专利名称：D4去饱和酶和d5延伸酶的制作方法
D4去饱和酶和D5延伸酶本申请为分案申请，其原申请的申请日为2007年10月31日，申请号为200780100540.5 (国际申请号为PCT/IB2007/004553)，名称为“D4去饱和酶和D5延伸酶”。1.背景有压倒性的科学证据表明，(n-3)高级不饱和脂肪酸诸如二十二碳六烯酸(DHA)对心血管循环疾病、慢性炎症和脑功能障碍有积极作用。另一方面，已经注意到(n-6)脂肪酸诸如二十碳五烯酸(EPA)在类花生酸类固醇诸如前列腺素、白细胞三烯或类似的类花生酸类固醇中作为中间代谢产物。目前，这些高级不饱和脂肪酸的主要来源是鱼，注意到EPA和DHA在各种海洋鱼类(blue fish)(诸如沙丁鱼和金枪鱼)中分别以大约20%和10%的量存在。认为这样一种脂肪酸谱是通过在每种鱼类中自然选择最佳表现的最佳比例而发生的。然而，如果人们想要使用鱼油作为这些脂质的唯一来源，还存在许多缺陷，诸如味道污染的问题，可获得性的不可控的波动，和天然鱼油成分的变化性。此外，如果人们想要从这些来源获得高度纯化的(n-3)或(n-6)油，很难优先分离并纯化它们。此前公开了能够产生高量DHA和EPA以及其它首选脂肪酸的破囊壶菌目(Thraustochytriales)真核生物0NC-T18和相关有机体。0NC-T18公开在国际申请PCT/IB2006/003977和美国临时串请60/751401和60/821084，这些都通过参考至少涉及0NC-T18和其中产生的脂肪酸的信息的方式并入本文。期望操纵DHA和EPA途径。本文公开了来自0NC-T18、牵涉在这些途径中的两种酶D4去饱和酶和D5延伸酶的分离和表征。I1.概述公开了涉及0NC-T18、D4-去饱和酶、D5延伸酶和分离、表征、产生、鉴定它们的方法和组合物，和它们用于脂 肪酸产生的应用，以及包含这些组合物的有机体和表达这些组合物的有机体。II1.附图简述并入本文并构成说明书一部分的附图，阐释了多种实施方式，并连同描述阐释了公开的组合物和方法。
图1显示EPA和DHA产生的途径。图2A显示分离的D4去饱和酶的系统进化(phylogentic)树，图2B显示分离的D5-延伸酶的系统进化(phlogenetic)树。图3显示分离的D4去饱和酶的图示遗传概述。图4显示分离的D5延伸酶的图示遗传概述。IV.详述公开和描述本发明的化合物、组合物、物品、装置和/或方法之前，应理解的是，除非另外指明，否则它们不限于具体合成方法或具体重组生物技术方法，或除非另外指明，否则不限于具体试剂，因为本发明的这些化合物、组合物、物品、装置和/或方法当然都可以变化。还应理解的是，本文所用的术语仅是为了描述具体实施方案的目的，不意为限制。A.定义
在说明书和所附的权利要求书中所用的，除非上下文另外清楚地指明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多数指示物。因此，例如，提到“一种药物运载体”包括两种或多种所述运载体(carrier)的混合物,等等。本文中范围可表示为从“约” 一个具体值和/或到“约”另一个具体值。当表示这种范围时，另一实施方案包括从一个具体值和/或到另一个具体值。类似地，当数值通过使用先行词“约”表示为近似值时，应理解的是，该具体值形成另一实施方案。进一步应理解的是，每个范围的端点在相对于另一端点和独立于另一端点两种情况下都是有意义的。还应理解的是，本文公开了许多数值，每个数值除了该数值本身，还在本文公开为“约”该具体值。例如，如果公开数值“10”，那么还公开了“约10”。还应理解的是，当公开数值时，还公开了“小于或等于”该数值、“大于或等于该数值”和数值之间的可能范围，如本领域技术人员适当地理解的。例如，如果公开“10”，则还公开了 “小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应理解的是，在本申请中，数据以多种不同形式提供，且该数据代表端点和起点，以及数据点的任何组合的范围。例如，如果公开具体数据点“ 10”和具体数据点15,则应理解的是，认为公开了大于、大于或等于、小于、小于或等于、等于10和15以及10与15之间。还应理解的是，还公开了两个具体单位之间的每个单位。例如，如果公开10和15，那么还公开7 11、12、13 和 14。 在说明书和所附的权利要求书中，将提及许多术语，这些术语应被界定为具有以下含义:“任选”或“任选地”是指其后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，该描述包括其中所述事件或情况发生的情形和所述事件或情况不发生的情形。“引物”是能够支持一些类型的酶促操纵并能与靶核酸杂交以使酶促操纵可发生的探针亚组。引物可从本领域可获得而不干扰酶促操纵的核苷酸或核苷酸衍生物或类似物的任何组合制备。“探针”是能够与靶核酸相互作用的分子，所述相互作用典型地是以序列特异性方式例如经由杂交。核酸的杂交是本领域熟知的，并在本文讨论。典型地探针可从本领域可获得的核苷酸或核苷酸衍生物或类似物的任何组合制备。在本申请中，参照了多种出版物。这些出版物的公开完整地通过参考并入本申请，以更完全地描述本申请所属领域的技术状态。公开的参考文献还单独和具体地通过参考包含在其中的材料而并入本文，所述材料在参考文献所依赖的语句中讨论。公开了将用于制备公开的组合物的组分以及将用于本文公开的方法的组合物本身。本文公开这些和其它材料，应理解的是，当公开这些材料的组合、亚组、相互作用、组等等时，尽管可能没有明确地公开具体地提及这些化合物的每种不同的单独和共同的组合和排列，但本文具体地预期并描述每一种。例如，如果公开和讨论具体的D4去饱和酶和D5延伸酶，并讨论可对包括D4去饱和酶和D5延伸酶的大量分子进行的大量修饰，则具体地预期D4去饱和酶和D5延伸酶的每一种和每种组合和排列以及可能的修饰，除非具体地指明相反。因此，如果公开一类分子A、B和C以及一类分子D、E和F并公开组合分子A-D的一个实例，那么即使没有单独地提及每一种，也单独和共同地预期每一种，即认为公开了组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-EjP C-F。类似地，还公开了这些的任何亚组或组合。因此，例如，将认为公开了 A-E、B-FjP C-E的亚组。这一概念应用到本申请的所有方面，包括但不限于制备和使用公开的组合物的方法的步骤。因此，如果有可进行的多个另外步骤，应理解的是，这些另外步骤的每一个可与公开的方法的任何具体的实施方案或实施方案的组合一起进行。B.组合物在强化某些食品以促进健康饮食方面，ω-3浓缩物(二十碳五烯酸EPA，即20:5η-3，和二十二碳六烯酸DHA，即22:6η-3)的使用已经变得重要。破囊壶菌Thraustochytrid是天然地产生DHA的海洋原生生物,产生的DHA达其生物量的20%。发酵这些有机体的能力提供了这些ω-3油的可再生的、长期来源。脂肪酸代谢途径的表征(图1)揭示了负责延伸EPA为二十二碳五烯酸(DPA、22:5n-3)的D5-延伸酶、以及牵涉在去饱和DPA为DHA的D4-去饱和酶的重要性。操纵特定酶活性可以影响由我们的0NC-T18菌株产生EPA和DHA的产率，如由市场和我们的顾客的需要所要求的。使用从不同破囊壶菌Thraustochytrid菌株(用于D4-去饱和酶的破囊壶菌 Thraustochytrium sp.(CS020087)、金黄色破囊壶菌 Thraustochytriumaureum(AF391546)、破囊壶菌 Thraustochytrium sp.ATCC34304(AF391543)、破囊壶菌 Thraustochytrium sp.ATCC21685(AF489589)和破囊壶菌 Thraustochytriumsp.FJN-1O (DQ133575);用于 D5-延伸酶的破囊壶菌 Thraustochytrium sp.(CS160897)和金黄色破囊壶菌Thraustochytrium aureum(CS160879))的酶的基因序列中的保守区域构建的简并引物，从ONC T-18分离了 D4-去饱和酶和D5延伸酶。进一步PCR扩增来自基因组DNA的基因的一部分(分别是967bp和593bp)。基因组步移(APAgene GOLD试剂盒，BIOS&T, Montreal, Quebec)用于延伸已知序列以掺入完整的开放阅读框，并进一步延伸以鉴定任一侧上的相邻基因以及启动子区域。随后对完整序列构建引物以产生掺入完整的开放阅读框的全基因PCR产物(分别是1758bp和1099bp)。将PCR产物克隆到pT7_Blue3载体(Novagen, San Diego, California)并转化到大肠杆菌 NovaBlue (DE3) (Novagen, SanDiego, California),随后测序。
使用UltraClean6Minute Mini 质粒制备试剂盒(MO BIOLaboratories, Inc., Solana Beach, California)纯化获得的基因质粒。随后使用限制酶BamHI和NotI切下基因插入片段并克隆到pYES2酵母表达载体(Invitrogen, Carlsbad, California)。随后使用 S.c.EasyComp 转化试剂盒(Invitrogen, Carlsbad, California),在半乳糖启动子Gall控制下，转化鉴定为pYDes(D4-去饱和酶)和pYElo (D5-延伸酶)的新载体构建体到酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae INVScl 阴性对照菌株是包含未改变的pYES2载体的INVScI，使这些菌株同时生长。使用酵母菌株的尿嘧啶营养缺陷型进行载体筛选，并使用无尿嘧啶的SC培养基。使用酵母表达体系确定D4-去饱和酶和D5延伸酶的活性和特异性。转化的酵母在包含2%葡萄糖、l%Tergitol NP-40的SC-U培养基中在30°C 150RPM下生长48hr。制备包含SC-U、2%半乳糖、1%棉子糖、l%Tergitol NP-40和500 μ M特定自由脂肪酸的底物培养基。将转化的酵母培养物以0.5的0D600接种到IOOml底物培养基，并将培养物在20°C培养5天。以2000RPM离心5min，IOOmM磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗涤一次，随后冷冻干燥来回收生物量。其后进行脂肪酸甲基酯气相色谱以确定脂肪酸去饱和与延伸的效率。通过计算(产物)/ (底物+产物)*100而确定底物的转化百分比。
BLASTx结果显不，ONC T-18D4去饱和酶与破囊壶菌Thraustochytriumsp.ATCC2168OT4-去饱和酶96%相似。图2A显示当与0NC-T18D4-去饱和酶序列相比时的置根邻接系统进化树(rooted neighbour-joining phylogenetic tree),该系统进化树使用ClustalX，使用BLASTx搜寻结果的自展分析(IOOOx)确定。D4-去饱和酶基因具有1560bp的开放阅读框，转录519氨基酸的蛋白。该蛋白的分析显示细胞色素b5结构域、三个组氨酸盒基序和四个跨膜区，所有元件都是前端去饱和酶的特征。与该基因相邻的是五个推定的TATA盒、多个重复区、两个启动子和上游鉴定的蛋白激酶以及下游的AP2结合蛋白(图3)。相反，BLASTx搜寻鉴定D5-延伸酶蛋白为与破囊壶菌Thraustochytriumsp.FJN-1O多不饱和的脂肪酸延伸酶具有89%的同一性。图2B显示当与0NC-T18D5-延伸酶序列相比时的置根邻接系统进化树，该系统进化树使用ClustalX，使用BLASTx搜寻结果的自展分析(IOOOx)确定。进一步分析确定该831bp长的延伸酶编码276氨基酸的蛋白，包含对线粒体特异性的四个跨膜区、和一个组氨酸盒基序。该D5-延伸酶区的上游组分包含线粒体输入受体之前的单个TATA盒、多个重复区和启动子，而在下游鉴定了膜占据和识别连结(recognition nexus)基序的开始(图4)。n-3和n-6途径的pYDes的表征(表I)显示14%的DPA n_3或二十二碳四烯酸(DTA 22:4 n-6)分别转化为 DHA 或 DPA n_6。复I: D4-去饱和酶的酶活性和表征
权利要求
1.一种组合物，其包含D5延伸酶，其中所述D5延伸酶与SEQ ID NO: 15具有至少或大于 70%、80%、89%、90%、95%、96%、97% 的同一性。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中不同于SEQID NO: 15的任何变化是保守性变化。
3.一种包含核酸的组合物，其中所述核酸编码权利要求1-2任一项所述的D5延伸酶。
4.根据权利要求3所述的组合物，其还包含载体。
5.一种包含细胞的组合物，其中所述细胞包含权利要求1-4任一项所述的组合物。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述细胞是真核生物、原核生物、破囊壶菌(Thraustochytrid)、酵母或大肠杆菌。
7.一种包含非人类动物的组合物，其中所述非人类动物包含权利要求1-6任一项所述的组合物。
8.根据权利要求5-7任一项所述的组合物，其中所述组合物比不存在D5延伸酶的组合物产生更多的多不饱和的脂肪酸。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述脂肪酸是EPA或DHA。
10.根据权利要求1-9任一项所述的组合物，其中所述延伸酶是在延伸酶底物存在下。
11.根据权利要求1-10任一项所述的组合物，其中所述底物具有至少100μΜ、200μΜ、300 μ Μ、400 μ Μ、500 μ Μ、600 μ Μ、700 μ Μ、800 μ Μ、900 μ M 或 1000 μ M 的浓度。
12.根据权利要求1-11任一项所述的组合物，其中所述底物是二十碳五烯酸(20:5η-3)或花生四烯酸(20:4η-6)。
13.根据权利要求1-12任一项所述的组合物，其中所述延伸酶转化至少0.1%、0.5%、1%、5%、10%、30%、50%、70%、90%、95% 的可获得的底物。
14.根据权利要求1-13任一项所述的组合物，其中所述组合物是分离的。
15.一种产生多不饱和的脂肪酸的方法，包括使用权利要求1-14任一项所述的组合物中的一种或多种。
16.根据权利要求15所述的方法，其中产生的所述脂肪酸是EPA或DHA。
17.—种产生权利要求1-14任一项所述的组合物的方法,其包括分离权利要求1-14任一项所述的组合物。
全文摘要
本发明公开了涉及ONC-T18、D4-去饱和酶、D5延伸酶和分离、表征、产生、鉴定它们的方法和组合物，和它们用于脂肪酸产生的应用，以及包含这些组合物的有机体和表达这些组合物的有机体。
文档编号C12N1/19GK103074312SQ20121057916
公开日2013年5月1日 申请日期2007年10月31日 优先权日2007年7月13日
发明者A·M·伯杰, G·S·吉鲁阿德, H·瑞迪亚宁塔斯 申请人:加拿大海洋营养食品有限公司