具有免疫增强作用的酵母及含有该酵母的食品或饲料的制作方法

专利名称：具有免疫增强作用的酵母及含有该酵母的食品或饲料的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有良好的安全性且即使直接摄取菌体也能起到较高的免疫增强作用的酵母及含有该酵母的食品或饲料。
背景技术：
免疫是指当从外界侵入的病毒或细菌，或者癌细胞等侵袭机体时，机体防御自己的机构。免疫中參与多种细胞，其中由于巨噬细胞(macrophage)普遍存在于所有动物中，并且參与免疫应答的所有阶段，尤其包括初期阶段的作用，因此已经认识到其重要性。已经了解到，如果免疫低下，则会引发癌、感染症、过敏症等各种疾病；反之，如果免疫被增强，则可以期待抑制癌症发生、抗癌作用、抗感染症、抗敏作用，特别是恢复身体状态节律、維持机体稳态等多种效果。鉴于此，以改善消费者的健康状态为目的，已在提供具有免疫增强作用的各种化合物及微生物。例如，可以列举利用乳铁蛋白的水解物的(例如，參照专利文献I);利用甲壳素(例如，參照专利文献2)、海藻糖(例如，參照专利文献3)、岩藻聚糖硫酸酷(例如，參照专利文献4)等糖类的；利用植物源物质的(例如，參照专利文献5);利用肽(例如，參照专利文献6)、白细胞介素(例如,參照专利文献7)的；利用核酸的(例如，參照专利文献8);利用谷胱甘肽(例如，參照专利文献9)、氨基酸(例如，參照专利文献10)、多聚赖氨酸(例如，參照专利文献11)的；利用肠内细菌(例如，參照专利文献12)、乳酸菌(例如，參照专利文献13)、场球菌属细菌(例如，參照专利文献14)等微生物的化合物及微生物。另外，近年来，￠-葡聚糖(glucan)的免疫增强效果受到广泛关注。例如，提出从酵母或蘑菇类提纯￠-葡聚糖，并且利用该物质的免疫增强方法(例如，參照专利文献15、16)。然而，为了利用所述具有免疫增强作用的化合物而增强消费者的免疫，必须大量提纯而服用这种化合物，这需要多道制备エ序、大量劳动カ及费用。并且，所述具有免疫增强作用的微生物中，存在性状未知的微生物，并且还有不适合用于食品的微生物。另外，如果所述具有免疫增强作用的微生物其本身不能直接利用于食品制造(发酵等)，则为了使食品具备免疫增强功能，需要向食品単独添加该微生物。在此，已经公开有，由于酵母的染色体上的基因中，MCD4基因、GASl基因以及CWH41基因中的ー个或两个以上的基因被破坏，而导致具有免疫增强作用的酵母(例如，參照专利文献17)。根据所述专利文献17所公开的酵母，如同所述专利文献15、16中记载的技术那样，无需从酵母特意地提纯3 -葡聚糖，而即使直接服用该酵母，也能够增强免疫。然而，对于专利文献17中公开的酵母而言，所述特定的基因是根据基因重组技术而被破坏的。近年来，随着基因重组技术的发展，安全性已被鉴定的基础上，已有多种转基因食品得到认可，甚至在销售。但是，从消费者的角度来看，对于被基因重组的食物的安全性，仍然有较高的恐惧感。因此，现阶段，以食用用途为目的利用所述专利文献17的酵母，在应用上是具有难度的。而且，专利文献17中公开的酵母，由于与细胞壁结构有关的基因缺损，因此如预期的那样，已经证实，该酵母在低渗透压的培养基中增殖极其缓慢。因此，在培养所述酵母时，为了避免向结构已变得脆弱的细胞壁施加负荷，需要在培养基中添加例如糖类等物质来提高培养基的渗透压，使得培养基与酵母细胞膜内的溶液的滲透压变为相同，这需要培养成本。并且，将所述酵母应用在例如面包等食品的发酵时，存在发酵条件受限制、以及为了使发酵液变为等压而添加糖类时食品风味被改变等问题。另外，人工诱变方法是指根据例如诱变剂、紫外线照射、放射线照射等诱变因素，而相比于自然突变，以更高频率引起DNA突变的方法。所述人工诱变方法不同于所述基因重组技木，其不会插入食物原本具有的碱基序列以外的碱基序列。因此，根据所述人工诱变方法而遗传性状被改变的食物，在目前来看，由于安全性比较高而被消费者所接受。因此，到目前为止的现状是，还没有提供具有良好的安全性、即使直接摄取菌体也能起到较高的免疫增强作用、便宜且易购得、食品制造中可以直接利用、且在低渗透压下也能够培养的酵母等微生物，并且迫切期望能够早日提供。专利文献1:专利公开公报平5-178759号专利文献2 :专利公开公报平6-271470号专利文献3 :专利公开公报2003-81839号专利文献4 :专利公开公报2001-181303号专利文献5 :专利公开公报平6-56685号

专利文献6 :专利公 报第2873434号专利文献7 :专利公报2002-3395号专利文献8 :专利公报第2529605号专利文献9 :专利公开公报平11-49696号专利文献10 :专利公开公报2000-281571号专利文献11 :专利公开公报2003-128589号专利文献12 :专利公开公报平6-56678号专利文献13 :专利公开公报平7-228536号专利文献14 :专利公开公报平11-92389号专利文献15 :专利公开公报2001-354570号专利文献16 :专利公开公报2003-183176号专利文献17 :专利公开公报2006-75039号

发明内容
本发明将解决上述现有技术中存在的诸多问题，并以达到以下目的作为课题。即，本发明的目的在于提供ー种具有良好的安全性、即使直接摄取菌体也能起到较高的免疫增强作用、便宜且容易购得、食品制造中可以直接利用、并且在低渗透压下也能够培养的酵母，以及含有该酵母的食品或饲料。
为了解决上述课题，本发明的发明者们努力探讨的结果，得到了以下见解。S卩，对于目前广泛地应用在食品制造中的酵母，根据利用甲基磺酸こ酯的人工诱变方法来使酵母染色体上发生突变时，能够获得细胞壁的甘露聚糖少的酵母；该酵母由于细胞壁的甘露聚糖少的原因，￠-葡聚糖暴露在菌体表面，因此即使不专门从酵母提纯￠-葡聚糖，而直接用在免疫增强作用试验，也表现出显著的免疫增强作用；该酵母虽然细胞壁的甘露聚糖少，但是具有预料不到的效果，即对低渗透压表现出较高的耐性，适用于酵母制备(培养)以及含有该酵母的食品和饲料的制造。本发明是基于发明人们的以上见解而完成的，作为解决上述课题的技术手段如下。<1>酵母的特征在干，细胞壁甘露聚糖少，具有免疫增强作用，能够在渗透压为300m Osm的YPD液体培养基中増殖。<2>所述〈1>中记载的酵母的特征在于，免疫增强作用是巨噬细胞活化作用。<3>所述〈1>至〈2>任意ー项中记载的酵母的特征在于，根据人工诱变方法获得免疫增强作用。<4>所述〈1>至〈3>任意ー项中记载的酵母的其特征在干，未被基因重组。<5>所述〈3>至〈4>任意ー项中记载的酵母的特征在于，在人工诱变方法中使用的未株为 Saccharomyces cerevisiae。<6>所述〈3>至〈5>任意ー项中记载的酵母的特征在于，人工诱变方法是利用诱变齐U、紫外线照射以及放射线照射中的任意ー种的方法。<7>所述〈1>至〈6 >任意一项中记载的酵母的特征在于，该酵母是Saccharomycescerevisiae FERM BP-11293 以及 Saccharomyces cerevisiaeFERM BP-11294 中的任意一种。<8>含有所述〈1>至〈7>任意ー项中记载的酵母的食品或者饲料。根据本发明，能够解决现有技术中存在的诸多问题，且可以提供具有良好的安全性、即使直接摄取菌体也能起到较高的免疫增强作用、便宜且容易购得、食品制造中可以直接利用、并且在低渗透压下也能够培养的酵母，以及含有该酵母的食品或饲料。


图1为突变体f 4的显微镜图像；图2为示出关于突变体广4的巨噬细胞活化作用试验的结果的图；图3A为示出关于突变体3以及亲株的增殖试验的结果的图；图3B为示出关于突变体3以及亲株的增殖试验的结果的图；图4为示出关于记载在专利公开公报2006-75039中的变异体(MCD4 A株)的增殖试验的结果的图；图5为示出根据实施例6、7制造的含有突变体3的食品的巨噬细胞活化试验的结果的图。
具体实施例方式(酵母)
本发明的酵母的特征在于，细胞壁的甘露聚糖少，并且具有免疫增强作用，而且能够在渗透压为300m Osm (0SM0L，渗量)的YPD液体培养基中増殖。<免疫增强作用>所述免疫增强作用是，增强自然免疫的作用。所述自然免疫是指，机体所具备的免疫中，机体先天具备而起到即使事先未暴露在抗原中也能够将所述抗原从机体排除的作用的机构。作为所述抗原，只要不影响本发明的效果，就没有特别的限制。例如可以列举，病毒、细菌等外来抗原以及癌细胞等内在抗原。作为所述免疫增强作用，只要能够增强所述自然免疫，就没有特别限制，可以根据目的适当选择。例如可以列举，吞噬细胞(巨噬细胞、单球、中性粒细胞、树突状细胞)、抗原呈递细胞(巨噬细胞、树突状细胞)、自然杀伤(NK)细胞、多形核白细胞(嗜酸球、嗜碱球、月巴大细胞)等活化作用。其中，基于普遍存在于各种生物中且排除抗原的效果较高的原因，优选为所述巨噬细胞的活化作用。作为评价所述酵母具有所述免疫增强作用的方法，没有特别限制，可以根据与自然免疫有关的所述细胞的种类，从现有的公知的评价方法中适当选择。例如，对所述巨噬细·胞的活化作用的评价，可以根据如下方法来进行。即，通过将巨噬细胞在培养基或者缓冲液中接触所述酵母而刺激所述巨噬细胞，并測定在刺激前后所述巨噬细胞产生的细胞因子(例如，TNF-a等)的量。所述酵母具有免疫增强作用的原因被认为是，由于细胞壁的甘露聚糖少，从而导致具有免疫增强作用的3-葡聚糖暴露在菌体表面。<甘露聚糖>通常，甘露聚糖是构成酵母的细胞壁的主要成分之一，是以D-甘露糖为主链的糖链。甘露聚糖与蛋白质结合而以甘露聚糖蛋白质形态存在。在酵母的细胞壁中，沿着细胞膜的外周面形成有￠-葡聚糖层，所述甘露聚糖蛋白质通过称为糖基化磷脂酰肌醇(GPI，glycosylphosphatidylinositol)锚的糖脂类与该P -葡聚糖结合。其结果，甘露聚糖覆盖而隐藏￠-葡聚糖，并存在于细胞壁的最外层(即，菌体表面)。对此，本发明的所述酵母中，由于细胞壁的甘露聚糖少，因此P -葡聚糖代替甘露聚糖暴露在菌体表面。所述酵母，其细胞壁上甘露聚糖少的原因尚未证实，但是被认为是例如，甘露聚糖、甘露聚糖蛋白质及GPI锚中的至少ー种未被合成；虽然已被合成但没有运输到细胞膜外；相结合的部位发生缺损或突变等原因造成的。确认所述酵母中细胞壁甘露聚糖少时，例如可以利用，甘露聚糖特异性抗体、与甘露聚糖中的D-甘露糖、甲基-a -D-吡喃甘露糖苷等特异性结合的ConA (刀豆蛋白A)凝集素等物质来确认。具体来讲，将所述抗体或者所述ConA利用异硫氰酸荧光素(FITC，Fluorescein isothiocianate)等突光色素标记后,根据所述突光来检测结合于菌体表面的所述抗体或者所述ConA。此时,如果没有检测出根据所述抗体或者所述ConA结合到菌体表面而产生的荧光，则可以判定为细胞壁甘露聚糖少。对于所述荧光的检测，可以通过荧光显微镜下观察的方法来进行，也可以利用例如流式细胞仪、荧光分析仪等装置来以定量分析的方法来进行。并且，确认所述酵母中细胞壁甘露聚糖少时，例如可以根据对细胞壁甘露聚糖的含量进行定量分析的方法来确认。作为对甘露聚糖含量的定量分析方法，没有特别限制，例如可以根据以下的顺序进行。S卩，首先，利用玻璃珠来破碎细胞，通过离心调整细胞壁物质并冷冻干燥。其次，根据Dallies们的方法(Yeast，1998，14，P1297_1306)进行硫酸水解，将中和后的上清液冻结干燥，并利用 REZEXTM RPM-Mono sac char i de Phenomenex (ShimadzuGLC LTD)等色谱柱以高效液相色谱法(HPLC)进行分析，根据得到的葡萄糖与甘露糖的比值，能够得到细胞壁中的甘露聚糖的含量。作为细胞壁中甘露聚糖的含量，只要以￠-葡聚糖暴露于菌体表面的程度少时，没有特别限制，但是更加优选为，细胞壁中不含有甘露聚糖。所述￠-葡聚糖是构成酵母的细胞壁的主要成分之一，是由葡萄糖通过￠1-3结合的糖链。作为所述P -葡聚糖的平均分子量及修饰实施形态，只要具有免疫增强作用，就没有特别限制，可以根据酵母的种类和培养条件而变更。作为确认所述酵母中￠-葡聚糖暴露在菌体表面的方法，没有特别限制，可以根据目的适当选择。例如，可以利用￠-葡聚糖特异性抗体、苯胺蓝等荧光试剂来确认。另外，可以利用电子显微镜观察菌体表面的3-葡聚糖纤维来确认。<对渗透压的耐性>通常，包括酵母的一部分微生物、植物具有细胞壁，这种细胞壁具有对渗透压的耐性、維持细胞形态等极其重要的功能。鉴于此，本发明的所述酵母，由于如上所述其细胞壁中的甘露聚糖少，因而可能会丧失对渗透压的耐性。但是，在后述的实施例中可以证实，根据本发明的发明人们制备的酵母，具有预料不到的 效果，即具有对渗透压的耐性。作为表示本发明的所述酵母对渗透压具有耐性的指标，只要不影响本发明的效果，就没有特别限制，可以根据目的适当选择。但是优选的指标为，能够在渗透压为300m0sm(OSMOL,渗量)的YPD液体培养基中増殖。在此，所述YPD液体培养基是使用由I质量％的酵母膏、2质量％的蛋白胨，2质量％的葡萄糖组成的培养基。并且，用在所述YPD液体培养基中的酵母膏是使用东方酵母エ业(株式)会社制备的酵母膏，蛋白胨是使用日本制药(株式)会社制备的蛋白胨，葡萄糖是使用国产化学(株式)会社制备的葡萄糖。所述渗透压例如可以根据山梨醇等非发酵性糖类、NaCl等物质来调节。所述渗透压例如可以利用渗透压计F-2000 (roebling公司造)来測定。本发明中“能够増殖”是指，将属于高滲透压培养基的YPDS液体培养基中预培养的一部分培养液添加到所述YPD液体培养基，使OD66tl达0. 1，然后在适宜条件下震荡培养吋，24小时培养后的OD66tl达到1. 0以上。在此，所述YPDS液体培养基是使用由I质量％的酵母膏、2质量％的蛋白胨，2质量％的葡萄糖、5. 5质量％ (0. 3mol/L)的山梨醇组成的培养基。并且，用在所述YPDS液体培养基中的酵母膏是使用东方酵母エ业(株式)会社制备的酵母膏，蛋白胨是使用日本制药(株式)会社制备的蛋白胨，葡萄糖是使用国产化学(株式)会社制备的葡萄糖，山梨醇是使用和光纯药エ业(株式)会社制备的山梨醇。另外，增殖试验中所使用的酵母为尿嘧啶营养缺陷型吋，在使用的YPD液体培养基和YPDS液体培养基中，均添加相当于葡萄糖含量的0. 3质量％以上的尿嘧啶而进行増殖试验。即，对于YPD液体培养基或者YPDS液体培养基，葡萄糖含量为2质量％时，对于YPD液体培养基或者YPDS液体培养基，尿嘧啶含量为6X 10_3质量％以上。并且，増殖试验中所使用的酵母为其他营养缺陷型吋，也同样在所使用的YPD液体培养基和YPDS液体培养基中，均添加足够的所需物质后，进行増殖试验。所述OD66tl例如可以利用分光光度计来測定。由于所述酵母能够在渗透压为300m 0sm(0SM0L，渗量)的YPD液体培养基中増殖，因此例如不需要为了提高培养基的滲透压而添加糖等物质，从而可以降低培养成本。并且，将所述酵母添加到食品吋，即使在培养后以低渗透压溶液洗浄，菌体也不会被破坏，因此可以提1 活菌回收率，而且可以提1 食品制造效率。< 酵母 >对于所述酵母的种类，没有特別限制，可以根据目的适当选择。例如，可以列举面包酵母、啤酒酵母、葡萄酒酵母、清酒酵母以及味增酱油酵母等。其中，优选为面包酵母。作为所述酵母，没有特別限制，可以根据目的适当选择。例如，可以列举酵母(Saccharomyces)属、接合酵母(Zygosaccharomyces)属、亚罗酵母(Yarrowia)属、拟威尔酵母(Williopsis)属、有孢圆酵母(Torulaspora)属、假丝酵母(Candida)属、红酵母(Rhodotorula)属、毕赤酵母(Pichia)属等。作为所述酵母的种，可以列举酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、措抗酵母(Candida saitoana)、热带假丝酵母(Candida tropical is)、解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)、德尔布有抱圆酵母(Torulaspora deIbrueckii)、皱糟假丝酵母(Candida sake)、热带假丝酵母(Candidatropical is)、产 朊假丝酵母(Candida 11丨;[118)、异常毕赤酵母(？;[(31113311011^13)、土星拟威尔酵母(Williopsis saturnus)、扣囊复膜抱酵母(Saccharomycopsis fibIigera)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、毕赤酵母(Pichia farinosa)等。其中，优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus),而且尤其优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。作为所述酿酒酵母，没有特別限制，可以根据目的适当选择。但是优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) FERM BP-11291、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FERM BP-11292、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) FERM BP-11293 以及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) FERMBP-11294。基于免疫增强作用高的理由，尤其优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) FERM BP-11293 以及酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) FERMBP-11294。所述酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) FERM BP-11291、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FERM BP-11292、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FERMBP-11293以及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FERMBP-11294是由发明人们制备的菌株，并且保藏在独立行政法人产业技术综合研究所，专利生物保藏中心。另外，所述酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) FERM BP-11291、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FERM BP-11292、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FERMBP-11293以及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FERM BP-11294的染色体上的突变位点，尚未被明确证实。但是已经明确，在所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) FERMBP-11294中，15号染色体的约IOOOObp的BamHI酶切片段上发生了突变。所述BamHI酶切片段中包含完整的RPS12、MRS6、GPB1、RAD17、NDD1基因，以及部分SCPl基因。因此暗示着，所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FERMBP_11294所具有的免疫增强作用，并不是由记载在专利公开公报2006-75039中的MCD4基因、GASl基因以及CWH41基因的突变引起的。另外，对于所述酵母的染色体组的数目，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，可以列举一倍体等。-培养方法-作为所述酵母的培养方法，没有特别限制，可以根据目的从现有的公知的方法中适当选择。例如，可以列举分批培养、流加培养等方法。可以优选地利用发酵罐(jar fermenter)来进行所述培养，对于此时的发酵罐中的条件，没有特别限制，可以适当选择。例如，培养温度约为28 33°C，培养时间约为f 120小时，PH值约为4 7，通气量约为(T5vvm，而搅拌速度约为10(T700rpm。—用途一作为所述酵母的用途，没有特别限制，可以根据目的适当选择。但是优选为作为添加到食品中而被使用的食品原材料、饲料、鱼饲料等用途，尤其优选为作为所述食品原材料的用途。另外，所述酵母可适用于例如面包、啤酒发酵等食品的制造中。通过利用本发明的酵母，可以得到具有免疫增强功能的食品、具有免疫增强功能的饲料、具有免疫增强功能的鱼饲料。此时，所述酵母可以以菌体未被破坏的状态直接使用，也可以以菌体被破坏的状态使用，另外还可以以干燥状态使用，并且还可以以活菌状态甚至未干燥的状态使用。作为所述破碎方法，没有特别限制，可以根据目的适当选择。例如，可以选择磨碎机(DYN0-MILL)等物理破碎 处理，也可以选择化学破碎处理。作为所述酵母的适用对象，只要具有自然免疫，就没有特别限制。例如，可以列举人；除了人以外的动物(马、牛、猪、绵羊、山羊、骆驼、原驼等家畜，小白鼠、大鼠、豚鼠、兔子等实验动物，鸡、鸭、火鸡、鸵鸟等家禽，真鯛、条石鲷、牙鲆、比目鱼、五条蛳、黄狮鱼、琥珀鱼、金枪鱼、长缟鰺、香鱼、鲑鳟鱼类、红鳍东方飩、鳗鱼、泥鳅、鲶鱼等鱼类，日本囊对虾、斑节对虾、中国对虾、三疣梭子蟹等甲壳类，鲍鱼、海螺、扇贝、牡蛎等贝类，宠物狗、宠物猫等宠物)等。<酵母的制备方法>所述酵母可以通过以下方法制备。即，可以以食品用途使用的酵母作为亲株，对该亲株以人工诱变的方法在染色体上引起突变。另外，也可以利用，可以以食品用途使用的酵母作为亲株，在该亲株中根据自然突变在染色体上发生突变的菌体。作为所述可以以食品用途使用的亲株，没有特别限制，可以根据目的适当选择。例如，可以利用所述〈酵母 > 部分中列举的酵母。所述人工诱变方法是指根据例如诱变剂、紫外线照射、放射线照射等诱变因素，而相比于自然突变，以更高频率引起DNA突变的方法。通过利用所述人工诱变方法，在不插入亲株原本具有的碱基序列以外的碱基序列的前提下，能够在染色体上发生突变。对于所述诱变剂，没有特别限制，可以根据目的适当选择。例如，可以列挙，甲基磺酸こ酯(Ethylmethane Sulfonate)、亚硝基胍、5_溴尿卩密唳等。
所述放射线例如，可以列举X线、a线、P线、Y线、粒子束等。作为进行人エ诱变处理后，筛选具有免疫增强作用的酵母的方法，没有特别限制，可以根据目的适当选择。例如，可以将对选择培养基的耐性、细胞表层的甘露聚糖的含量、巨噬细胞活化作用作为指标，进行筛选。作为根据所述人工诱变方法或者所述自然突变而发生突变的基因，只要亲株能够获得免疫增强作用，就没有特别限制。例如，可以列举RPS12、MRS6、GPB1、RAD17、NDD1、SCP1、MCD4、GAS1、CffH41等基因。另外，除了这些基因以外的染色体上的碱基序列发生突变也是可以的。另外，作为所述突变种类，只要亲株能够获得免疫增强作用，就没有特别限制，例如，可以列举碱基取代、添加、缺失、逆位等。(食品或饲料)

本发明的食品或饲料的特征在于，含有所述酵母。对于所述食品，没有特别限制，可以根据目的适当选择。例如，可以列举面包、饼干、烤饼(scone)等糕点，医院膳食，流质食物，水产及肉类加工品，面条类，调料，啤酒及果汁等饮料，健康食品，健康饮料等。对于所述饲料，没有特别限制，可以根据适用对象适当选择。作为所述适用对象，没有特别限制，例如可以列举，在所述酵母的用途部分中列举的适用对象。本发明的食品或饲料由于含有具有较高的免疫增强作用的所述酵母，因此具有较高的免疫增强功能。实施例以下，对本发明的实施例进行说明，但是本发明不限于这些实施例。(实施例1)-具有免疫增强作用的酵母的制备-——人工诱变处理——作为用于人工诱变处理的亲株，使用实用面包酵母的一倍体的T-21 (东方酵母エ业株式会社制备)的尿嘧啶营养缺陷型突变株T-21U株。另外，所述T-21U株是通过以下方法得到的。即，通过将T-21株在YPD液体培养基中培养之后，涂于含有5-氟乳清酸(5-Fluoroorotic Acid)的培养基(0. 7质量％的酵母氮源(YEAST NITROGEN BASE (DIFC0公司))、2质量％的葡萄糖、0.1质量％的5-氟乳清酸、
0.05质量％的尿嘧啶、2质量％的琼脂)，在30°C下培养3天，使菌体生长，由此作为自然突变的突变体被筛选出的菌株。使用含有尿嘧啶的YPD液体培养基(I质量％的酵母膏(东方酵母エ业(株式)会社制备)，2质量％的蛋白胨(日本制药(株式)会社制备)，2质量％的葡萄糖(国产化学(株式)会社制备)，6X 10_3的尿嘧啶(和光纯药エ业(株式)会社制备)，以下相同)，将亲株过夜培养。将培养的菌体分装在2支艾本德(印pendorf)离心管中，离心分离，并集菌。弃上清液，用无菌水洗涤2次，再将菌体悬浮于0.1M (mol/L,以下相同)磷酸缓冲液(pH7. 0)中。混合30iU甲基磺酸こ酯(EMS)，在30°C下震荡培养(incubate) I小吋。通过离心回收菌体，弃上清，再将菌体悬浮于200 Ul的5质量％硫代硫酸钠中。将悬浮液移到新的离心管中，离心回收,用200 ill的5质量％硫代硫酸钠洗净两次。再将菌体悬浮于ImL无菌水中，适度稀释后，涂布在YPD琼脂培养基上。——筛选——通过以下的一次至三次筛选，从经过所述人工诱导处理的酵母群中，筛选出具有免疫增强作用的酵母。作为一次筛选，进行细胞壁突变株的选择。在含有尿嘧啶的YPD琼脂培养基(I质量％的酵母膏、2质量％的蛋白胨、2质量％的葡萄糖、6X 10_3的尿嘧啶、2质量％的琼脂)、含有尿嘧啶的1/5YPD琼脂培养基(0. 2质量％的酵母膏、0. 4质量％的蛋白胨、0. 4质量％的葡萄糖、1. 2X10—3的尿嘧啶、2质量％的琼脂)、含有尿嘧啶的1/5YPD中加入0. 05%SDS的琼脂培养基上涂布菌体。在30°C下培养3天后，选择(I)含有尿嘧啶的YPD琼脂培养基与含有尿嘧啶的1/5YPD琼脂培养基比较时，在含有尿嘧啶的1/5YPD琼脂培养基上增殖较为缓慢，且(2)含有尿嘧啶的1/5YPD琼脂培养基与含有尿嘧啶的1/5YPD中加入0. 05%SDS的琼脂培养基比较时，在含有尿嘧啶的1/5YPD中加入0. 05%SDS的琼脂培养基上增殖较为缓慢的菌株(或者死亡的菌株)。一次筛选的结果，得到了 3120株突变体。作为二次筛选，根据用FITC标记ConA，而进行甘露聚糖的染色。利用牙签刮取菌落,并悬浮于加入1. OM山梨醇的PBS溶液中。离心回收,再悬浮于加入1. OM山梨醇的PBS溶液之后，混合到用FITC标记的ConA溶液(Sigma公司)中，在室温下遮光放置30分钟。洗净I次，利用荧光显微镜在蓝色激发光下观察菌体。由此，选择当整体观察时几乎看不到荧光的菌株，或者从照片上不能确认荧光的菌株。所述二次筛选的结果，从3120株选择了 4株(突变体广4)。图1为突变体广4的显微镜图像，上面的是光学显微镜图像，下面的是在甘露聚糖染色后观察的荧光显微镜图像。图1中，突变体广4几乎观察不到荧光，尤其突变体2 4完全观察不到荧光。另タ卜，突变体I 为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) FERM BP-11291,突变体2为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) FERM BP-11292,突变体3为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) FERM BP-11293,突变体 4 为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) FERM BP-11294。这些4株突变体均保藏在独立行政法人产业技术综合研究所，专利生物保减中心。作为三次筛选，检测突变体广4的巨噬细胞的活化作用。将突变体广4离心集菌，用こ醇处理后，用无菌水洗净2次。进ー步用RPM1-1640培养基洗浄一次后，再悬浮于RPM1-1640培养基中，用血细胞计数板对酵母进行计数。将酵母浓度调整到规定量，并作为样品。巨噬细胞使用自培养第2天的细胞。经过培养的巨噬细胞从培养烧瓶中回收，用新的培养基洗涤2次，再用血细胞计数板对细胞进行计数。将巨噬细胞的细胞浓度调整到规定量，并作为待检测活性的巨噬细胞培养液。将所述巨噬细胞培养液分装在24孔板中，并混合所述样品，使酵母与巨噬细胞的细胞数的比值成为30:1。将混合液在37 °C，5%CO2下培养6小时之后，用滴管取培养液，并离心。回收上清液，利用小鼠肿瘤坏死因子免疫检测试剂盒(Quantikine MouseTNF-a Immunoassay (R&D systems公司))检测上清液中含有的TNF-a蛋白质量。作为对巨曬细胞的活化作用的阳性对照，使用内毒素(Lipopolysaccharide(LPS, Wako公司))。图2为示出关于突变体f 4的巨噬细胞活化作用试验的结果的图。在图2中表现出突变体3、4相比于亲株具有非常强的巨噬细胞活化作用(免疫增强作用)。经过三次筛选的結果，从突变体广4的4株中选择了 2株(突变体3、4)。(实施例2)一低滲透压培养基中的増殖试验ー将实施例1中的突变体3作为样品使用，并且根据以下试验方法进行在低渗透压培养基中的増殖作用的试验。首先，将突变体3在含有尿嘧啶的YPDS液体培养基(I质量％的酵母膏(东方酵母エ业(株式)会社制备)、2质量％的蛋白胨(日本制药(株式)会社制备)、2质量％的葡萄糖(国产化学(株式)会社制备)、5.5质量％ (0.3M)的山梨醇(和光纯药エ业(株式)会社制备)，以下相同)中进行预培养。将经过预培养后的一部分培养液接种到含有尿嘧啶的YPD液体培养基以及含有尿嘧啶的YPDS液体培养基中，使OD66tl达0. 1，然后在30°C下振荡培养。并且，利用分光光度计来检测培养中的培养基的0D_，由此评价菌体数量随时间的变化(増殖)。并且，作为对照，使用亲株和专利公开公报2006-75039号中记载的根据基因重组技术制备的变异体(MCD4A )，并根据与突变体3相同的方法培养，评价菌体数量随时间的变化(増殖)。

图3A及图3B为示出关于突变体3和亲株的增殖试验的结果的图，图4为示出记载在专利公开公报2006-75039中的变异体(MCD4A株)的增殖试验的结果的图。从3A及图3B的结果可以看出，本发明的酵母(突变体3)在低渗透压的含有尿嘧啶的YPD液体培养基以及在调整过渗透压的含有尿嘧啶的YPDS液体培养基中均能够与亲株近乎相同地増殖。另外，从图4的结果可以看出，专利公开公报2006-75039号中记载的根据基因重组技术制备的变异体(MCD4 A )，虽然在调整过渗透压的含有尿嘧啶的YPDS液体培养基中较为快速増殖，但是在低渗透压的含有尿嘧啶的YPD液体培养基中增殖极其缓慢。(实施例3)-压榨鲜酵母的制备-使用实施例1中得到的突变体3而制备压榨鲜酵母。将在含有尿嘧啶的YMPD液体培养基(0. 3质量％的酵母膏、0. 3质量％的麦芽膏、
0.5质量％的蛋白胨、3质量％的葡萄糖、9X 10_3质量％的尿嘧啶)中培养的突变体3为种子酵母，进行流加培养。连续流加糖溶液(相当于添加糖浓度260g/L、尿素19. 49g/L、KH2PO4 52g/L的溶液)而进行培养。流加方法按照常规的方法进行。培养结束后，分离、水洗、过滤培养发酵液(broth)而得到压榨鲜酵母。(实施例4)一发酵カ试验ー将实施例3的压榨鲜酵母作为样品使用，并根据以下的试验方法对压榨鲜酵母的发酵カ的进行试验。根据酵母エ业会制定的酵母发酵カ測定方法，检测120分钟的气体发生量。结果表不在表Io[表I]1: 亲株 I突变体权利要求
1.ー种酵母，其特征在于，能够在渗透压为300m Osm的YPD液体培养基中增殖； 所述增殖是指，将YPDS培养基中预培养的一部分培养液向所述YH)液体培养基中添カロ，以使OD66tl达到0. 1，在30°C条件下培养时，培养24小时后的OD66tl达到1. 0以上， 细胞壁甘露聚糖少， 具有巨噬细胞活化作用， 该酵母是 Saccharomyces cerevisiae FERM BP-11294。
2.如权利要求1所述的酵母，其特征在于，未被基因重组。
3.含有如权利要求1至2中任意一项所述的酵母的食品或者饲料。
全文摘要
本发明涉及一种具有免疫增强作用的酵母及含有该酵母的食品或饲料。目的在于提供具有良好的安全性、即使直接摄取菌体也能起到较高的免疫增强作用、便宜且容易购得、食品制造中可以直接利用、并且在低渗透压下也能够培养的酵母，以及含有该酵母的食品。酵母的特征在于，细胞壁甘露聚糖少，具有免疫增强作用，能够在渗透压为300m Osm的YPD液体培养基中增殖。所述酵母优选为Saccharomyces cerevisiae FERM BP-11293以及Saccharomyces cerevisiae FERM BP-11294中的任意一种。
文档编号C12R1/865GK103060214SQ20121057994
公开日2013年4月24日 申请日期2008年12月10日 优先权日2007年12月10日
发明者东雅之, 立花太郎, 古川周平, 中岛亮一, 渡边肇, 小林纱由美 申请人:东方酵母工业株式会社, 东雅之