专利名称：一种植物乳杆菌st-ⅲ耐盐基因的筛选方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域。更具体地，本发明涉及植物乳杆菌ST-1II (Lactobacillusplantarum ST-1II)耐盐基因的筛选方法。
背景技术：
乳酸菌(Lactic Acid Bacteria, LAB)是人类应用最早的细菌之一，长期以来，这些细菌一直用于生产动物(奶、肉、鱼等)和植物(蔬菜、酒等)发酵食品。乳酸菌在发酵过程中如发酵干酪、香肠、鱼、酱油、蔬菜以及食品保藏过程中会遇到高盐浓度，高盐浓度引起的高渗透环境会导致细胞在结构上和生理上的损伤。而植物乳杆菌ST-1II (Lactobacillusplantarum ST-1II)是从泡菜中分离出来的乳酸菌,其粘附性能强，具有清除胆固醇的益生特性，耐渗透能力强，甚至可以在含有8% NaCl的环境中生长。因此有必要了解植物乳杆菌ST-1II的耐盐机制，以便更好的利用其耐盐性能，挖掘其益生特性。目前对致病菌及嗜盐菌的耐盐机制研究较多，而对乳酸菌，特别是对乳酸杆菌的耐盐机制，尤其是结合高通量测序技术系统性发掘植物乳杆菌的耐盐基因比较少见。随着科学技术的不断发展，测序技术也迎来了新的发展，以Roche公司的454技术，Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的Solid技术为标志的新一代测序技术相继诞生并投入商业应用。其中Illumina/Solexa测序平台上的RNA-seq技术应用最广。由于其具有高通量、可重复性、检测范围宽、定量准确等特点，已经广泛应用于各种生物转录组的研究。在目前已经公开的文献与专利或专利申请中，例如CN 102409099A使用转录组学的方法对金华猪和大约克猪乳腺组织基因的差异表达进行了分析，为深入研究猪泌乳发育、泌乳过程中相关基因的功能和调控机制提供了基础材料。CN 102732527公开了一种基于转录组学的沙冬青抗旱基因的筛选方法，用于获得优良的沙冬青抗旱基因。CN102277416A全面准确的获得了亚洲玉米螟的全基因组转录本信息、功能基因表达量及代谢通路信息。但是，这些专利或专利申请没有完全涉及细菌，特别是益生乳酸菌的耐盐基因的筛选。因此，目前还需要一种有效的方法获得乳酸菌，特别是耐盐乳酸菌的耐盐基因。本发明获得的耐盐相关基因正是利用RNA-seq技术对植物乳杆菌ST-1II转录组进行深度测序所得。这对植物乳杆菌ST-ΙΠ耐盐基因的发掘，对其益生功能的进一步开发，及商品产业化都提供了基础及有效途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物乳杆菌ST- ΙΠ耐盐基因的筛选方法，能够迅速有效的筛选植物乳杆菌ST-1II的耐盐基因。为达到上述技术目的，本发明采用以下技术方案植物乳杆菌ST-1II (Lactobacillus pi ant arum ST-1II)耐盐基因的筛选方法，包括以下步骤
(I)收取在含盐及不含NaCl的培养基中生长的植物乳杆菌ST-1II菌体；(2)提取 RNA，纯化，rRNA 消除；(3)建库；(4)高通量测序；(5)获得差异表达序列；(6)检索及软件分析获得耐盐基因。上述植物乳杆菌ST- ΙΠ耐盐基因的分析中，所述步骤(I)中菌株在不含有盐及含有6% NaCl的培养基中生长到对数中前期时收集菌体，4°C离心，弃上清。上述植物乳杆菌ST- ΙΠ耐盐基因的分析中，所述步骤(2)中提取RNA包括以下步 骤(a)将适量植物乳杆菌ST-1II菌体用液氮研磨；(b)加入TRIzol研磨，放置至溶解；(c)以上述液体于无菌管中，加入三氯甲烷混匀，4°C离心，取上清；(d)加入异丙醇，4°C离心，弃上清；(e) 70%无水乙醇洗沉淀，4°C离心；(f)无酶水溶解；(g)琼脂糖凝胶电泳检测，Nanodrop定量，-80 °C储存。上述植物乳杆菌ST- ΙΠ耐盐基因的分析中所述步骤(C)重复两次；上述植物乳杆菌ST-1II耐盐基因的分析中所述步骤⑷测序后使用Bowtie软件将测序结果与原有基因组测序结果进行比对。上述植物乳杆菌ST-ΙΠ耐盐基因的分析中所述步骤(5)中获得的差异表达基因进行筛选，选取差异表达2倍以上的基因。上述植物乳杆菌ST- ΙΠ耐盐基因的分析中所述步骤(5) (6)中应用Cufflink软件对转录组进行差异表达分析。本发明选用植物乳杆菌ST-1II，由于其原始生境为含盐的环境，耐盐能力强，更有利于研究其耐盐基因。本发明采用RNA-seq技术对植物乳杆菌ST-1II转录组进行测序、分析，确定其耐盐基因，能够全面、准确的筛选耐盐基因，对研究植物乳杆菌ST-1II耐盐的机制提供了基础。也为基因工程手段改造乳酸菌从而提高乳酸菌的耐盐能力提供了方向和靶点。以上概括的描述了本发明，可通过参照本文提供的某些具体实例进一步理解本发明，这些实施例仅是为了进一步说明本发明的内容，不应理解为对本发明的限制。
图1、转录组数据分析流程示意图。
具体实施例方式针对目前植物乳杆菌耐盐机制分子信息的匮乏，首次采用RNA-seq技术发掘到植物乳杆菌ST-ΙΠ耐盐基因，并得到植物乳杆菌ST-1II在不含NaCl及含有6% NaCl的培养基中培养时基因表达的转录本。下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。
本发明植物乳杆菌ST- ΙΠ耐盐基因的筛选方法较佳依次包含以下步骤1、实验材料处理(I)将植物乳杆菌ST-1II在化学成分确定培养基(CDM)固体平板上划线，37°C倒置培养至长出单菌落，挑单个菌落接种到液体CDM培养基，37°C静置培养12h ；(2)上述培养液以2%接种量接种到含有6% NaCl的液体CDM培养基，37 °C静置培养，每小时取样测0D600，以此制作生长曲线确定各个条件下菌体生长到对数中前期的时间；(3)将步骤I中的培养液以2%接种量接种到含有200mL不含NaCl及含有6%NaCl的液体CDM培养基中，菌体生长到对数中前期取样，4°C，7000rpm离心5min，迅速放入 液氮中冻存备用。2.植物乳杆菌ST-1II总RNA提取(I)将适量植物乳杆菌ST-1II菌体用液氮研磨；(2)加入ImL TRIzol研磨后放置至溶解；(3)以上述液体移入无菌管中，加入1/3体积的三氯甲烷，混匀，4°C，12000rpm离心15min,取上清,重复此步骤；(4)加入等体积异丙醇,静置15min,4°C, 12000rpm离心15min,弃上清；(5) 70%无水乙醇洗沉淀,4°C, 12000rpm 离心 15min ；(6)无酶水溶解；(7)琼脂糖凝胶电泳检测，Nanodrop定量，_8(TC储存。3.纯化总RNA、消除rRNA及文库构建纯化总RNA试剂盒购自QIAGEN公司，消除rRNA试剂盒购自Epicentre公司，文库构建试剂盒购自Illumina公司，具体步骤依照试剂盒说明书进行。4. RNA-seq将建好的文库以5_7pM的浓度加到Illumina测序仪(Genome analyzer II )相应的上样通道上，运行35个循环。5.数据分析简要流程见图1。Illumina-Solexa生成的原始reads通过TopHat与植物乳杆菌ST-1II的基因组序列进行比对，然后用Cufflink计算基因的表达量。6.测序结果分析通过RNA-seq技术获得了植物乳杆菌ST_ III转录本的信息，共得到了包括3038个序列及在不含NaCl和含有6% NaCl培养基培养下的基因表达量的信息,部分序列列举如下表I植物乳杆菌ST-1II部分基因的表达量、功能注释
权利要求
1.一种植物乳杆菌ST-1II (Lactobacillus pi ant arum ST-1II)耐盐基因的筛选方法，其特征在于包括以下步骤 (1)收集在含盐及不含盐的培养基中生长的植物乳杆菌ST-1II菌体； (2)提取RNA，纯化，rRNA消除； (3)建库； (4)高通量测序； (5)获得差异表达序列； (6)检索及软件分析获得耐盐基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(I)中植物乳杆菌ST-1II在不含有盐及含6%的NaCl的培养基中生长到对数中前期时收集菌体，4°C离心，弃上清。
3.根据权利要求1所述的方法，特征在于，所述步骤(2)中提取RNA包括以下步骤 (a)将适量植物乳杆菌ST-1II菌体用液氮研磨； (b)加入TRIzoI研磨，放置至溶解； (c)以上述液体于无菌管中，加入三氯甲烷混匀，4°C离心，取上清； (d)加入异丙醇，4°C离心，弃上清； (e)70%无水乙醇洗沉淀，4°C离心； (f)无酶水溶解； (g)琼脂糖凝胶电泳检测，Nanodrop定量，_80°C储存。
4.根据权利要求3所述的方法，特征在于所述步骤(c)重复两次。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(4)测序后使用TopHat软件将测序结果与参考基因组测序结果进行比对。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(5)中获得的差异表达基因进行筛选，选取差异表达2倍以上的基因。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(5)(6)中应用Cufflink软件对转录组进行差异表达分析。
全文摘要
本发明涉及一种植物乳杆菌ST-Ⅲ(Lactobacillus plantarum ST-Ⅲ)耐盐基因的筛选方法。本发明采用植物乳杆菌ST-Ⅲ为材料，运用RNA-seq技术进行转录组测序分析，快速全面的筛选植物乳杆菌ST-Ⅲ的耐盐基因，对植物乳杆菌ST-Ⅲ耐盐机制、益生性能及产品开发具有重要的指导意义。
文档编号C12Q1/68GK103014166SQ201210578410
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者陈卫, 赵山山, 张秋香, 刘小鸣, 陈臣, 张灏 申请人:江南大学