专利名称：以产甘油假丝酵母特征5.8S序列为整合位点的pURGAP载体构建及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含有表达系统的整合载体以及由该整合表达载体转化工业酵母细胞-产甘油假丝酵母；涉及蛋白质表达基因工程领域，尤其是利用产甘油假丝酵母作为细胞工厂表达外源基因的研究领域，属于微生物学，基因工程和分子生物学领域。
背景技术：
产甘油假丝酵母(Candida glycerolgenesis)是我国拥有自主知识产权的一株具有优良发酵性能的工业菌株，曾获得国家发明二等奖，能在55%葡萄糖或15% NaCl的高渗透压培养基上正常生长繁殖，具有耐高渗，目标产物高产量、高转化率、生产强度大的特点。C.glycerinogenes具有两个显著特性，即耐高渗透压(超高浓醪发酵，节省提取能耗)和葡萄糖代谢途径完备，是一个可基因改造、具有的很好应用前景的潜在节能型模式菌株，对其进行遗传改良和途径工程改造就必须建立高效的遗传转化体系。虽然常用的实验室酵母,如酿酒酵母S.cerevisiae的转化方法已经十分成熟,但这些方法用于工业酵母菌株的基因改造不理想，严重阻碍采用基因工程手段对产甘油假丝酵母代谢途径进行有目的的改造从而改进产甘油假丝酵母的性能，其主要原因是该工业酵母菌株的遗传背景复杂多样。 因此，这就需要根据工业酵母菌株自身的特点，如细胞壁结构、生理生化特性、遗传背景等，建立起相应的转化体系。实现建立起相应的转化体系这一目标首先要获得有效的载体，而构建酵母整合型载体的一项重要工作是获得整合位点。为建立有效的产甘油假丝酵母转化系统，本发明选择产甘油假丝酵母5.8S rDNA特征序列作为同源重组整合位点，构建适合于产甘油假丝酵母转化的整合载体，建立了一套高效、简单的产甘油假丝酵母转化系统。
发明内容
针对目前未见产甘油假丝酵母5.8S rDNA序列在产甘油假丝酵母表达载体中应用的现状。本发明利用产甘油假丝酵母的特征5.8S rDNA序列SEQ NOl构建产甘油假丝酵母整合表达载体如附
图1所示，获得了一种能够显著提高载体转化效率的载体。本发明提供了以C.glycerinogenes 5.8S rDNA序列SEQ NOl为整合位点的重组表达载体的构建，构建整合表达载体的具体步骤:1.产甘油假丝酵母部分核糖体DNA(ribosome DNA, rDNA)序列的克隆:引物rdnal、rdna2扩增产甘油假丝酵母特征5.8S rDNA，特征5.8S rDNA的序列见SEQ N01。rdnal:ACGGAGCTCGAAACTCCGT CGTGCrdna2:ACGAAGCTTTGCTTAAGTTCAGCGG ;序列见 SEQ NOl。2.整合载体的构建(PUC18作为基本骨架)如附图2 ;(I)将PCR获得的特征5.8S rDNA经Sac I和Hind III连到pUC18上，得到克隆载体 pUC-5.8S rDNA ；
(2)将PCR获得的启动子PCgeAP利用限制性内切酶Sac II和Nco I酶切后连接pUC-5.8SrDNA，得到载体 pUC_5.8S rDNA-PCgGAP ；(3)将PCR获得的zeocin抗性基因利用限制性内切酶Sal I和sph I酶切后连接于载体 pUC-5.8S rDNA-PCgGAP,即得到载体 pURGAP ；3.以线性化的同源整合载体转化产甘油假丝酵母，以zeocin抗性平板筛选阳性克隆子，并用PCR检测转化阳性克隆子。4.整合效果分析。对确认的阳性转化子菌落进行计数，计算整合效率。与其它同源整合载体相比，以SEQ N02所示的特征5.8S rDNA序列构建的整合载体pURGAP整合效率提高至其他方法的300%。5.本发明将构建的整合载体应用于外源基因在产甘油假丝酵母中的表达，表达载体pURGAP可效率高表达外源基因，能够加快高表达重组菌株的获得。通过实施本发明具体的技术方案，实现以下有益效果:通过构建含有特征5.8SrDNA序列SEQ N02的整合载体pURGAP，提高表达载体的整合效率，与其它同源整合载体相比以SEQ N02所示的特征5.8S rDNA序列构建的整合载体pURGAP整合效率提高至其他方法的300%,并实现了外源基因在C.glycerolgenesis成功表达,为进一步改造重要的工业菌株Candida glycerolgenesis提供了一种有效的方法。
具体实施方案以下的实施例可以使本专业技术领域的技术人员更全面的了解本发明，但本发明并不限于下述的实施例。 本发明所使用的菌种:产甘油假丝酵母Candida glycerolgenesis CCTCC M93018、Ε.coliDH5a。实施例1:PCR扩增产甘油假丝酵母5.8S rDNA序列以引物rdnal、rdna2扩增产甘油假丝酵母5.8S序列:rdnal:ACGGAGCTCGAAACTCCGT CGTGCrdna2:ACGAAGCTTTGCTTAAGTTCAGCGG ;序列见 SEQ NOl。实施例2:重组整合表达载体pURGAP的构建构建的重组表达载体(pUC18作为基本骨架)参见附图2:(I)将PCR获得的特征5.8S rDNA经Sac I和Hind III连到pUC18上，得到克隆载体 pUC-5.8S rDNA ；(2)将PCR获得的启动子PCgeAP利用限制性内切酶Sac II和Nco I酶切后连接pUC-5.8SrDNA，得到载体 pUC_5.8S rDNA-PCgGAP ；(3)将PCR获得的zeocin抗性基因利用限制性内切酶Sal I和sph I酶切后连接于载体 pUC-5.8S rDNA-PCgGAP,即得到载体 pURGAP ；实施例3:重组表达载体的转化和筛选通过构建的重组表达载体pURGAP重组质粒用热击方法转化E.coli DH5a扩增质粒。提取质粒，以HindIII线性化。采用原生质体转化法转化C.glycerinogenes,以0.7M的NaCl作为渗透压稳定剂，涂布含有zeocin的YETO抗性再生平板(1M山梨醇为再生稳定剂)。对转化的阳性转化子菌落计数，取三次重复的平均值，PURGAP的转化效率可达到3X102cell/ng质粒，而同样条件下其它以非SEQ N02所示的特征5.8S rDNA序列构建的整合载体转化效率只能达到IX 102cell/ng质粒，与其它同源整合载体相比以SEQ N03所示的特征5.8S rDNA序列构建的整合载体整合效率提高至其他方法的300%。实施例4:诱导外源荧光蛋白在产甘油假丝酵母中表达利用荧光基因gfp构建荧光蛋白表达载体pURGAP-gfp，构建过程参见附图3。所构建载体 pURGAP-gfp 转入宿主 Candida glycerolgenesis CCTCC M 93018,从含 150ug/mLzeocin的YEH)从平板上挑取阳性克隆，利用PCR确定阳性转化子，阳性转化子接种于IOmL含有150ug/mL zeocin的YETO液体培养基中。30°C培养20h，离心收集菌体，转接入IOmL含25%葡萄糖的YEPD液体培养基中。30°C培养24h，摇床转数200r/min。离心后获得菌体。利用Olympus荧光显微镜对所获得的菌体进行荧光分析。可以看到绿色荧光蛋白在宿主Candida glycerolgenesis CCTCC M 93018的高表达,与其它同源整合载体相比，以SEQ N02所示的特征 5.8S rDNA序列构建的整合载体荧光蛋白表达强度增强明显(图4)。
序列表
SEQ N0.l:1GAAACTCCGT CGTGCTGGGG ATAGAGCATT GTAATTTTTG CTCTTCAACG AGGAATTCCT
61 AGTAAGCGCA AGTCATCAGC TTGCGTTGAT TACGTCCCTG CCCTTTGTAC ACACCGCCCG121 TCGCTACTAC CGATTGAATG GCTTAGTGAG GCTTCAAGAT TGGCGCCGCG GGAGGGGCAA181 CTTrTCCCATG GGGCCGAGAA TCTAGTCAAA CTTGGTCATT TAGAGGTCGT AAAAGTCGTA241 ACAAGGTTTC CGTAGGTGAA.CCTGCGGAAG GATCATTACT GTGATTTAGT ACTACACTGC301 GTGAGCGGAA CGAAAACAAA AACACCTAAA ATGTGGAATA TAGCATATAG TCGACAAGAG361 AAATCTACGA AAAACAAACA AAACTTTCAA CAACGGATCT CTTGGTTCTC GCATCGATGA421 AGAGCGCAGC GAAATGCGAT ACCTAGTGTG AATTGCAGCC ATCGTGAATC ATCGAGTTCC481 TGAACGCACA TTGCGCCCCT CGGCATTCCG GGGGGCATGC CTGTTTGAGC GTCGTTTCCA541 TCTTGCGCGT GCGCAGAGTT GGGGGAGCGG AGCGGACGAC GTGTAAAGAG CGTCGGAGCT601 GCGACTCGCC TGAAAGGGAG CGAAGCTGGC CGAGCGAACT AGACTTTTTT TCAGGGACGC661 TTGGCGGCCG AGAGCGAGTG TTGCGAGACA ACAAAAAGCT CGACCTCAAA TCAGGTAGGA721 ATACCCGCTG AACTTAAGCA
SEQ N0.2:
上游同源臂:
1GAAACTCCGT CGTGCTGGGG ATAGAGCATT GTAATTTTTG CTCTTCAACG AGGAATTCCT
61 AGTAAGCGCA AGTCATCAGC TTGCGTTGAT TACGTCCCTG CCCTTTGTAC ACACCGCCCG121 TCGCTACTAC CGATTGAATG GCTTAGTGAG GCTTCAAGAT TGGCGCCGC
下游同源臂:
C CTGTTTGAGC GTCGTTTCCA
541 TCTTGCGCGT GCGCAGAGTT GGGGGAGCGG AGCGGACGAC GTGTAAAGAG CGTCGGAGCT601 GCGACTCGCC TGAAAGGGAG CGAAGCTGGC CGAGCGAACT AGACTTTTTT TCAGGGACGC661 TTGGCGGCCG AGAGCGAGTG TTGCGAGACA ACAAAAAGCT CGACCTCAAA TCAGGTAGGA721 ATACCCGCTG AACTTAAGCA
权利要求
1.一种重组表达载体pURGAP的构建，其特征在于一种能利用同源重组表达外源基因的产甘油假丝酵母整合载体如附图1所示。
2.如权利要求1所述的产甘油假丝酵母整合载体以特征5.8S rDNA序列SEQ NOl为整合位点ο引物rdnal、rdna2扩增5.8S序列:rdnal:ACGGAGCTCGAAACTCCGT CGTGCrdna2:ACGAAGCTTTGCTTAAGTTCAGCGG0 以特征5.8S rDNA序列SEQ N02作为同源整合臂，可提高整合载体的转化效率和表达强度。
3.如权利要求1所述所构建的pURGAP载体，其特征在于包含有渗透压启动子PegeAP、zeocin抗性标记和在大肠杆菌高拷贝的所有元件。
4.权利要求1所述的整合载体特征是包含渗透调控的重组整合表达载体、克隆载体及穿梭载体。
5.权利要求1所述载体应用于渗透压调控外源基因表达、功能基因的稳定表达或过表达功能基因的筛选及鉴定。 应用于产甘油假丝酵母高代谢工程改造。
全文摘要
本发明公开了一种能用同源重组来克隆的产甘油假丝酵母整合载体pURGAP的构建及其应用。所构建的pURGAP载体包含有酵母Candida glycerinogenes的通过构建带有5.8S rDNA序列SEQ NO.2，可整合于酵母Candida glycerinogenes特征5.8S序列SEQ NO.1位点，所构建的pURGAP载体还包含有渗透压启动子PCgGAP、zeocin抗性标记和在大肠杆菌高拷贝的所有元件。与其它整合载体相比，pURGAP以特征5.8S rDNA序列为整合位点可显著提高整合载体转化效率，并明显增强外源蛋白表达强度。所构建的pURGAP可有效地将外源基因或启动子在产甘油假丝酵母中进行整合表达，是提高表达载体的整合效率，加速工业菌株产甘油假丝酵母重组改造速度的一种重要方法。
文档编号C12N1/19GK103173483SQ20121057874
公开日2013年6月26日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者诸葛斌, 张 成, 方慧英, 诸葛健, 宗红 申请人:江南大学