专利名称：采用环介导等温扩增技术检测猕猴桃溃疡病菌的方法
技术领域：
本发明属于植物细菌学技术领域，特别是涉及一种采采用环介导等温扩增技术检测猕猴桃溃疡病菌的方法。
背景技术：
我国是猕猴桃的主要产区，其种植面积和产量均居世界之首。陕西省的猕猴桃产量更是位居全国之首。猕猴桃溃疡病在我国猕猴桃的各大产区都有不同程度的发生，严重威胁猕猴桃的生产，被列为全国森林植物检疫对象。此病来势凶猛，是一种毁灭性病害，发生时不仅减低产量，而且导致果皮变厚，果味变酸，果实变小，果形不一，品质下降，商品价值降低，造成严重的经济损失。猕猴桃溃疡病的危害严重及防治困难，一直是猕猴桃生产和理论上的一个重要问题。目前很难找到一种有效的防治药物。目前普遍采用的检测猕猴桃溃疡病菌的方法主要有血清学方法、电镜技术和分子生物学检测等。但上述方法均存在不同的缺点，例如，所需试验周期较长、操作繁琐、灵敏度不高、特异性不强、准确性较低、易受检测材料限制等。环介导等温核酸扩增(Loop-mediatedi sothermalmplification, LAMP)技术是由T. Notomi发明的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖四条特异引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶,在等温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地扩增祀序列(Notomietal,2000)。迄今已建立了针对多种病原性细菌、病毒、真菌、寄生虫等的LAMP检测方法，在耐药性基因检测、家畜早期胚胎性别判定等方面也有相关报道。该方法应用范围广泛，适于基层实验室进行快速检测。本发明根据猕猴桃溃疡病菌16S基因设计了 LAMP引物，采用环介导等温扩增技术(LAMP)建立了一种快速、灵敏、高度特异的检测猕猴桃溃疡病菌的方法。为猕猴桃溃疡病的快速检测提供了新的手段。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种采用环介导等温扩增技术检测猕猴桃溃疡病菌的方法，其中该方法包括猕猴桃溃疡病菌DNA的提取，LAMP反应和实时浊度检测，从分子水平对猕猴桃溃疡病菌进行筛查和检测，所述LAMP反应采用如下三对引物中的任意一对引物组外引物(F3和 B3):SEQID NO.1 :5’ -CCGATTTTGGGTCTGTAGCT-3’ ；SEQID NO. 2 :5’ -GTAAGTGGTGGAGCCAAGC-3’ ；内引物(FIP和 BIP):SEQID NO. 3 :5’ -CGCGCTCTGACCAACTTCACCACCCCTGATAAGGGTGAGG-3’ ；SEQID NO. 4 5’ -TACGACACCCGGATACGGGGATCGAACCGCTGACCTCC-3’ ；环引物(LF 和 LB)SEQID NO. 5 :5’ -GGCAGATTCGAACTGCCGA-3’ ；SEQID NO. 6 :5’ -CCATAGCTCAGCTGGGAGA-3’。
优选地，上述方法中，所述LAMP反应采用上述全部3对引物组，即六条引物，SEQIDNO. 1-6。在一个具体的实施方案中，本发明所述的采用环介导等温扩增技术检测猕猴桃溃疡病菌的方法，其包括如下步骤I)溃疡病菌总DNA的提取提取猕猴桃溃疡病菌的总DNA ；2) LAMP 反应使用外引物SEQ ID NO. 1-2、内引物SEQ ID NO. 3-4和环引物SEQ IDN0. 5-6对溃疡病菌总DNA进行LAMP反应，得到扩增产物；3)浊度检测对扩增产物进行浊度观察，确定猕猴桃是否感染所述溃疡病菌。在一个具体的实施方案中，本发明所述的采用环介导等温扩增技术检测猕猴桃溃疡病菌的方法，其包括如下步骤
I)溃疡病菌的培养猕猴桃溃疡病菌在液体LB培养基中，26°C条件下培养12小时，取O. 5微升该液体直接用于检测；2) LAMP 反应使用外引物SEQ ID NO. 1-2、内引物SEQ ID NO. 3-4和环引物SEQ IDN0. 5-6对溃疡病菌的DNA进行LAMP反应，得到扩增产物；3)浊度检测对扩增产物进行浊度观察，确定猕猴桃是否感染所述溃疡病菌。在一个具体的实施方案中，在本发明上述的方法中，LAMP反应中使用的引物浓度比例为外引物SEQ ID NO. 1-2 内引物SEQ ID NO. 3-4 :环引物SEQ ID NO. 5-6 =1:8:4;在一个具体的实施方案中，在本发明上述的方法中，LAMP反应中的反应温度优选为 64 0C ；在一个具体的实施方案中，在本发明上述的方法中，LAMP反应中的Mg2+浓度优选为 6mM。猕猴桃溃疡病菌危害严重，本发明经过优化和摸索实验条件建立了检测猕猴桃溃疡病菌的方法，极大地提高检测效率，降低检测成本。本发明的方法具有快速、灵敏、高度特异性等特点。本发明的方法已经成功地应用于室内和田间猕猴桃溃疡病菌病害的检测。本发明证明了 LAMP是一种检测植物溃疡病菌的有效手段。
图1 :LAMP结果浊度观察，1:阳性，2 :阴性；图2A =LAMP反应最佳温度为64 °C ；图2B =LAMP反应最佳Mg2+浓度为6mM ；图2C =LAMP反应最佳DNTPS浓度为O. 8mM ；图2D =LAMP反应最佳betaine浓度为OmM ；
具体实施例方式为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但不限制本发明。为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但下述实施例并不限制本发明。材料与试剂猕猴桃健康枝条，感染溃疡病菌的枝条分别采自中国陕西杨凌、周至、眉县、岐山等地，采集枝条保存于4°C冰箱中。主要试剂Bst DNApolymerase 购自 NEB 公司；Betaine, MgS04 购自 Sigma 公司；Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司；大肠杆菌(Escherichia,coli) JM109, DNA 标准 Markerl 购自 Voson 公司；胶回收试剂盒购自Bioteke公司。实施例1 1.引物设计首先本发明人从NCBI上下载了猕猴桃溃疡病菌的ITS基因序列，使用Primer4. O (http://primerexplorer. jp/e/v4_manual/index, html)设计了多组弓丨物，然后根据引物所在序列区域的保守性、引物的发夹结构、二聚体GC含量以及Tm值等综合因素选择了每种病毒的引物。最后为猕猴桃溃疡病菌选择了 6条引物，包括2条外引物(F3和B3)、2条内引物(FIP和BIP)和两条环引物(LF和LB)。所述引物参见SEQ IDN0. 1-6。引物的信息见表I。表I引物序列SEQ IDN0. 1-6的信息
权利要求
1.一种采用环介导等温扩增技术检测猕猴桃溃疡病菌的方法，其中该方法包括猕猴桃溃疡病菌DNA的提取，LAMP反应和实时浊度检测，从分子水平对猕猴桃溃疡病菌进行筛查和检测，所述LAMP反应采用如下三对引物中的任意一对引物组外引物(F3和B3)SEQ ID NO.1 :5’ -CCGATTTTGGGTCTGTAGCT-3’ ；SEQ ID NO. 2 :5，-GTAAGTGGTGGAGCCAAGC-3，；内引物(FIP和BIP)SEQ ID NO. 3 :5’ -CGCGCTCTGACCAACTTCACCACCCCTGATAAGGGTGAGG-3’ ；SEQ ID NO. 4:5’ -TACGACACCCGGATACGGGGATCGAACCGCTGACCTCC-3’ ；环引物(LF和LB)SEQ ID NO. 5 :5’ -GGCAGATTCGAACTGCCGA-3’ ；SEQ ID N0.6 :5’ -CCATAGCTCAGCTGGGAGA-3’。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述LAMP反应采用全部3对引物组，即六条引物 SEQ ID NO. 1-6。
3.根据权利要求1所述的方法，所述的采用环介导等温扩增技术检测猕猴桃溃疡病菌的方法包括如下步骤1)溃疡病菌总DNA的提取提取猕猴桃溃疡病菌的总DNA ；2)LAMP 反应使用外引物SEQ ID NO. 1-2、内引物SEQ ID NO. 3_4和环引物SEQ IDN0. 5-6对溃疡病菌总DNA进行LAMP反应，得到扩增产物；3)浊度检测对扩增产物进行浊度观察，确定猕猴桃是否感染所述溃疡病菌。
4.根据权利要求1所述的方法，所述的采用环介导等温扩增技术检测猕猴桃溃疡病菌的方法包括如下步骤1)溃疡病菌的培养猕猴桃溃疡病菌在液体LB培养基中，26°C条件下培养12小时，取O. 5微升该液体直接用于检测；2)LAMP 反应使用外引物SEQ ID NO. 1-2、内引物SEQ ID NO. 3_4和环引物SEQ IDN0. 5-6对溃疡病菌的DNA进行LAMP反应，得到扩增产物；3)浊度检测对扩增产物进行浊度观察，确定猕猴桃是否感染所述溃疡病菌。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中LAMP反应中使用的引物浓度比例为外引物 SEQ ID NO. 1-2 :内引物 SEQ ID NO. 3-4 :环引物 SEQ ID NO. 5-6 =1: 8 : 4。
6.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中LAMP反应中的反应温度为64°C。
7.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中LAMP反应中的Mg2+浓度为6mM。
全文摘要
本发明涉及采用环介导等温扩增技术检测猕猴桃溃疡病菌的方法，其中该方法包括猕猴桃溃疡病菌DNA的提取，LAMP反应和实时浊度检测，LAMP反应采用六条引物SEQ ID N0.1-6，从分子水平对猕猴桃溃疡病菌进行筛查和检测，其中所述猕猴桃溃疡病菌采自陕西省，本发明根据猕猴桃溃疡病菌的ITS基因设计了LAMP引物，采用环介导等温扩增技术建立了一种快速、灵敏、高度特异的检测猕猴桃溃疡病菌的方法。为猕猴桃溃疡病菌的快速检测提供了新的手段。
文档编号C12Q1/68GK103045742SQ20121057989
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月27日 优先权日2012年12月27日
发明者赵磊, 郝兴安, 樊红科, 吴云锋 申请人:西北农林科技大学