专利名称：一种鼠李糖乳杆菌及其培养和微胶囊方法
一种鼠李糖乳杆菌及其培养和微胶囊方法技术领域
本发明提供的是一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus LC-STH-13)及其培养和微胶囊方法。
背景技术：
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosusLC-STH-13)属于乳杆菌属，短小的杆菌；不运动，无芽孢，无质粒，革兰氏染色阳性；兼性厌氧菌，生长温度范围2 53°C，最适温度一般是30 40°C;耐酸，最适pH通常为5. 5 6. 2 ;—般在pH5或更低的情况下可生长。 上世纪80年代，由两位美国科学家Gorbach和Goldin从健康人的肠道中分离而得,并命名为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus GG)LGG。近年来,大量的动物实验和人体临床实验证明LGG具有相当多的生理功能和自身优势，是目前全球研究最多的益生菌之一。
鼠李糖乳杆菌的生理生化特征在糖发酵中，苦杏仁苷、阿拉伯糖、纤维二糖、七叶灵、果糖、半乳糖、葡萄糖、葡糖酸盐、乳糖、麦芽糖、甘露醇、甘露糖、松三糖、鼠李糖、核糖、水杨苷、山梨醇、蔗糖、海藻糖均能被发酵，密二糖、绵子糖、木糖不能被发酵；精氨酸产 NH3 ;乳酸旋光性为L ;15°C能生长；肽聚糖类型为Lys-DAsp ;鼠李糖乳杆菌的DNA的鸟嘌呤 (G) +胞嘧啶(C)的含量为45 47% ;极少见硝酸还原反应，只有PH值最终平衡在6. O以上时才能还原硝酸盐；不液化明胶；不分解酪素，但大多数菌株能产生少量的可溶性氮；不产吲哚和H2S ;接触酶阴性；无细胞色素，极少数菌株以假接触酶分解过氧化物；联苯胺反应阴性。
鼠李糖乳杆菌的生理功能LGG具有显著生理功能，可归纳为以下六方面
1.平衡肠道菌群，抑制腹泻的功能肠道微生态平衡是指肠道中正常菌群与宿主在不同的发育阶段的动态的生理性组合状态。由于肠道微生态平衡失调，即菌群失调而引起肠道功能紊乱，出现腹泻等症状在临床上屡见不鲜。近年来新的广谱抗生素不断出现，再加上抗生素滥用、工作压力大、饮食不健康等多种因素的共同影响，肠道菌群平衡受到了极大的挑战，大量的研究人员对此进行了深入的研究。Siitonen等报道了以LGG发酵的酸奶对由抗生素引起的腹泻的治疗作用。Hilton等通过对美国去亚洲、东非、南美等地的旅行者腹泻发病情况进行研究，发现每天口服LGG胶囊可预防旅行腹泻的发生，并且发现LGG对从未发生旅行腹泻者更为有效。Kaila等对患有轮状病毒引起腹泻的29名5 28月婴儿分别口服含LGG的制剂和普通牛乳，结果在服用LGG制剂的婴儿粪便中检出LGG菌株，说明即使是在宿主患急性胃肠炎 期间，LGG仍能够促进肠道菌群的平衡。Oberhelman等通过对 204名6 24月营养不良的婴儿临床实验发现，服用含LGG的制剂后腹泻时间缩短，粪便中的腺病毒明显减少，该疗效对非母乳喂养的婴儿更为显著，并证实了 LGG对秘鲁儿童急性腹泻具有明显的预防作用。与大多数研究不同的是，Sazawal等通过对34位不同年龄受试者服用LGG益生菌发现，在降低急性腹泻风险方面，LGG对儿童的效果(降低57% )高于成人(降低26% )，并提出LGG对急性腹泻的预防与患者年龄有一定的关系。
2.在肠道中定植和存活，增强胃肠道粘膜屏障的功能
益生菌只有通过定殖和存活于粘膜、皮肤等表面或细胞之间形成的生物屏障，竞争性地抑制病原菌的生长和阻止病原菌的侵入，同时通过防止毒素等的吸收和中和有毒产物。已有大量的实验论证了益生菌在肠道中定植和存活的特性。Kirjavainen等用不同益生菌对人体肠黏膜的结合能力测定发现，LGG对于婴儿和成年人，均有较高的黏着率。Alander 等让志愿者连续12天服用含有LGG乳清饮料后，对受试者肠道内容物和粪便样品进行检验，发现样品中都含有LGG囷株，这证实了 LGG能够在活体肠道内定植并存活。Lam等对患有胃溃瘍的小鼠以每天108cfu/day或109cfu/day的LGG持续3天进行灌胃实验,发现LGG 成功附着在胃粘膜上，尤其在溃疡部位的边缘定植，而且通过服用一定剂量的LGG，溃疡面积明显减少。实验发现，将LGG与不同益生菌的结合使用可以更好的抑制病原菌对肠粘膜的黏附，并提出可以通过对益生菌不同的组合来抑制目的病原体。Fang等将纯化和分离的 LGG分泌的蛋白作用于肠上皮细胞，发现LGG分泌蛋白可以通过特殊的路径促进肠上皮细胞的动态平衡，对因细胞因子引起的胃肠道疾病具有预防作用。
3.提高机体免疫力的功能
人体的免疫系统分为先天和适应性免疫系统，当有先天免疫系统无法识别入侵的微生物时，适应性免疫系统开始发生作用。二者共同构成了人体的免疫屏障。非特异性免疫在抵抗微生物侵袭中所起到的重要作用已越来越为人们所认同。已有实验表明，乳酸菌及其细胞壁成分能够促进人体外周血单个核细胞分泌肿瘤坏死因子、白细胞介素_6和白细胞介素-10，增强人体免疫力。Miettinen等在实验中发现，LGG与血液中细胞因子的反应能够抑制食物中革兰阴性致病菌引起的免疫功能失调，并诱导产生较多的肿瘤坏死因子、 白细胞介素_6和白细胞介素-10。Jeremy等报道了 LGG能够调节肿瘤坏死因子等细胞因子的分泌，其进行的鼠肠道微生物菌群体外实验结果显示，LGG能够防止巨噬细胞分泌过量的肿瘤坏死因子，起到预防和治疗结肠炎的作用，但并未发现对白细胞介素-10有明显影响，推测LGG可能通过分泌可溶性分子防止巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子。Rinne等对96名哺乳期的妇女服用LGG和安慰剂后，通过检测内脏微生物生态区、体液免疫反应、初乳可溶性CD14等状况，发现LGG和母乳喂养对分泌抗体细胞的数量有关系，提出母乳喂养期间服用LGG可以提高内脏的免疫性。
4.减少和消除体内和食物毒素的功能
体内 毒素积累来源于两条途径一是环境污染、食物毒化；二是体内代谢产物聚积。黄曲霉毒素主要存在于霉变的花生、谷物、果仁和大米等食物中，危害大，存在范围广。 大量的实验报道了 LGG对黄曲霉毒素BI具有很好的清除作用。Kankaanpa等也报道了 LGG 在Caco-2模型中对黄曲霉毒素的吸附作用。Klein等报道了 LGG对万古霉素具有抗性。 EL-Nezami等通过实验发现，LGG可以很好的去除普通镰刀酶毒素和单端胞酶烯(被认为与食物中毒性白细胞缺乏症、大骨节病、克山病三种地方病病因有关)。Hahtunen等的实验证实了 LGG能够去除食物中的重金属镉。家庭饮用水已经是生活中不可小觑的部分，健康的饮用水可以说是身体健康的根本，存在于淡水中的蓝藻可以释放微囊藻素，可以引起急性肝中毒，甚至癌症。Meriluoto通过实验发现LGG可以减少来自蓝藻缩氨酸微囊藻毒素，证实了摄入LGG益生菌可以减少因饮用水中的微囊藻素引起疾病的概率。
5.抑制肠道内有害菌生长的功能
Chen等报道了 LGG粘液素分泌的增加还可以减少轮状病毒对肠细胞的入侵。Mattar等报道LGG可以减少大肠杆菌在Caco_2单细胞模型中的迁移率，且LGG浓度越高， 大肠杆菌的迁移率就越低。次年，Mattar等又报道了 LGG可以通过增加粘液素的分泌而减少大肠杆菌在Caco-2和HT-29细胞模型中的粘附。Hudai等通过Caco_2或海拉(Hela)细胞模型研究表明LGG不会侵入肠细胞，而且可以减少鼠伤寒沙门氏菌的侵入。Vesterlund 等采用设计的肠道模型，通过分析肠道益生菌和致病菌对肠道的粘附以及其之间的相互关系发现LGG不影响鼠伤寒杆菌的定植和生存能力，相反鼠伤寒杆菌可以通过取代置换反应减少LGG的定植。Makras等采用Caco-2/TC7细胞模型对益生菌抗鼠伤寒杆菌SL1344活性动态分析发现，LGG抗菌活性只归因于其产生的乳酸。
6.其它功能
在预防龋齿方面的研究显示，研究者认为长期摄入含有LGG的牛奶可以降低儿童患频齿的风险。Bruzzese等通过实验发现LGG能够减少囊肿性纤维化病人的肺部恶化,提出益生菌可以延缓呼吸损伤，并且指出肠炎和肺炎之间存在一定的关联。Caropreso等发现 LGG可以改善肥胖」L童高转氨酶血症。
不同的益生菌具有不同的特点，同许多其它益生菌相比，LGG具有以下优势①全球研究最多、最彻底的益生菌之一。目前，LGG的研究文献是所有益生菌中最多的，其安全性和功能性均有大量的科学实验所证实。②低酸环境存活并可定殖于人体肠道。LGG忍受肠道环境(如胃酸、胆汁等)的能力优于普通酸奶菌种和其它一些益生菌菌种。实验证实，在 PH3. O条件下，LGG在胃中4小时活菌数几乎没有变化。LGG能够以存活状态通过人体胃部而进入肠道，并在肠道内定殖。③发酵过程仅产L-乳酸。LGG不能利用乳糖，但可利用一些单糖类，在发酵过程中，只会产生L-乳酸，而不会产生其它对产品口感有影响的酸类。④在产品保质期内活菌数保持稳定。研究表明，LGG在最终产品中的稳定性非常好。比如，LGG 酸奶在冷藏条件下，一个月的保质期内LGG活菌数几乎保持稳定。而一些其它的益生菌则在产品(比如酸奶)生产后数天内活菌数以几何级不断衰减。
LGG的应用范围十分广泛主要包括酸奶或其它发酵乳制品、牛奶、新鲜干酩、硬质干酪、婴儿食品、乳饮料或非乳饮料以及医药品，如胶囊、小包药片等。LGG在国际上的应用，1987年，芬兰维利奥公司获得了 LGG的全球唯一授权。1990年，维利奥有限公司推出了第一个含有LGG的发酵奶，除了一些传统产品的酸奶等发酵制品外，还包括果汁饮料、干酪、胶囊等。在芬兰，很多医院都使用LGG产品(乳制品和胶囊)。通常LGG用于那些免疫力十分低下的儿童，比如患有严重疾病或经过细胞毒素疗法或爱滋病患者及血液学病人等。通过授权的方式，维利奥有限公司与全球各个国家的公司进行合作。目前，LGG产品已在全球近40个国家和地区生产和销售，比如芬兰、美国、日本、韩国、法国、德国等。LGG在全球范围的成功归因于大量保健功能方面的科技文献以及菌株本身优异的技术特性。益生菌类产品及乳制品、在欧美、日本等一些国家已发展了很多年，而且深受广大消费者的青睐。发明内容
本发明的目的在于提供一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosusLC-STH-13)及其培养和微胶囊方法。
本发明的目 的是这样实现的
一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus LC-STH-13),该菌株保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为=CGMCC NO. 3994 ;分类命名 Lactobacillus rhamnosus LC-STH-13,保藏日期2012年7月8日，地址北京市朝阳区北辰西路I号院。
本发明还具有如下特征
1、所述的鼠李糖乳杆菌形态学特征为革兰氏阳性菌，菌体呈短杆状、不运动，无芽孢，菌落呈圆形、乳白色、边缘整齐、表面光滑、中心突起和质地均匀。
2、所述的鼠李糖乳杆菌的16S核糖体DNA(16S rDNA)全序列为如序列表SEQ IDNo.1。
3、如上所述的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus LC-STH-13)的培养方法如下，培养基配方葡萄糖10. 0-95. Og/L、酵母粉5. 0-55. 0g/L、牛肉粉5. 0-40. 0g/L、大豆蛋白胨 2. 0-50. 0g/L、KH2PO4 0. 5-5. 0g/L、无水乙酸钠 0. 1-5. 0g/L、柠檬酸铵 0. 1-3. Og/ L、吐温 800. 5-4. 0mL/L、MgSO4 · 7H20 0. 1-2. 0g/L、MnSO4 · 4H20 0. 2-1. 0g/L、乳清粉 10. 0-30. 0g/L、低聚果糖 10. 0-50. 0g/L、酪蛋白水解物 5. 0-25. 0g/L, ρΗ4· 5-6. 5，培养温度 32-37 °C，发酵时间为10-36h。
4、如上所述的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus LC-STH-13)的微胶囊方法，如下培养结束后，5000rpm离心，然后加入冻干保护剂进行微胶囊包埋，微胶囊包埋剂配方脱脂乳粉50. 0-200. 0g/L、甘油10. 0-50. 0g/L、海藻糖50. 0-200. 0g/L、Y -聚谷氨酸 10. 0-50. 0g/L;包埋剂与湿菌泥的比例为质量比1: 1，混合均匀后，进行冷冻干燥，制得冻干菌粉，冻干菌粉的活菌数彡1.0X101(lCfU/g。
本发明的优点
(I)本菌种生长周期短，繁殖速度快，产乳酸浓度高。
(2)能在肠道中定植和存活，增强胃肠道粘膜屏障的功能，具有改善胃肠道的功能，能抑制有害菌的定植。
(3)本菌种可在低酸环境存活，忍受肠道环境(如胃酸、胆汁等)的能力强并可定殖于人体肠道。可利用一些单糖类，发酵过程仅产L-乳酸。
(4)鼠李糖乳杆菌及其细胞壁成分能够促进人体外周血单个核细胞分泌肿瘤坏死因子，具有提闻机体免疫力的功能。
(5)经微胶囊包埋后，鼠 李糖乳杆菌抵抗不良环境的能力更强。
图1为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus LC-STH-13)平板培养特征图2 为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus LC-STH-13)显微镜图。
具体实施方式
下面举例对本发明作更详细的描述
实施例1
本实施例中所涉及的百分比均为重量百分比。
1.首先从正常成年人粪便中采集样品，将采样工具及各种采样容器进行灭菌，进行多点采样。
2.将采集的样品进行稀释将采集的某种样品在无菌条件下混合均匀，称取20克样品，溶解于IOOmL无菌水中，其中装有80-100粒玻璃珠，用力摇动10分钟，静止一分钟， 用ImL无菌吸管吸取ImL上清液，移入9mL无菌水试管中，彻底摇匀，然后再从这一稀释的样品中取出ImL样品再移入9mL无菌试管中，彻底摇匀，如此依次进行稀释，直至稀释到 10'
3.涂布分离从上述稀释的样品中用O.1mL无菌吸管分别取出O.1mL样品，移入BCP琼脂平板培养基中，用无菌三角刮棒，涂布均匀，每个稀释度做3个重复。BCP培养基配方(g/100mL):葡萄糖O. 5g、乳糖O. 5g、酵母浸粉O. 5g、琼脂1. 5 2. 0g、溴甲酹紫 (5g/100mL)1. OmL、自来水 IOOmL, pH 6· 8 7· O。
4.培养将涂布的平板置于37°C培养箱中倒置培养24小时,观察挑菌。
5.挑菌将黄色菌落或培养基周围变为黄色的菌落挑入试管斜面中，挑取200个菌落，然后再进行二次分离纯化，最后得到纯培养，从上述200株菌种中选出两株黄色圈最大者，进行紫外线照射诱变。
6.紫外线诱变初筛将其中两株菌分别在MRS培养基中进行培养12小时，取出离心，用无菌水洗涤两次，再用生理盐水稀释，用玻璃珠摇匀打碎，使细胞数达到107，在15W紫外灯下，距离IOcm照射3分钟，红光下操作，然后涂布于上述琼脂平板上，避光培养36小时。挑取黄色圈大的菌落，移入试管斜面中，挑取50株菌株。
7.复筛将50株菌种逐个进行培养产酸和凝乳性能测试，从其中筛选出2株性能最佳者，再进行诱变筛选，反复进行3次，最后得到一株最优良菌种LC-STH-13。
8.根据《伯杰氏鉴定细菌学手册》第9版，进行形态学、生理生化和16srDNA菌种鉴定。
菌落形态特征描述在MRS固体培养基上生长的单一菌落呈圆形、乳白色、边缘整齐、表面光滑、菌落中心突起、质地均匀。
菌种个体形态特征光学显微镜观察到，菌体呈短杆状、无芽孢、无运动性，革兰氏染色阳性。
经试验，初步确定该菌株为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus),菌株编号为 LC-STH-13 ο
9.然后将菌株LC-STH-13送到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行最后鉴定，鉴定结果如下表
中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心鉴定结果
权利要求
1.一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus LC-STH-13),该菌株保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCCN0. 3994。
2.根据权利要求1所述的一种鼠李糖乳杆菌(LactobacillusrhamnosusLC-STH-13),其特征在于所述的鼠李糖乳杆菌形态学特征为革兰氏阳性菌，菌体呈短杆状、不运动，无芽孢，菌落呈圆形、乳白色、边缘整齐、表面光滑、中心突起和质地均匀。
3.根据权利要求1所述的一种鼠李糖乳杆菌(LactobacillusrhamnosusLC-STH-13),其特征在于所述的鼠李糖乳杆菌的16S核糖体DNA(16S rDNA)全序列为如序列表SEQ IDNo.1。
·3.根据权利要求1所述的一种鼠李糖乳杆菌(LactobacillusrhamnosusLC-STH-13),其特征在于，培养方法如下，培养基配方为葡萄糖10. 0-95. Og/L、酵母粉5. 0-55. Og/L、牛肉粉 5. 0-40. 0g/L、大豆蛋白胨 2. 0-50. 0g/L、KH2PO4O. 5-5. 0g/L、无水乙酸钠 0. 1-5. Og/L、柠檬酸铵 0. 1-3. 0g/L、吐温 800. 5-4. 0mL/L、MgSO4 · 7H20 O. 1-2. 0g/L、MnSO4 · 4H200.2-1. 0g/L、乳清粉 10. 0-30. 0g/L、低聚果糖 10. 0-50. 0g/L、酪蛋白水解物 5. 0-25. 0g/L,pH 4. 5-6. 5，培养温度32-37 °C，发酵时间为10_36h。
4.根据权利要求3所述的一种鼠李糖乳杆菌(LactobacillusrhamnosusLC-STH-13)的微胶囊方法，其特征在于，方法如下培养结束后，5000rpm离心，然后加入冻干保护剂进行微胶囊包埋，微胶囊包埋剂配方脱脂乳粉50. 0-200. 0g/L、甘油10. 0-50. 0g/L、海藻糖·50. 0-200. 0g/L、Y-聚谷氨酸10. 0-50. 0g/L ;包埋剂与湿菌泥的比例为质量比I 1，混合均匀后，进行冷冻干燥，制得冻干菌粉。
全文摘要
本发明公开一种鼠李糖乳杆菌及其培养和微胶囊方法，该菌株保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCC NO.3994，其拉丁文命名为Lactobacillus rhamnosus LC-STH-13，形态学特征为革兰氏阳性菌，菌体呈短杆状、不运动，无芽孢，菌落呈圆形、乳白色、边缘整齐、表面光滑和中心突起。本发明还公开了该菌的16S核糖体DNA(16S rDNA)全序列。本发明的优点菌种生长周期短，繁殖速度快，产乳酸浓度高。能在肠道中定植和存活，增强胃肠道粘膜屏障的功能，具有改善胃肠道的功能，抑制有害菌的定植；经微胶囊包埋后，本菌抵抗不良环境的能力更强。
文档编号C12N11/04GK103031263SQ201210578720
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者梁金钟, 肖文娟 申请人:哈尔滨美华生物技术股份有限公司