专利名称：一种基于定向点突变的革兰阴性菌无疤痕基因敲除方法
技术领域：
本发明涉及革兰阴性菌基因敲除技术，尤其涉及的是一种基于定向点突变的革兰阴性菌无疤痕基因敲除方法。
背景技术：
革兰阴性菌是人和动物常见的病原细菌，肠杆菌科的大肠杆菌和沙门菌可引起人和动物不同的疾病，如腹泻、出血性肠炎等。而研究这些病原菌的毒力基因及其功能可为这些疾病的免疫防制奠定理论基础。基因敲除技术是研究基因功能的一种常用方法。常规的基因敲除技术是基于同源重组的双交换或者单交换，将靶基因用特定的标记基因(如抗性基因)替换，以达到完全去除靶基因的目的。但由于基因在染色体上是以双链的形式存在，当同源重组交换目的基因时，将目的基因的正反向链同时交换去除，因此获得的突变体实际上是两条单链的同时缺失，而突变体所表现出的表型也是正反两条单链上的基因共同缺失所表现出来的。所以，常规的同源重组基因敲除技术还需做回复突变以验证目的基因的功能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种基于定向点突变的革兰阴性菌无疤痕基因敲除方法。本发明的技术方案如下一种基于定向点突变的革兰阴性菌无疤痕基因敲除方法，以质粒pKD267为模板，选目的基因上下游各500 bp 处的序列50 nt加pKD267上的序列20 nt用以扩增质粒上的抗性基因(kan)和细胞死亡控制基因(ccdB)，采用电转法将PCR产物转化入目的菌，该目的菌已经被提前转入PKD46，并在30°C条件下，以阿拉伯糖诱导让其大量表达Red重组酶，以卡那抗性筛选阳性克隆。分别在目的基因上下游各500bp和目的基因开放阅读框内设计引物，同时在目的基因的开放阅读框引入点突变，使其起始密码和其互补链相应位置突变为AAA。进行两次PCR,引物5a-REC0-RED和IuxS-RECO-RED扩增IuxS上游500bp和IuxS基因，在起始密码ATG的互补链上引入点突变AAA。引物3a-REC0-RED和luxS_5a_RED扩增IuxS下游500bp和IuxS基因，在编码链起始密码ATG处引入点突变AAA。两次PCR产物混合后进行第三次PCR，获得的长片段，再利用同源重组技术，将PCR产物直接转化第一次的阳性克隆菌(此时的目的菌已经被提前转入PKD46，并在300C条件下，以阿拉伯糖诱导让其大量表达Red重组酶)，以鼠李糖培养基筛选阳性克隆；第三次 PCR 采用引物对5a-REC0-RED :5’ -CCCAAAGTCGGGAAAGATC-3’、3a-REC0_RED 5’ -CGAATTTGCGCCTCGGCATC-3’。由于细胞死亡因子启动子是鼠李糖诱导的，因此重组成功的克隆不含ccdB基因，可以在限制性培养基上生长，从而获得只有一条正向单链发生点突变的突变体，而其互补链上的基因序列除了引入的点突变外，未发生任何改变。
图1为本发明基于无疤痕突变的定向突变技术策略；图2为第一次插入突变菌落PCR鉴定结果；M DNA Marker ;泳道1_17 :待检菌落；泳道18 :SL1344野生株；图3为回复突变菌落PCR鉴定结果；M DNA Marker ;泳道1_10 :待检菌落；泳道
11:阳性对照；泳道12 :阴性对照；图4为A1-2实验结果。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。一、材料与方法1.菌株与培养条件所有的质粒保存在T0P10E. coli中，S. typhimurium SL1344作为突变的对象。带有PKD46的细菌培养在30°C，质粒去除及其它细菌培养在37°C。LB培养基用于常规的细菌培养，SOC培养基用于电转后的恢复培养基。抗生素浓度为氨苄青霉素100μ g/ml，卡那青霉素的浓度为50 μ g/ml ο2.质粒质粒pKD46 和 pKD267 (pKD267 公开文献Shoji M, Ratnayake D, Shi Y,KadowakiT, Yamamoto K, Yoshimura F, Akifumi A, Curtis M, and NakayamaK.Construction andcharacterization of a nonpigmented mutant of Porphyromonasgingivalis cell surfacepoIysaccharide as an anchorage for gingipains.Microbiology，2002，148 :1183-1191.)用于本研究。质粒 pKD46 编码 λ-Red 重组酶系统，它可介导线性DNA分子与染色体DNA的同源重组，同时包含一个氨苄抗性基因，为温度敏感型质粒，需要细胞维持在30°C。质粒pKD267用作模板扩增卡那霉素抗性基因盒和ccdB基因，后者用于后续的筛选。3. PCR 反应本发明中所有用于PCR反应的引物列于表I。50 μ L PCR体系中包含O.1 μ gDNA模板(可以采用纯化的基因组DNA、质粒DNA或PCR产物作模板)，IXPhusionDNA聚合酶缓冲液，5U Phusion DNA 聚合酶(Finnzymes), 1mM dNTPs (Sigma), 2 μ M 引物。所用 PCR 仪为Bio-Rad热循环仪。以PKD267为模板的扩增，条件为5个循环，每个循环94°C变性30s，53°C退火30s，72。。延伸2. 5min ;25个循环，每个循环94°C变性30s，65°C退火30s，72。。延伸2. 5min ；最后72°C延伸5min。其它PCR程序条件为98°C预变性30s ;35个循环，每个循环98°C变性10s，58°C退火30s，72°C延伸lmin/lkb ;最后72°C延伸lOmin。获得的PCR产物纯化后用50 μ l EB缓冲液洗脱后用于overlapping extension PCR,纯化后用于S. typhimuriumSL1344的电转。表1.引物序列
权利要求
1. 一种基于定向点突变的革兰阴性菌无疤痕基因敲除方法，其特征在于，包括以下步骤 Al，以质粒pKD267为模板，选目的基因上下游各500bp处的序列50nt加pKD267上的序列20nt用以扩增质粒上的抗性基因(kan)和细胞死亡控制基因(ccdB)，采用电转法将PCR产物转化入目的菌，该目的菌已经被提前转入PKD46，并在30°C条件下，以阿拉伯糖诱导让其大量表达Red重组酶，以卡那抗性筛选阳性克隆； A2，分别在目的基因上下游各500bp和目的基因开放阅读框内设计引物，同时在目的基因的开放阅读框引入点突变，使其起始密码和其互补链相应位置突变为AAA;进行两次PCR,引物5a-REC0-RED和IuxS-RECO-RED扩增IuxS上游500bp和IuxS基因，在起始密码ATG的互补链上引入点突变AAA ;引物3a-REC0-RED和luxS_5a_RED扩增IuxS下游500bp和IuxS基因，在编码链起始密码ATG处引入点突变AAA ； A3，步骤A2中的两次PCR产物混合后进行第三次PCR，获得的长片段，再利用同源重组技术，将PCR产物直接转化第一次的阳性克隆菌，以鼠李糖培养基筛选阳性克隆；第三次 PCR 采用引物对5a-REC0-RED :5’ -CCCAAAGTCGGGAAAGATC-3’、3a-REC0_RED 5’ -CGAATTTGCGCCTCGGCATC-3’。
全文摘要
本发明公开了一种基于定向点突变的革兰阴性菌无疤痕基因敲除方法，第一次PCR设计引物时，以质粒pKD267为模板，选目的基因上下游各500bp处的序列50nt加pKD267上的序列20nt用以扩增质粒上的抗性基因(kan)和细胞死亡控制基因(ccdB)；第二次PCR设计引物时，分别在目的基因上下游各500bp和目的基因开放阅读框内设计引物，同时在目的基因的开放阅读框引入点突变，使其起始密码和其互补链相应位置突变为AAA；两次PCR产物混合后进行第三次PCR，获得的长片段，再利用同源重组技术，将PCR产物直接转化第一次的阳性克隆菌，以鼠李糖培养基筛选阳性克隆。
文档编号C12N15/09GK103031299SQ201210578928
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者陈伟 申请人:塔里木大学