oia sempervirens);纵树（true firs)诸如银纵（Abies amabilis)和胶纵（Abies balsamea);以及雪松诸如西方红雪松 (Thuja plicata)和阿拉斯加黄雪松（Chamaecyparis nootkatensis)。在特定实施例中， 本文所公开的植物是作物植物（例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属、大豆、棉花、红花、花生、 高粱、小麦、粟、烟草等等）。在其他实施例中，玉米和大豆植物是最佳的，在另外其他实施例 中，玉米植物是最佳的。
[0093] 其他目的植物包括提供目的种子的谷物植物、油料种子植物和豆科植物。目的种 子包括谷物种子，诸如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、黑麦等。油料种子植物包括棉花、大豆、 红花、向日葵、芸苔、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括豆类和豌豆。豆类包括瓜尔 豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等等。
[0094]通常，中间宿主细胞将被用于实施本文所公开的方法和组合物，以增加克隆载体 的拷贝数。随着拷贝数增加，可分离极大数量的含有目的核酸的载体来引入所需的植物细 胞中。在一个实施例中，采用不会引起所述多肽在细菌中的表达的植物启动子。
[0095]原核生物最常由各种大肠杆菌（E. coli)菌株代表；然而，也可以使用其他微生物 菌株。在本文中定义为包括用于转录起始的启动子（任选具有操纵子）以及核糖体结合序 列的常用原核控制序列包括诸如0 _内酰胺酶（青霉素酶）启动子系统和乳糖（Iac)启 动子系统（Chang et al. (1977)Naturel98:1056(Chang 等人，1977 年，《自然》，第 198 卷， 第 1056 页））、色氨酸（trp)启动子系统（Goeddel et al. (1980)Nucleic Acids Res.8: 4057 (Goeddel等人，1980年，《核酸研宄》，第8卷，第4057页））和A衍生的P L启动子 之类的常用启动子，以及N-基因核糖体结合位点（Shimatake et al.(1981)Nature 292: 128 (Shimatake等人，1981年，《自然》，第292卷，第128页））。在转染进大肠杆菌中的DNA 载体中包含选择标记也是有用的。这种标记的例子包括确定对氨苄青霉素、四环素或氯霉 素的抗性的基因。
[0096] 选择载体以使得能引入到适当的宿主细胞中。细菌载体通常是质粒或噬菌体起 源的。将适当的细菌细胞用噬菌体载体颗粒感染或用裸噬菌体载体DNA转染。如果使用 质粒载体，则将细菌细胞用质粒载体DNA转染。用于表达本文所公开的蛋白质的表达系统 可用芽孢杆菌属（Bacillus)物种和沙门氏菌属（Salmonella)提供（Palva et al. (1983) Gene 22 :229-235 (Palva 等人，1983 年，《基因》，第 22 卷，第 229-235 页））；Mosbach et al. (1983) Nature 302 :543-545 (Mosbach 等人，1983 年，《自然》，第 302 卷，第 543-545 页））。
[0097] 在一些实施例中，本文所公开的表达盒或雄性育性多核苷酸在植物中维持在半合 子状态。半合子状态为当仅有基因（或一组基因）的一个拷贝，而在姊妹染色体上没有对应 等位基因时存在的遗传状态。在某些实施例中，本文所公开的表达盒包含有效连接到雄性 育性多核苷酸的第一启动子，该雄性育性多核苷酸与有效连接到雄性组织优选启动子的雄 性配子破坏性多核苷酸堆叠，并且将此类表达盒引入处于半合子状态的雄性不育植物。当 雄性育性多核苷酸表达时，由于雄性育性多核苷酸使该植物恢复到能育状态，故该植物能 够成功地产生成熟的花粉粒。鉴于表达盒处于半合子状态，故在花粉粒形成过程中，只有某 些子细胞将遗传该表达盒。由于堆叠的被编码的雄性配子破坏性基因产物的雄性组织优选 的表达，遗传了包含雄性育性多核苷酸的表达盒的子细胞将不会发育为成熟的花粉粒。未 遗传该表达盒的那些花粉粒将继续发育为成熟的花粉粒并具有功能性，但它们将不包含该 表达盒的雄性育性多核苷酸，因此将不会通过花粉将雄性育性多核苷酸传递到子代。
[0098]V.调节雄件育件多肽的浓度和/或活件
[0099] 提供了用于调节植物中的本文所公开的雄性育性多肽的浓度和/或活性的方法。 本文针对雄性育性多肽的浓度和/或活性所用的术语"影响"或"调节"，是指当与适当的 对照比较时，雄性育性多肽的浓度和/或活性的任何增大或减小。一般来讲，本文所公开的 雄性育性多肽的浓度和/或活性相对于天然的对照植物、植物部分或细胞增大或减小至少 1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或 90%。本文所公开的调节可在植 物生长至所需的发育阶段过程中和/或在其后进行。在特定的实施例中，在单子叶植物（特 别是小麦）中对本文所公开的雄性育性多肽进行调节。
[0100] 可采用多种方法来测定雄性育性多肽的浓度和/或活性的调节。例如，雄性育性 多肽的表达水平可以例如通过测定植物中雄性育性多肽的水平来直接测量（即，蛋白质印 迹法或RNA印迹法），或者例如通过测定植物中雄性育性多肽的雄性育性活性来间接测量。 用于测量雄性育性活性的方法在本文别处进行描述。在特定的实施例中，对雄性育性多肽 浓度和/或活性的调节包括对植物中的雄性育性多肽的水平的调节（即，增大或减小）。测 量雄性育性多肽的水平和/或活性的方法在本领域中是已知的并且在本文别处进行讨论。 在另有其他实施例中，对营养组织中、繁殖组织中、或营养组织和繁殖组织两者中的雄性育 性多肽的水平和/或活性进行调节。
[0101] 在一个实施例中，通过将雄性育性多肽或相应的雄性育性多核苷酸引入植物来增 大该多肽的活性和/或浓度。随后，使用本领域技术人员已知的方法选出具有引入的雄性 育性序列的植物，所述方法诸如但不限于DNA印迹分析、DNA测序、PCR分析或表型分析。在 某些实施例中，将标记多核苷酸与雄性育性多核苷酸一起引入，以便帮助选择具有或缺乏 本文所公开的雄性育性多核苷酸的植物。将经前述实施例改变或修饰的植物或植物部分在 形成植物的条件下培育足以调节雄性育性多肽在该植物中的浓度和/或活性的时间。形成 植物的条件在本领域中是公知的。
[0102] 如本文别处所讨论，许多用来将多肽提供给植物的方法是本领域已知的，包括但 不限于将多肽直接引入植物中，或者将编码雄性育性多肽的多核苷酸构建体引入植物中 (瞬时引入或稳定引入）。还应认识到，本文所公开的方法可采用不能够在转化的植物中指 导蛋白质或RNA的表达的多核苷酸。因而，雄性育性多肽的水平和/或活性可通过改变编码 雄性育性多肽的基因或其启动子来增大。参见例如，Kmiec的美国专利5, 565, 350 ;Zarling 等人的PCT/US93/03868。因此提供了在雄性育性基因中携带突变的经诱变处理的植物，其 中所述突变增加雄性育性基因的表达或增大被编码的雄性育性多肽的活性。
[0103] 在其他实施例中，通过向植物引入如本文别处所公开的包含雄性育性多核苷酸 (例如SEQ ID勵：1、3、5、7、9、11、13、15或17)或其活性片段或变体的表达盒来增大雄性 育性多肽的浓度和/或活性。雄性育性多核苷酸可以有效连接到对于植物是异源的或者对 于植物是天然的启动子。通过增大植物中的雄性育性多肽的浓度和/或活性，该植物的雄 性育性也增大。因此，可以通过增大雄性育性多肽的浓度和/或活性来增大植物的雄性育 性。例如，通过增大雄性育性多肽的浓度和/或活性，可使雄性不育植物恢复雄性育性。
[0104] 还应认识到，可通过采用不能够在转化的植物中指导蛋白质或RNA的表达的多核 苷酸，来调节该多肽的水平和/或活性。例如，本文所公开的多核苷酸可用来设计可在用 于改变或突变生物体中的基因组核苷酸序列的方法中应用的多核苷酸构建体。这类多核 苷酸构建体包括但不限于：RNA :DNA载体、RNA :DNA突变载体、RNA :DNA修复载体、混合双 链体寡核苷酸、自身互补RNA :DNA寡核苷酸和引起重组的寡核苷酸。这类核苷酸构建体和 使用方法是本领域已知的。参见美国专利No. 5, 565, 350、No. 5, 731，181、No. 5, 756, 325、 No. 5, 760, 012、No. 5, 795, 972和No. 5, 871，984,所有这些专利以引用方式并入本文。还 可参见 TO 98/49350、W099/07865、W0 99/25821 和 Beetham，et al.，（1999)Proc. Natl. Acad. Sci. USA96 :8774-8778 (Beetham等人，1999年，《美国国家科学院院刊》，第96卷，第 8774-8778页）；这些专利和文献以引用方式并入本文。因此应认识到，本文所公开的方法 并不依赖于将完整多核苷酸整合到基因组中，只要将该多核苷酸引入细胞而使植物或其细 胞被改变即可。
[0105] 在一个实施例中，基因组可在将该多核苷酸引入细胞之后被改变。例如，可将多核 苷酸或其任何部分整合到植物的基因组中。本文所公开的基因组的变更包括但不限于基因 组中核苷酸的添加、缺失和置换。虽然本文所公开的方法并不依赖于任何具体数目的核苷 酸的添加、缺失和置换，但应认识到此类添加、缺失或置换包含至少一个核苷酸。
[0106]表1 :SEQ ID NOt总
【主权项】
1. 一种分离的多核苷酸，其包含选自以下的核苷酸序列： (a) 包含SEQ ID NO :1、7或13的核苷酸序列； (b) 编码包含SEQ ID NO :2、8或14的氨基酸序列的核苷酸序列； (c) 与SEQ ID N0:l、7或13具有至少85%的序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核 苷酸编码调节雄性育性的多肽； ⑷包含SEQ ID NO :1、7或13的至少50个连续核苷酸的核苷酸序列，其中所述多核 苷酸编码调节雄性育性的多肽；以及 (e)编码与SEQ ID NO :2、8或14具有至少85%的同一性的多肽的核苷酸序列，其中所 述多肽调节雄性育性。
2. 根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中所述核苷酸序列选自： (a) 包含SEQ ID NO :3、5、9、11、15或17的核苷酸序列；以及 (b) 编码包含SEQ ID NO :4、6、10、12、16或18的氨基酸序列的核苷酸序列。
3. -种包含表达盒的多核苷酸，所述表达盒包含有效连接到驱动在植物中的表达的第 一异源启动子的第一多核苷酸，所述第一多核苷酸是权利要求1-2中任一项所述的多核苷 酸。
4. 根据权利要求3所述的多核苷酸，其中所述表达盒的所述第一启动子是组成型启动 子、诱导型启动子、组织优选的启动子、或生长阶段优选的启动子。
5. 根据权利要求4所述的多核苷酸，其中所述表达盒的所述第一启动子是雄性组织优 选的启动子。
6. 根据权利要求3-5中任一项所述的多核苷酸，还包括有效连接到驱动在植物中的表 达的第二启动子的第二多核苷酸。
7. 根据权利要求6所述的多核苷酸，其中所述第二多核苷酸编码干扰雄性配子的功 能、形成或传播的多核苷酸或多肽。
8. 根据权利要求7所述的多核苷酸，其中所述第二多核苷酸编码芽孢杆菌RNA酶、 DAM-甲基化酶、淀粉酶、或ADP核糖基化酶。
9. 根据权利要求6-8中任一项所述的多核苷酸，还包括有效连接到第三启动子的第三 多核苷酸，其中所述第三多核苷酸编码标记基因产物。
10. 根据权利要求9所述的表达盒，其中所述标记基因产物包括抗生素抗性标记基因 产物或可视标记基因产物。
11. 一种分离的多肽，其包含选自以下的氨基酸序列： (a) 包含SEQ ID NO :2、8或14的氨基酸序列； (b) 与SEQ ID NO :2、8或14具有至少85%的序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽 调节雄性育性；以及 (c) 包含SEQ ID NO :2、8或14的至少50个连续氨基酸的氨基酸序列，其中所述多肽 调节雄性育性。
12. 根据权利要求11所述的分离的多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 4、6、10、12、16 和 18。
13. -种载体，其包含权利要求3-10中任一项所述的表达盒。
14. 一种植物细胞，其包含权利要求1-2中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸 对于所述植物细胞而言是异源的。
15. 根据权利要求14所述的植物细胞，其中所述多核苷酸有效连接到其天然启动子序 列。
16. -种植物细胞，其包含权利要求3-10中任一项所述的表达盒。
17. 根据权利要求14-16中任一项所述的植物细胞，其中所述植物细胞来自单子叶植 物或双子叶植物。
18. 根据权利要求17所述的植物细胞，其中所述植物是玉蜀黍、大麦、粟、小麦、水稻、 高粱、黑麦、大豆、卡诺拉油菜、苜蓿、向日葵、红花、甘鹿、烟草、拟南芥（Arabidopsis)或棉 花。
19. 一种植物，其包含权利要求14-18中任一项所述的植物细胞。
20. 根据权利要求19所述的植物，其中当与对照植物比较时，所述多核苷酸的表达调 节所述植物的雄性育性。
21. 根据权利要求19或20所述的植物，其中当与对照植物比较时，所述植物具有增强 的雄性育性。
22. 根据权利要求19-21中任一项所述的植物，其中所述多核苷酸的表达赋予雄性不 育植物雄性育性。
23. 根据权利要求19-22中任一项所述的植物，其中所述植物是雌性能育植物。
24. 根据权利要求19-23中任一项所述的植物，其中当与对照植物比较时，所述植物的 至少一种雄性组织的形成在所述第一多核苷酸表达之后得到调节。
25. 根据权利要求24所述的植物，其中所述雄性组织包括雄蕊、花药、花丝或花粉。
26. 根据权利要求24或25所述的植物，其中至少一种雄性组织的所述得到调节的形成 包括至少一种雄性组织的形成增加。
27. 根据权利要求19-23中任一项所述的植物，其中所述异源第一多核苷酸被稳定地 整合到所述植物的基因组中。
28. -种权利要求19-27中任一项所述的植物的种子，其中所述种子包含所述异源第 一多核苷酸。
29. -种用于增加植物中的多肽的活性和/或水平的方法，其包括向所述植物提供权 利要求11或12中任一项所述的多肽。
30. -种增加植物中的多肽的活性和/或水平的方法，其包括向所述植物中引入有效 连接到在所述植物中有活性的启动子的多核苷酸，所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序 列： (a) 包含SEQ ID NO :1、7或13的核苷酸序列； (b) 编码包含SEQ ID NO :2、8或14的氨基酸序列的核苷酸序列； (c) 与SEQ ID N0:l、7或13具有至少85%的序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核 苷酸编码调节雄性育性的多肽； ⑷包含SEQ ID NO :1、7或13的至少50个连续核苷酸的核苷酸序列，其中所述多核 苷酸编码调节雄性育性的多肽；以及 (e)编码与SEQ ID NO :2、8或14具有至少85%的同一性的多肽的核苷酸序列，其中所 述多肽调节雄性育性。
31. 根据权利要求30所述的方法，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO :3、5、9、11、15或 17示出的核苷酸序列。
32. 根据权利要求30-31中任一项所述的方法，其中当与对照植物比较时，所述多核苷 酸的表达调节所述植物中的雄性育性。
33. 根据权利要求32所述的方法，其中当与对照植物比较时，所述多核苷酸的表达增 强所述植物中的雄性育性。
34. 根据权利要求30-33中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸的表达赋予雄性不 育植物雄性育性。
35. 根据权利要求30-34中任一项所述的方法，其中所述植物是雌性能育植物。
36. 根据权利要求30-35中任一项所述的方法，其中所述启动子是组成型启动子、诱导 型启动子、组织优选的启动子、或生长阶段优选的启动子。
37. 根据权利要求36所述的方法，其中所述启动子是雄性组织优选的启动子。
38. 根据权利要求30-37中任一项所述的方法，其中当与对照植物比较时，所述多核苷 酸的表达调节至少一种雄性组织的形成。
39. 根据权利要求38所述的方法，其中所述雄性组织包括雄蕊、花药、花丝或花粉。
40. 根据权利要求38或39所述的方法，其中至少一种雄性组织的所述得到调节的形成 包括至少一种雄性组织的形成增加。
【专利摘要】本发明提供了用于调节植物中的雄性育性的组合物和方法。所述组合物包含调节雄性育性的核苷酸序列及其活性片段和变体。本发明还提供了表达盒，所述表达盒包含有效连接到启动子的雄性育性多核苷酸或其活性片段或变体，其中所述多核苷酸的表达调节植物的雄性育性。本发明还提供了各种方法，其中影响雄性育性的序列的水平和/或活性在植物或植物部分中得到调节。
【IPC分类】C12N15-82, C07K14-415
【公开号】CN104837861
【申请号】CN201380046655
【发明人】M.阿伯特森, A.M.西干, H.赫舍伊, M.拉斯纳, Y.吴
【申请人】先锋国际良种公司
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2013年9月6日
【公告号】CA2884049A1, EP2892915A2, US20140075597, US20150252382, WO2014039815A2, WO2014039815A3, WO2014039815A9