGMA法聚类结果图。具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一本实施方式德国镜鲤杂交优势种群按以下步骤进行筛选a、形态标记对各种群随机选出的德国镜鲤的可量性状和可数形状进行标记；b、再进行微卫星分子标记(l)DNA的提取与纯化；(2)RCR扩增；(3)产物检测；(4)数据处理；c、数据分析，选择种群差异性大的作为德国镜鲤杂交优势种群。具体实施方式二本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤a中可量性状包括体重、全长、体长、体高、头长、头高、尾柄长、尾柄高、吻长、眼径和眼间距。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式三本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤a中可数形状包括左侧线上鳞、左侧线侧鳞、左侧线下鳞、右侧线上鳞、右侧线侧鳞和右侧线下鳞。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式四本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤b(l)中采用酚/氯仿法提取鳍条基因组DNA，纯化后定量至DNA浓度为50ng/nL。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式五本实施方式与具体实施方式一或四的不同点是步骤b(2)中RCR扩增反应体系为25mL:水14pL、10xPCRbuffer2.5pL、1Ommol/L4xdNTPs2pL、2.0mmol/LMgCl21.5pL、1Opmol/VL上下游引物各lpL、7Z^DNA聚合酶1U(2iliL)和50ng/VLDNA模板lpL;RCR扩增引物为MFW1、MFW2、MFW3、MFW4、MFW5、MFW9、MFW7、MFWll、MFW14、MFW16、MFW19、MFW20MFW24、MFW29和MFW30;引物MFW1中上游引物MFW1F的序列为GTCCAGACTGTCATCAGGAG，下游引物MFW1R的序列为GAGGTGTACACTGAGTCACGC，PCR反应条件为95。C预变性5min，94°C变性30s、63.7退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW2中上游引物MFW2F的序列为CACACCGGGCTACTGCAGAG,下游引物MFW2R的序列为GTGCAGTGCAGGCAGTTTGC，PCR反应条件为95°C预变性5min，94'C变性30s、6(TC退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW3中上游引物MFW3F的序歹lj为GATCAGAAGGTACAGAGAAG，下游引物MFW3R的序列为CCTTACAGAAAACCTGTTTGC，PCR反应条件为95。C预变性5min，94°C变性30s、53。C退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW4中上游引物MFW4F的序列为TCCAAGTCAGTTTAATCACCG,下游引物MFW4R的序列为GGGAAGCGTTGACAACAAGC，PCR反应条件为95。C预变性5min，94。C变性30s、60.5。C退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW5中上游弓l物MFW5F的序列为GAGATGCCTGGGGAAGTCAC，下游引物MFW5R的序列为AAAGAGAGCGGGGTAAAGGAG，PCR反应条件为95。C预变性5min，94。C变性30s、62.9退火30s、72'C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW7中上游引物MFW7F的序列为TACTTTGCTCAGGACGGATGC，下游引物MFW7R的序列为ATCACCTGCACATGGCCACTC,PCR反应条件为95。C预变性5min，94°C变性30s、61.5退火30s、72t:延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW9中上游引物MFW9F的序列为GATCTGCAAGCATATCTGTCG,下游引物MFW9R的序列为ATCTGAACCTGCAGCTCCTC，PCR反应条件为95""C预变性5min，94。C变性30s、58。C退火30s、72-C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW11中上游引物MFW11F的序列为GCATTTGCCTTGATGGTTGTG，下游引物MFW11R的序列为TCGTCTGGTTTAGAGTGCTGC，PCR反应条件为95。C预变性5min，94°C变性30s、58.7退火30s、72'C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW14中上游引物MFW14F的序列为CAGAAGCTTCTGGAAATCTGAG，下游引物MFW14R的序列为GCGAGAAGATTGATGGACAAC，PCR反应条件为95°C预变性5min，94。C变性30s、60.1退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW16中上游引物MFW16F的序列为GTCCATTGTGTCAAGATAGAG，下游引物MFW16R的序列为TCTTCATTTCAGGCTGCAAAG，PCR反应条件为95。C预变性5min，94°C变性30s、60.1退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72X:延伸5min;引物MFW19中上游引物MFW19F的序列为CAATCCTCCATCATGCAAAC,下游引物MFW19R的序列为GCACAAACTCCACATTGTGCC，PCR反应条件为95。C预变性5min,94。C变性30s、58.4。C退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW20中上游引物MFW20F的序列为CAGTGAGACGATTACCTTGG，下游引物MFW20R的序列为GTGAGCAGCCCACATTGAAC，PCR反应条件为95°C预变性5min，94'C变性30s、56。C退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW24中上游引物MFW24F的序列为GCTCCAGATTGCACATTATAG，下游引物MFW24R的序列为CTACACACACGCAGAGCCTTTC，PCR反应条件为95'C预变性5min，94。C变性30s、60.1退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72"C延伸5min;引物MFW29中上游引物MFW29F的序歹lj为CTACACACACGCAGAGCCTTTC,下游引物MFW29R的序列为GAAGCTTTGCTCTAATCCACG，PCR反应条件为95。C预变性5min，94°C变性30s、61.6退火30s、72'C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW30中上游引物MFW30F的序列为GGTCAACAAGTAGTTGTGCAG，下游引物MFW30R的序列为CCATCTCTGTCATTGCAACAG，PCR反应条件为95""C预变性5min，94°C变性30s、58.7退火30s、72'C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min。其它步骤及参数与实施方式一或四相同。本实施方式从鲤鱼29个微卫星位点中选择了15个表现多态性的微卫星位占。乂、、、o具体实施方式六:本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤b(3)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色，再甩Gel-proanalyzer4.5软件分析电泳图谱，并结合PCR产物长度及双核苷酸重复确认片段大小并判定基因型。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式七本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤b(4)利用MicrosoftExcel2003、SPSS13.0统计软件、PopGene(Version3.2)软件和ezAuctionlmage4.0图形处理软体进行数据处理；再根据公式PIC=l-|^2g^2P,2p/和A^(l-Kt)/4Fst进行计算；其中尸/C为多态信息含量，尸i'头第'不尊位基因的频率，尸j为第j个等位基因的频率，n为等位基因数，^n为群体间每代迁移数，Kt为群体间遗传分化指数。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式y、本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤C对步骤a得出的各形态标记间的比值进行分层聚类分析，并对步骤b计算出的数据进行统计分析。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式九本实施方式与具体实施方式八的不同点是步骤C分层聚类分析中不同种群间距离的测量选用组间连接法。其它步骤及参数与实施方式八相同。具体实施方式十本实施方式德国镜鲤杂交优势种群按以下步骤进行筛选a、形态标记对各种群随机选出的德国镜鲤的可量性状和可数形状进行标记，可量性状为体重、全长、体长、体高、头长、头高、尾柄长、尾柄高、吻长、眼径和眼间距，可数形状为左侧线上鳞、左侧线侧鳞、左侧线下鳞、右侧线上鳞、右侧线侧鳞和右侧线下鳞；b、再进行微卫星分子标记:(1)DNA的提取与纯化采用酚/氯仿法提取鳍条基因组DNA，纯化后定量'至DNA浓度为50ng/^iL;(2)RCR扩增RCR扩增反应体系为25jxL:水14pL、10xPCRbuffer2.5pL、10mmol/L4xdNTPs2nL、2.0mmol/LMgCl21.5pL、lOpmol/pL上下游引物各lpL、r"《DNA聚合酶1U(2|iiL)和50ng/nLDNA模板lpL;RCR扩增引物为MFW1、MFW2、MFW3、MFW4、MFW5、MFW9、MFW7、MFWll、MFW14、MFW16、MFW19、MFW20MFW24、MFW29和MFW30;引物MFW1中上游引物MFW1F的序歹U为GTCCAGACTGTCATCAGGAG，下游引物MFW1R的序列为GAGGTGTACACTGAGTCACGC，PCR反应条件为95'C预变性5min，94°C变性30s、63.7退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW2中上游引物MFW2F的序列为CACACCGGGCTACTGCAGAG,下游引物MFW2R的序列为GTGCAGTGCAGGCAGTTTGC，PCR反应条件为95"C预变性5min，94。C变性30s、6(TC退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW3中上游弓l物MFW3F的序列为GATCAGAAGGTACAGAGAAG，下游引物MFW3R的序列为CCTTACAGAAAACCTGTTTGC,PCR反应条件为95。C预变性5min，94°C变性30s、53。C退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72-C延伸5min;引物MFW4中上游引物MFW4F的序列为TCCAAGTCAGTTTAATCACCG,下游引物MFW4R的序列为GGGAAGCGTTGACAACAAGC,PCR反应条件为95。C预变性5min，94"C变性30s、60.5。C退火30s、72"C延伸50s、30个循环，72T:延伸5min;引物MFW5中上游引物MFW5F的序列为GAGATGCCTGGGGAAGTCAC，下游引物MFW5R的序列为AAAGAGAGCGGGGTAAAGGAG，PCR反应条件为95'C预变性5min，94。C变性30s、62.9退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW7中上游引物MFW7F的序列为TACTTTGCTCAGGACGGATGC，下游引物MFW7R的序列为ATCACCTGCACATGGCCACTC，PCR反应条件为95'C预变性5min，94°C变性30s、61.5退火30s、72X:延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW9中上游引物MFW9F的序列为GATCTGCAAGCATATCTGTCG,下游引物MFW9R的序列为ATCTGAACCTGCAGCTCCTC，PCR反应条件为95""C预变性5min，94。C变性30s、58。C退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW11中上游引物MFW11F的序列为GCATTTGCCTTGATGGTTGTG，下游引物MFW11R的序列为TCGTCTGGTTTAGAGTGCTGC，PCR反应条件为95。C预变性5min，94°C变性30s、58.7退火30s、72'C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW14中上游引物MFW14F的序歹lj为CAGAAGCTTCTGGAAATCTGAG，下游引物MFW14R的序列为GCGAGAAGATTGATGGACAAC，PCR反应条件为95°C预变性5min，94。C变性30s、60.1退火30s、72""C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW16中上游引物MFW16F的序列为GTCCATTGTGTCAAGATAGAG，下游引物MFW16R的序列为TCTTCATTTCAGGCTGCAAAG，PCR反应条件为95。C预变性5min，94°C变性30s、60.1退火30s、72"C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW19中上游引物MFW19F的序列为CAATCCTCCATCATGCAAAC,下游引物MFW19R的序列为GCACAAACTCCACATTGTGCC，PCR反应条件为95。C预变性5min，94。C变性30s、58.4。C退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW20中上游引物MFW20F的序列为CAGTGAGACGATTACCTTGG,下游引物MFW20R的序列为GTGAGCAGCCCACATTGAAC，PCR反应条件为95°C预变性5min，94。C变性30s、56。C退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW24中上游引物MFW24F的序列为GCTCCAGATTGCACATTATAG，下游引物MFW24R的序列为CTACACACACGCAGAGCCTTTC，PCR反应条件为95°C预变性5min，94。C变性30s、60.1退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW29中上游引物MFW29F的序歹!j为CTACACACACGCAGAGCCTTTC，下游引物MFW29R的序列为GAAGCTTTGCTCTAATCCACG，PCR反应条件为95。C预变性5min，94°C变性30s、61.6退火30s、72X:延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW30中上游引物MFW30F的序歹!j为GGTCAACAAGTAGTTGTGCAG，下游引物MFW30R的序列为CCATCTCTGTCATTGCAACAG，PCR反应条件为95。C预变性5min，94。C变性30s、58.7退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min。(3)产物检测PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色，再用Gel-proanalyzer4.5软件分析电泳图谱，并结合PCR产物长度及双核苷酸重复确认片段大小并判定基因型；(4)数据处理步骤b(4)利用MicrosoftExcel2003、SPSS13.0统计软件、PopGene(Version3.2)软件和ezAuctionlmage4.0图形处理软体进行数据处理；再根据公式PICH-tifli力2PfP/和A^(1-Fst)/4&进行计算；其中尸/C/=1i=lj=i+l为多态信息含量，A为第i个等位基因的频率，户j为第j个等位基因的频率，n为等位基因数，A^为群体间每代迁移数，^t为群体间遗传分化指数；c、数据分析对步骤a得出的各形态标记间的比值进行分层聚类分析，并对步骤b计算出的数据进行统计分析；根据分析结果选择种群差异性大的作为德国镜鲤杂交优势种群。本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均容易购得，若无注明则浓度为产品标注浓度。本实施方式中的操作步骤参见试剂或试剂盒使用操作手册或说明。本实施方式选择德国镜鲤保种群体(BZ)、北林群体(BL)和松浦群体(SP)进行杂交优势种群筛选。德国镜鲤保种群体(BZ)为黑龙江水产研究所保存德国镜鲤选育系(F4)群体进一步选育得到的；北林群体(BL)为黑龙江省绥化清涛渔场生产繁育群体经黑龙江水产研究所进一步选育得到的；松浦群体(SP)为黑龙江水产研究所松浦实验场生产群体，是在无选择压力下得到的。每个种群随机采12尾。本实施方式从步骤a形态标记的9组可量性状组成的比例变量(全长/体长、体长/体高、体长/头长、体长/尾柄长、尾柄长/尾柄高、头长/吻长、头长/眼径、头长/眼间距、头长/头高)中得出头长/头高在三个种群中有差异；由步骤a形态标记的17组可量性状和可数性状结果中得出9组数据在三个种群中有差异。三个种群中有差异的指标如表1所示。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注同一行右上角标有不同英文字母表示有差异显著(p《0.05)(由a，b标注)；极显著(p<0.01)(由c，d标注)。从表1中可知SP在全长、体高和头长/头高上与BZ和BL差异显著；在鳞被上SP与BZ和BL差异极显著;SP在头长和头长/头高上与BZ差异显著，与BL差异不显著。说明SP与BZ和BL在外部形态上有显著差异，其三个德国镜鲤种群间的差异主要为鳞被和头部形态。.对三个德国镜鲤种群的量度指标进行分层聚类分析，分析中不同类之间距离的测量选用组间连接法。德国镜鲤三个种群间欧氏距离比较结果如表2所示，德国镜鲤三个种群间欧氏距离在3.22~6.28之间，其中最大的欧氏距离出现在SP与BL之间。并由此作出Cluster聚类图(图1)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>本实施方式所选用的引物在德国镜鲤群体基因组中表现多态性。利用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶分离PCR产物，均获得了清晰的电泳图谱。其中引物MFW7的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果如图2所示，引物MFW24的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果如图3所示。本实施方式15个微卫星位点在3个德国镜鲤种群中的等位基因数、遗传杂合度和多态信息含量统计结果如表3所示。从位点来看，最高尸/C为BL的MFW16位点(0.9009)，最低的SP的MFW30位点(0.2961);从种群来看3个镜鲤种群在15个微卫星位点上的平均尸/C为0.7181，其中BZ平均尸/C为0.7556，高度多态性位点占总位点的93.33%;BL平均户/C为0.7964,高度多态性位点占总位点的93.33%;SP平均P/C为0.6023，高度多态性位点占总位点的73.33%。[表3中Mr为微卫星基因座的等位基因数(Allelenumber)、//e为其月望杂合度(Expectedheterozygosity)]表3<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>德国镜鲤的等位基因数在2至15之间，平均等位基因数在5.611.3,其中平均等位基因数最高的是BL(10.3)，其次是BZ(9.0)和SP(5.6)。本实施方式中3个德国镜鲤种群的期望杂合度在0.2111至0.8874之间，平均期望杂合度值在0.37130.9111，其中平均期望杂合度最高的是BL(0.8146)，其次是BZ(0.7556)和SP(0.6638)。3个德国镜鲤种群的遗传相似性指数和遗传距离进行分析结果见表4。3个德国镜鲤种群中BL和SP间的遗传相似性指数最小(0.5220)，遗传距离值最大(0.6500)，说明这两个群体间遗传变异程度最高，亲缘关系最远；BZ与BL间遗传相似性指数最大(0.7378)，遗传距离值最小(0.3040)。UPGMA法聚类结果如图4所示。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>本实施方式中的3个德国镜鲤种群可分为2支，BZ和BL为一支，而SP为另一支。各位点上群体间的变异(Fst)为0.0324-0.0887，3个群体在15个位点的平均^为0.0813，表明有8.13%的变异是由群体分化导致的，而91.87%的变异来源于群体内。群体间每代迁移数(Wm)均较高，均值为4.4674，以BZ与BL间最高(7.4660)。根据形态标记与微卫星分子标记的分析结果，本实施方式选定德国镜鲤保种群体(BZ)和松浦群体(SP)杂交优势种群。序列表〈110〉中国水产科学研究院黑龙江水产研究所〈120〉德国镜鲤杂交优势种群的筛选方法<160〉30〈210〉1〈211>20〈212〉腿〈213〉人工序列〈220〉<223>引物MFW1中的上游引物MFW1F。〈400〉1gtccagactgtcatcaggag20〈210〉2<211>21〈212〉DNA〈213>人工序列<220>〈223〉引物MFW1中的下游引物MFW1R。<400>2gaggtgtacactgagtcacgc21〈210〉3<211>20<212>DNA<213>人工序列〈220><223>引物MFW2中的上游引物MFW2F。〈400〉3cacaccgggctactgcagag20〈210〉4〈211〉20<212>腿〈213〉人工序列〈223〉引物MFW2中的下游引物MFW2R。〈400〉4gtgcagtgcaggcagtttgc20〈210〉5〈211〉20<212〉DNA〈213〉人工序列<220〉〈223〉引物MFW3中的上游引物MFW3F。〈400〉5gatc3gaaggtacagagaag20<210〉6〈211〉21<212>腿<213〉人工序列〈220>〈223〉引物MFW3中的下游引物MFW3R。<400>6ccttacagaaaacctgtttgc21<210〉7<211>21<212>腿〈213〉人工序列<220>〈223>引物MFW4中的上游引物MFW4F。<400〉7tccaagtcagtttaatcaccg21<210>8〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220><223〉引物MFW4中的下游引物MFW4R。〈400〉8gggaagcgttgacaacaagc20〈210〉9<211〉20<212>DNA<213>人工序列〈220〉〈223〉引物MFW5中的上游引物MFW5F。<400>9g卿tgcctggggaagtcac20<210>10<211〉21<212>腿〈213〉人工序列<220〉〈223〉引物MFW5中的下游引物MFW5R。〈400〉10aa卿gagcggggtaaaggag21<210〉11〈211>21<212>■〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物MFW7中的上游引物MFW7F。〈400>11tactttgctcaggacggatgc21<210>12〈211〉21<212〉DNA〈213〉人工序列〈220><223〉引物MFW7中的下游引物MFW7R。〈400〉12atcacctgcacatggccactc21<210>13〈211〉21〈212〉■〈213〉人工序列<220〉〈223〉引物MFW9中的上游引物MFW9F。〈400>13gatctgcaagcatatctgtcg21〈210〉14〈211>20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223>引物MFW9中的下游引物MFW9R。〈400>14atctgaacctgcagctcctc20<210〉15<211〉21<212>DNA<213〉人工序列<220><223〉引物MFWll中的上游引物MFWllF。<400〉15gcatttgccttgatggttgtg21<210>16〈211〉21<212〉腿<213〉人工序列〈220〉<223〉引物MFWll中的下游引物MFWllR。<400〉16tcgtctggtttagagtgctgc21<210〉17〈211〉22<212〉DNA<213〉人工序列〈220〉〈223>引物MFW14中的上游引物MFW14F。<400〉17cagsagcttctggasatctgag22<210〉18〈211>21〈212〉薩〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物MFW14中的下游引物MFW14R。<400〉18gcgagaagattgatggacaac21<210>19〈211〉21<212〉腿—<213>人工序列<220><223>引物MFW16中的上游引物MFW16F。<400>19gtccattgtgtcaagatagag21〈210〉20〈211〉21<212>DNA〈213>人工序列<220>〈223〉引物MFW16中的下游引物MFW16R。〈400〉20tcttcatttcaggctgcaaag21<210>21〈211〉20<212>■〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物MFW19中的上游引物MFW19F。〈400〉21caatcctccatcatgcaaac20〈210>22〈211〉21<212〉■<213〉人工序列〈220〉<223>引物MFW19中的下游引物MFW19R。〈400〉22gcacaaactccacattgtgcc21〈210〉23〈211〉20<212>腿〈213〉人工序列<220>〈223〉引物MFW20中的上游引物MFW20F。<400>23cagtgagacg.attaccttgg20〈210〉24〈211〉20〈212>薩〈213〉人工序列〈220>〈223>引物MFW20中的下游引物MFW20R。〈400〉24gtgagcagcccacattgaac20〈210〉25〈211〉21〈212〉腿〈213>人工序列〈220〉〈223〉引物MFW24中的上游引物MFW24F。〈400〉25gctccagattgcacattatag21〈210〉26〈211〉22<212〉腿〈213〉人工序列<220>〈223〉引物MFW24中的下游引物MFW24R。〈400〉26ctacacacacgcagagcctttc22〈210〉27〈211〉22〈212>DNA<213〉人工序列〈220〉〈223>引物MFW29中的上游引物MFW29F。<400〉27ctacacacacgcagagcctttc2<210〉28〈211>21<212>DNA<213〉人工序列<220><223>引物MFW29中的下游引物MFW29R。〈400〉28gaagctttgctctaatccacg21〈210>29<211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉<223>引物MFW30中的上游引物MFW30F。〈400〉29ggtcaacaagtagttgtgcag21〈210〉30<211>21〈212>DNA<213>人工序列〈220〉<223>引物MFW30中的下游引物MFW30R。〈400〉30ccatctctgtcattgcaacag2权利要求1、德国镜鲤杂交优势种群的筛选方法，其特征在于德国镜鲤杂交优势种群按以下步骤进行筛选a、形态标记对各种群随机选出的德国镜鲤的可量性状和可数形状进行标记；b、再进行微卫星分子标记(1)DNA的提取与纯化；(2)RCR扩增；(3)产物检测；(4)数据处理；c、数据分析，选择种群差异性大的作为德国镜鲤杂交优势种群。2、根据权利要求1所述的德国镜鲤杂交优势种群的筛选方法，其特征在于步骤a中可量性状包括体重、全长、体长、体高、头长、头高、尾柄长、尾柄高、吻长、眼径和眼间距。3、根据权利要求1所述的德国镜鲤杂交优势种群的筛选方法，其特征在于步骤a中可数形状包括左侧线上鳞、左侧线侧鳞、左侧线下鳞、右侧线上鳞、右侧线侧鳞和右侧线下鳞。4、根据权利要求1所述的德国镜鲤杂交优势种群的筛选方法，其特征在于步骤b(l)中釆用酚/氯仿法提取鳍条基因组DNA，纯化后定量至DNA浓度为50ng/joL。5、根据权利要求1或4所述的德国镜鲤杂交优势种群的筛选方法，其特征在于步骤b(2)中RCR扩增反应体系为25^L:水14pL、10xPCRbuffer2.5^L、10mmol/L4xdNTPs2jiL、2.0mmol/LMgCl21.5jiL、10pmolL上下游引物各1pL、7b《DNA聚合酶1U和50ng/|aLDNA模板1|aL;RCR扩增弓I物为MFW1、MFW2、MFW3、MFW4、MFW5、MFW9、MFW7、MFWll、MFW14、MFW16、MFW19、MFW20MFW24、MFW29和MFW30;引物MFW1中上游引物MFW1F的序列为GTCCAGACTGTCATCAGGAG，下游引物MFW1R的序列为GAGGTGTACACTGAGTCACGC，PCR反应条件为95'C预变性5min，94°C变性30s、63.7退火30s、72'C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW2中上游引物MFW2F的序列为CACACCGGGCTACTGCAGAG,下游弓i物MFW2R的序歹U为GTGCAGTGCAGGCAGTTTGC，PCR反应条件为95'C预变性5min，94。C变性30s、6(TC退火30s、72"C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW3中上游引物MFW3F的序列为GATCAGAAGGTACAGAGAAG，下游引物MFW3R的序列为CCTTACAGAAAACCTGTTTGC,PCR反应条件为95。C预变性5min，94°C变性30s、53。C退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW4中上游引物MFW4F的序歹U为TCCAAGTCAGTTTAATCACCG,下游引物MFW4R的序列为GGGAAGCGTTGACAACAAGC，PCR反应条件为95。C预变性5min，94i:变性30s、60.5。C退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW5中上游引物MFW5F的序列为GAGATGCCTGGGGAAGTCAC，下游引物MFW5R的序列为AAAGAGAGCGGGGTAAAGGAG,PCR反应条件为95。C预变性5min，94。C变性30s、62.9退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72"C延伸5min;引物MFW7中上游引物MFW7F的序列为TACTTTGCTCAGGACGGATGC，下游引物MFW7R的序列为ATCACCTGCACATGGCCACTC,PCR反应条件为95""C预变性5min，94°C变性30s、61.5退火30s、72。C延伸50s、30个循环，，72。C延伸5min;引物MFW9中上游引物MFW9F的序歹U为GATCTGCAAGCATATCTGTCG,下游引物MFW9R的序列为ATCTGAACCTGCAGCTCCTC，PCR反应条件为95'C预变性5min，94。C变性30s、58。C退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW11中上游引物MFW11F的序列为GCATTTGCCTTGATGGTTGTG，下游引物MFW11R的序列为TCGTCTGGTTTAGAGTGCTGC，PCR反应条件为95。C预变性5min,94。C变性30s、58.7退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW14中上游引物MFW14F的序列为CAGAAGCTTCTGGAAATCTGAG，下游引物MFW14R的序列为GCGAGAAGATTGATGGACAAC，PCR反应条件为95°C预变性5min,94。C变性30s、60.1退火30s、72t:延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW16中上游引物MFW16F的序列为GTCCATTGTGTCAAGATAGAG，下游引物MFW16R的序列为TCTTCATTTCAGGCTGCAAAG，PCR反应条件为95。C预变性5min，94°C变性30s、60.1退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW19中上游引物MFW19F的序列为CAATCCTCCATCATGCAAAC,下游引物MFW19R的序列为GCACAAACTCCACATTGTGCC，PCR反应条件为95。C预变性5min，94。C变性30s、58.4。C退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW20中上游引物MFW20F的序歹U为CAGTGAGACGATTACCTTGG，下游引物MFW20R的序列为GTGAGCAGCCCACATTGAAC,PCR反应条件为95°C预变性5min，94'C变性30s、56。C退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72t:延伸5min;引物MFW24中上游引物MFW24F的序列为GCTCCAGATTGCACATTATAG，下游引物MFW24R的序列为CTACACACACGCAGAGCCTTTC,PCR反应条件为95。C预变性5min，94t:变性30s、60.1退火30s、72"C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW29中上游引物MFW29F的序列为CTACACACACGCAGAGCCTTTC，下游引物MFW29R的序列为GAAGCTTTGCTCTAATCCACG，PCR反应条件为95i:预变性5min，94°C变性30s、61.6退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min;引物MFW30中上游引物MFW30F的序歹U为GGTCAACAAGTAGTTGTGCAG，下游引物MFW30R的序列为CCATCTCTGTCATTGCAACAG，PCR反应条件为95。C预变性5min，94°C变性30s、58.7退火30s、72。C延伸50s、30个循环，72。C延伸5min。6、根据权利要求1所述的德国镜鲤杂交优势种群的筛选方法，其特征在于步骤b(3)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后用10。/。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色，再用Gel-proanalyzer4.5软件分析电泳图谱，并结合PCR产物长度及双核苷酸重复确认片段大小并判定基因型。7、根据权利要求1所述的德国镜鲤杂交优势种群的筛选方法，其特征在于步骤b(4)利用MicrosoftExcel2003、SPSS13.0统计软件、PopGene(Version3.2)软件和ezAuctionlmage4.0图形处理软体进行数据处理；再根据公式PIC=l-|^2|i》2P,2p/和A^(lU/4&进行计算；其中尸/C为多态信息含量，A'i第'？羊，位基因的频率，A为第j个等位基因的频率，n为等位基因数，A^m为群体间每代迁移数，^t为群体间遗传分化指数。8、根据权利要求1所述的德国镜鲤杂交优势种群的筛选方法，其特征在于步骤c对步骤a得出的各形态标记间的比值进行分层聚类分析，并对步骤b计算出的数据进行统计分析。9、根据权利要求8所述的德国镜鲤杂交优势种群的筛选方法，其特征在于步骤c分层聚类分析中不同种群间距离的测量选用组间连接法。全文摘要德国镜鲤杂交优势种群的筛选方法，它一种鲤鱼杂交优势种群的筛选方法。本发明提供了一种行之有效的德国镜鲤杂交优势种群的筛选方法，以确保其杂种的遗传多样性，从而可以减少工作量、缩短育种年限、降低育种成本和提高选育成功率。筛选方法a.形态标记；b.再进行微卫星分子标记；c.数据分析。本发明将形态标记与微卫星分子标记相结合筛选德国镜鲤杂交优势种群，种群间遗传差异性双重验证，筛选结果更准确。文档编号C12Q1/68GK101403006SQ200810209540公开日2009年4月8日申请日期2008年11月27日优先权日2008年11月27日发明者李池陶,石连玉,胡雪松,贾智英,赵海燕申请人:中国水产科学研究院黑龙江水产研究所