包含雄性育性序列的组合物和方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物分子生物学领域，更具体地讲，涉及影响雄性育性。
[0002] 对以电子方式提交的序列表的引用
[0003] 通过EFS-Web以电子方式将序列表的正式文本作为ASCII格式的序列表提交，该 文件名称为5282-PCT_ST25. txt，最后修改日期为2013年9月6日，文件大小为42KB，并且 该文件与本说明书同时提交。该ASCII格式文档中所含的序列表是本说明书的一部分，并 且全文以引用的方式并入本文。
【背景技术】
[0004] 杂交植物育种的发展已使产生的作物在质量和数量方面取得相当大的进展成为 可能。由于经过了杂交程序，故产量增加，所需特性的组合如对病害和虫害的抗性、耐热性 和耐旱性，以及植物组成发生变化都可能出现。这些程序在很多情况下主要依赖于提供向 雌性亲本贡献花粉的雄性亲本以产生所得的杂交体。
[0005] 大田作物通过利用植物的授粉方法的技术进行育种。如果来自植物的一朵花的花 粉转移到同一植物或遗传上相同的植物的同一朵花或另一朵花，则植物自花授粉。如果花 粉来自遗传上不同的植物的花，则植物异花授粉。
[0006] 在某些物种中，诸如芸苔（Brassica campestris)，植物通常自花不育，并且只能 够异花授粉。在自花授粉的物种中，诸如大豆和棉花，雄性和雌性植株在解剖学上是雌雄同 株的。在自然授粉过程中，一朵花的雄性繁殖器官给同一朵花的雌性繁殖器官授粉。
[0007] 普通小麦（Triticum aestivum)是具有限定基因组A、B和D的三对同源染色体的 六倍体植物。小麦籽粒的胚乳包括来自母本细胞的2个单倍体补体和来自父本细胞的1个 单倍体补体。小麦籽粒的胚包括来自母本细胞和父本细胞中的每一者的一个单倍体补体。 六倍性被认为是研宄和开发小麦的有用变体的过程中的重大障碍。实际上，人们对小麦的 同源基因如何相互作用、如何调控这些同源基因的表达、以及由同源基因产生的不同蛋白 质如何独立或协同地发挥作用方面知之甚少。
[0008]用遗传性雄性不育体系进行的大部分工作的必要方面是识别影响雄性育性的基 因。这种基因可以在包括本文所述的那些体系在内的多种体系中使用以控制雄性育性。
【发明内容】
[0009] 本发明提供了用于调节植物中的雄性育性的组合物和方法。组合物包含调节雄性 育性的核苷酸序列，及其活性片段和变体。本发明还提供了表达盒，该表达盒包含有效连接 到启动子的雄性育性多核苷酸、或其活性片段或变体中的一者或多者，其中所述多核苷酸 的表达调节植物的雄性育性。本发明还提供了各种方法，其中影响雄性育性的多核苷酸的 水平和/或活性在植物或植物部分中得到调节。
[0010] 附图简述
[0011] 图1示出小麦MS26基因，即A基因组（SEQ ID N0:28)、B基因组（SEQ ID N0:29) 和〇基因组（5￡〇10勵：30)，较之玉蜀黍的1^26直系同源基因（5￡〇10勵：31)、高粱的 MS26直系同源基因（SEQ ID N0:32)和水稻的MS26直系同源基因（SEQ ID N0:33)横跨 MS26+靶标位点（SEQ ID N0:21)进行的比对。
[0012] 图2示出本文所述的由MS26+归巢核酸内切酶诱导的NHEJ(非同源末端连接）突 变的比对。所述突变通过深度测序进行鉴定。参考序列示出未经修饰的基因座，基因组靶 标位点以下划线表示。还指示了预期的切割位点。由于不完美的NHEJ导致的缺失以 示出。参考序列对应于Fielder小麦Ms26(SEQ ID N0:34)。
[0013] 图3示出本文所述的由MS26+归巢核酸内切酶诱导的NHEJ突变的类型。所述突 变通过对DNA载体中的亚克隆PCR产物进行测序来鉴定。MS26等位基因标号1、2和3很可 能分别指小麦基因组拷贝D、A和B。
[0014] 图4示出由MS26+归巢核酸内切酶诱导的NHEJ突变的比对。顶部序列是与示出未 经修饰的基因座的参考序列（SEQ ID N0:45)进行比较的MS26靶标位点（SEQ ID N0:21)。 由于不完美的NHEJ导致的缺失以示出，而空位代表SEQ ID NO :50中的C核苷酸插入。 所述突变通过对DNA载体中的亚克隆PCR产物进行测序来鉴定。
【具体实施方式】
[0015] 下文将结合附图更详细地描述本发明，附图中只显示了本发明的一些实施例，而 非全部实施例。事实上，这些发明可以多种不同形式呈现，且不应理解为受限于本文陈述的 实施例；更确切地说，提供这些实施例以使得本公开将满足适用的法律要求。类似的编号在 全文中是指类似的要素。
[0016] 借助前面的描述和随附的附图中给出的教导，本发明所属领域的技术人员将会想 到本文所述的发明的许多修改形式和其他实施例。因此，应当了解，本发明不限于所公开的 特定实施例，并旨在将修改形式和其他实施例包括在所附权利要求的范围内。虽然本文中 采用特定术语，但所述术语仅在一般性和描述性意义上使用而并非用于限制目的。
[0017] I.雄件育件多核苷酸
[0018] 本文所公开的组合物包含影响雄性育性的多核苷酸和多肽。具体地讲，提供了分 离的多核苷酸，其包含编码SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16或18示出的氨基酸序列或它 们的活性片段或变体的核苷酸序列。还提供了具有由本文所述的多核苷酸编码的氨基酸序 列的多肽，所述多核苷酸例如SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15或17示出的那些或它们的 活性片段或变体。
[0019] 有性繁殖植物发育出特用于产生雄性配子和雌性配子的特化组织。雄性配子的成 功产生依赖于雄性繁殖组织的正确形成。体现植物的雄性繁殖器官的雄蕊包含各种细胞类 型，包括例如花丝、花药、绒毡层和花粉。如本文所用，"雄性组织"是指有性繁殖植物中的负 责产生雄性配子的特化组织。雄性组织包括但不限于雄蕊、花丝、花药、绒毡层和花粉。
[0020] 成熟花粉粒形成的过程始于小孢子发生，其中性母细胞形成于花药的造孢组织 中。随后是小配子发生，其中小孢子以有丝分裂的形式分裂，随后发育成小配子体或花粉 粒。"雄性育性"或"雄性能育的"的状态是指产生成熟花粉粒的那些植物，所述成熟花粉粒 能够使雌性配子受精以产生后代。如本文所用，术语"影响雄性育性"或"调节雄性育性"是 指在与合适的对照比较时植物产生成熟花粉粒的能力的任何增强或下降。"成熟花粉粒"或 "成熟花粉"是指任何能够使雌性配子受精以产生后代的花粉粒。同样，术语"雄性育性多 核苷酸"或"雄性育性多肽"是指调节雄性育性的多核苷酸或多肽。雄性育性多核苷酸可例 如编码参与小孢子发生或小配子发生的过程的多肽。
[0021] 本文所公开的雄性育性多核苷酸包括被证实影响雄性育性的多核苷酸的同源物 和直系同源物。例如，本文所公开的雄性育性多核苷酸及其活性片段和变体包括Ms22 (也 称为Mscal)的同源物和直系同源物。Ms22的诱变研宄得到了表型为雄性不育的玉蜀黍植 物，其花药不从穗伸出并且缺乏造孢组织。West and Albertsen(1985)Maize Newsletter 59 :87 (West和Albertsen，1985年，《玉蜀泰时事通讯》，第59卷，第87页）；Neuffer et al. (1977)Mutants of maize. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，NY (Neuffer等人，1977年，《玉蜀黍突变体》，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港）。
[0022] 缺乏Ms22表达的植物在繁殖组织发育早期表现出生理改变。据信，Ms22在另一 种发育中具有作用，该作用的出现早于Ms45或Ms26的作用。某些雄性不育基因诸如MACl、 EMSl 或 GNE2(Sorensen et al. (2002)Plant J.29:581-594(Sorensen 等人，2002 年，《植物 杂志》，第29卷，第581-594页））阻止四分孢子阶段中的细胞生长。SP0R0CYTELESS/N0ZZLE 基因中的突变在发育早期起作用，但不仅影响花药形成而且影响胚珠形成，使得植物为雄 性不育和雌性不育。拟南芥（Arabidopsis)的SP0R0CYTELESS基因是孢子发生的起始所必 需的，并且编码新型的核蛋白（Genes Dev. 1999Aug 15 ;13(16) :2108-17(《基因和发育》， 1999年8月15日，第13卷，第16期，第2108-2117页））。由于Ms22对于小孢子发生的进 展至关重要，所以与其他雄性不育突变构建体相比，在Ms22突变体中维持雄性非常可靠。 如本文别处所公开，来自小麦的Ms22多核苷酸由SEQ ID NO :1、3和5示出。
[0023] 另外的雄性育性多核苷酸包括Ms26多核苷酸及其同源物和直系同源物。已报 道Ms26多肽与存在于酵母、植物和哺乳动物中的P450酶具有显著同源性。P450酶已被 广泛地研宄并且特征性蛋白结构域已被阐明。Ms26蛋白质包含真核P450蛋白质的若干 结构基序特征，包括血红素结合结构域FxxGxRxCxG(结构域D ;SEQ ID NO :19)、结构域A A/GGXD/ETT/S (双氧结合结构域；SEQ ID NO :20)、结构域B (类固醇结合结构域）和结构 域C在内。系谱树分析表明，Ms26与存在于拟南芥（Arabidopsis thaliana)和救荒野豌 豆（Vicia sativa)中的脂肪酸《羟化所涉及的P450最密切相关。参见例如美国专利公 布No. 2012/0005792,该专利公布以引用的方式并入本文。如本文别处所公开，来自小麦的 Ms26多核苷酸由SEQ ID NO :7、9和11示出。
[0024] 本文所公开的另外的雄性育性多核苷酸及其活性片段和变体还可包括Ms45多核 苷酸的同源物和直系同源物。Ms45多核苷酸是在玉蜀黍中得到表征的雄性育性多核苷酸。 在小孢子空泡化期间，Ms45的突变可导致小孢子发生出现中断，从而致使突变的植物雄性 不育。当克隆的玉蜀黍Ms45多核苷酸被引入到此类突变的雄性不育植物中时，该基因可与 所述突变互补并赋予雄性育性。如本文别处所公开，来自小麦的Ms45多核苷酸由SEQ ID NO :13、15 和 17 示出。
[0025] 操纵雄性育性多核苷酸在小麦中的表达的策略将需要考虑各个小麦品种的倍性 水平。普通小麦是包含被指定为A、B和D的三个基因组的六倍体（N =21);每个基因组 包含七对非同源染色体。一粒小麦品种是二倍体（N =7)，而二粒小麦品种是四倍体（N = 14) 〇
[0026] 本文公开了分离的或实质上纯化的核酸分子或蛋白质组合物。"分离的"或"纯 化的"核酸分子、多核苷酸、或蛋白质、或它们的生物活性部分，实质上或基本上不含通常 在该多核苷酸或蛋白质的天然环境中存在的、与该多核苷酸或蛋白质相伴随或相互作用的 组分。因此，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白质，当通过重组技术产生时基本上不含其他 细胞物质或培养基，或者当通过化学法合成时基本上不含化学前体或其他化学品。最优的 是，"分离的"多核苷酸不含在得到该多核苷酸的生物体的基因组DNA中天然位于该多核苷 酸的旁侧的序列（即，位于该多核苷酸的5'和3'末端的序列）（最佳的是蛋白质编码序 列）。例如，在各种实施例中，分离的多核苷酸可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0. 5kb 或0.1 kb的在衍生该多核苷酸的细胞的基因组DNA中天然位于该多核苷酸的旁侧的核苷酸 序列。基本上不含细胞物质的蛋白质包括具有小于约30%、20%、10%、5%或1%(以干重 计）的污染性蛋白质的蛋白质制备物。当本文所公开的多肽或其生物活性部分用重组法产 生时，最佳的是，培养基具有少于约30%、20%、10%、5%或1% (以干重计）的化学前体或 非目的蛋白质的化学品。
[0027] "受试植物"或"受试植物细胞"是其中已针对目的基因实现了遗传变更（诸如转 化）的植物或植物细胞，或者是从经如此变更的植物或细胞遗传下来并包含该变更的植物 或植物细胞。"对照"或"对照植物"或"对照植物细胞"提供测量受试植物或植物细胞的表 型变化的参考点。
[0028] 对照植物或植物细胞可例如包括：(a)野生型植物或植物细胞，即，具有与用于进 行遗传变更的起始材料相同的基因型的植物或植物细胞，该遗传变更会得到受试植物或细 胞；(b)具有与起始材料相同的基因型但已用无效构建体（即，用对目的性状不具有已知效 果的构建体，诸如包含标记基因的构建体）转化的植物或植物细胞；（C)为受试植物或植物 细胞的子代中的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)在遗传上与受试植物或植物细胞相 同但不暴露于会诱导目的基因的表达的条件或刺激因素的植物或植物细胞；或者（e)处于 目的基因不被表达的条件下的受试植物或植物细胞本身。
[0029]A.雄件育件序列的片段和夺体
[0030] 还提供了本发明所公开的多核苷酸的片段和变体以及由其编码的蛋白质。所谓 "片段"，意指多核苷酸的一部分或由其编码的氨基酸序列从而由其编码的蛋白质的一部 分。多核苷酸的片段可编码保留该天然蛋白质的生物活性从而影响雄性育性的蛋白质片 段。作为另一种选择，可用作杂交探针的多核苷酸片段通常不编码保持生物活性的片段蛋 白质。因此，核苷酸序列的片段的范围可为本文所公开的编码多肽的至少约20个核苷酸、 约50个核苷酸、约100个核苷酸、直至全长多核苷酸。
[0031] 编码影响雄性育性的多肽的生物活性部分的多核苷酸的片段将编码至少15、25、 30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、525 或 537 个连续的氨基酸，或直至存在 于影响雄性育性的全长多肽（例如，分别为SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16和18)中的 氨基酸的总数。编码影响雄性育性的多肽的多核苷酸的可用作杂交探针或PCR引物的片 段，通常不需要编码影响雄性育性的多肽的生物活性部分。
[0032]因此，如本文所公开的雄性育性多核苷酸的片段可以编码雄性育性多肽的生物活 性部分，或者其可以是可使用下文所公开的方法被用作杂交探针或PCR引物的片段。雄性 育性多肽的生物活性部分可通过以下所述来制备：分离本文所公开的雄性育性多核苷酸 中的一者的一部分，表达雄性育性蛋白质的编码部分（例如，通过体外重组表达），以及评 估雄性育性多肽的编码部分的活性。作为雄性育性多核苷酸的片段的多核苷酸包含至少 16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、 1100、1200、1300、1400、1500、1600或1629个核苷酸、或者直至本文所公开的全长雄性育性 多核苷酸（即，分别为SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15或17)中存在的核苷酸的数目。
[0033] "变体"旨在意指实质上相似的序列。对于多核苷酸，变体包含在天然多核苷酸当 中的一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷 酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的置换。如本文所用，"天然"或"野生型"多 核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸而言，保守变 体包含那些由于遗传密码的简并性而编码本文所公开的雄性育性多肽中的一者的氨基酸 序列的序列。诸如这些变体的天然存在的等位基因变体可用公知的分子生物学技术（例 如，用下文概述的聚合酶链反应（PCR)和杂交技术）进行鉴定。变体多核苷酸还包括通过合 成获得的多核苷酸，诸如那些例如通过使用定点诱变产生但仍编码雄性育性多肽的多核苷 酸。通常，本文所公开的特定多核苷酸的变体将与该特定多核苷酸（例如SEQ ID NO :1、3、 5、7、9、11、13、15 或 17 中的任一者）具有至少约 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的序列 同一性，这通过本文别处所述的序列比对程序和参数进行测定。
[0034] 本文所公开的特定多核苷酸（即，参考多核苷酸）的变体还可通过比较变体多核 苷酸所编码的多肽与该参考多核苷酸所编码的多肽之间的序列同一性百分数来进行评估。 因此，例如，公开了编码与SEQ ID勵：2、4、6、8、10、12、14、16或18的多肽具有给定序列同 一性百分数的多肽的分离的多核苷酸。任何两种多肽之间的序列同一性百分数可用本文 别处描述的序列比对程序和参数来计算。在任何给定的本文所公开的多核苷酸对是通过 比较它们编码的两种多肽所共享的序列同一性百分数进行评估的情况中，两种被编码的多 肽之间的序列同一性百分数为至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的序列同一性。
[0035] "变体"蛋白质旨在意指通过在天然蛋白质中的一个或多个内部位点处缺失或添 加一个或多个氨基酸和/或在天然蛋白质的一个或多个位点处置换一个或多个氨基酸而 从该天然蛋白质衍生的蛋白质。本文所公开的变体蛋白质具有生物活性，即它们继续具有 天然蛋白质的所需生物活性，即本文所述的雄性育性活性。这种变体可例如由遗传多态 性或由人类操纵而得到。本文所公开的雄性育性蛋白质的生物活性变体将与该天然蛋白 质的氨基酸序列（例如，SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16或18中的任一者）具有至少 约 40%、45%、50%、55%、60