专利名称：一种whv-s蛋白基因及基于该基因的零背景dna克隆载体的构建方法
技术领域：
本发明属于遗传工程中DNA重组的载体技术领域，尤其涉及一种WHV-S蛋白基因及基于该基因的零背景DNA克隆载体的构建方法。
背景技术：
目前，DNA分子克隆所用载体中，绝大部分采用的还是普通载体。1999年美国学者发现基因ccdB如果过量表达，具有杀伤大肠杆菌的作用。因而，近10多年来，形成了各种正性筛选克隆、表达载体，专利不下数十个，但是如果用Invitrogen公司的零背景(zerobackground)载体(含有自杀基因ccdB),不加外源DNA片段,直接用其pCR-1I blunt, zero载体自身连接，会发现有大量蓝斑菌落产生，这说明与LacZ α融合的ccdB蛋白的表达水平
不足以杀伤实验室常用大肠杆菌菌株。
发明内容
鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种WHV-S蛋白基因及基于该基因的零背景DNA克隆载体的构建方法,利用旱獭肝炎病毒(Woodchuck hepatitisvirus, WHV)表面S蛋白(WHV-S)对细菌的细胞毒性构建零背景(自杀)克隆载体，以降低DNA克隆时空载体发生率，节省克隆鉴定成本和时间。本发明的目的将通过以下技术方案得以实现
一种WHV-S蛋白基因，所述WHV-S蛋白基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1的核苷酸序列，所述WHV-S蛋白基因可以与蓝斑相关蛋白LacZa基因融合表达。优选的，上述的一种WHV-S蛋白基因，其中所述WHV-S蛋白基因编码的WHV-S蛋白具有序列表中SEQ ID NO:2的氨基酸序列。优选的，上述的一种WHV-S蛋白基因，其中所述WHV-S蛋白基因编码全部或部分WHV-S蛋白序列、WHV-S蛋白的同源蛋白序列或者所述WHV-S蛋白序列和WHV-S蛋白的同源蛋白序列的缺失、突变或杂交序列。优选的，上述的一种WHV-S蛋白基因，其中所述WHV-S蛋白的同源蛋白序列或者所述WHV-S蛋白序列和WHV-S蛋白的同源蛋白序列的缺失、突变或杂交序列具有序列表中SEQ ID NO:3" SEQ ID NO:6 的氨基酸序列。优选的，上述的一种WHV-S蛋白基因，其中还包括一具有序列表中SEQ ID NO: 7的核昔酸序列的关键DNA序列，所述关键DNA序列编码的关键融合蛋白具有序列表中SEQID NO:8的氨基酸序列。一种基于上述的WHV-S蛋白基因的零背景DNA克隆载体，所述零背景DNA克隆载体包含或部分包含所述WHV-S蛋白基因DNA分子。一种基于上述的WHV-S蛋白基因的零背景DNA克隆载体的构建方法，包括以下步骤步骤I)将所述的WHV-S蛋白基因与目标克隆载体质粒进行扩增、酶切和拼接；
步骤2)将步骤I)所得产物转化大肠杆菌感受态细胞；
步骤3)挑取步骤2)所得的大肠杆菌进行克隆，克隆鉴定后，扩增重组正确的质粒DNA ；步骤4)提取质粒DNA，进行DNA测序分析，得到的阳性重组质粒即为零背景DNA克隆载体质粒。优选的，上述的零背景DNA克隆载体的构建方法，其中所述步骤I)具体包括以下步骤
步骤a)将野生型或人工合成的WHV-S蛋白基因进行PCR扩增，所述扩增的蛋白编码DNA至少包含WHV-S蛋白基因C末端50个氨基酸残基所对应的DNA序列，所述PCR产物DNA的3’ -端添加终止密码，两端添加与DNA克隆载体适配的内切酶位点；
步骤b)将目标克隆载体进行PCR扩增，打开LacZ α基因3’ -末端，去除LacZ α基因的固有终止密码，两端分别用内切酶处理；
步骤c)将步骤a)所得产物连接到步骤b)所得产物的LacZ α基因的下游，构成一环状质粒载体。优选的，上述的零背景DNA克隆载体的构建方法，其中所述目标克隆载体是pUC系列的质粒载体。优选的，上述的零背景DNA克隆载体的构建方法，其中所述目标克隆载体为PUC18 或 pUC19。本发明的零背景DNA克隆载体的构建方法，适用于包括克隆载体和表达载体在内的所有类型的载体的制备，其中表达载体包括原核表达载体、真菌表达载体、昆虫表达载体、哺乳类动物表达载体或植物表达载体。本发明的突出效果为本发明的零背景DNA克隆载体的构建方法提供了一种正性(Positive)筛选重组体的方法，降低DNA克隆时空载体发生率，节省克隆鉴定成本和时间同时，比现有技术中的“零背景载体”具有更少的蓝斑。以下便结合实施例附图，对本发明的具体实施方式
作进一步的详述，以使本发明技术方案更易于理解、掌握。
图1是本发明WHV-S蛋白基因与LacZa基因形成融合蛋白的示意 图2是本发明实施例WHV-S蛋白基因的序列放在克隆区或其下游，启动子位于上游的示意图。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。本发明提供了一种WHV-S蛋白基因，所述WHV-S蛋白基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1的核苷酸序列，所述WHV-S蛋白基因可以与蓝斑相关蛋白LacZa基因融合表达，如图1所示。
本发明还提供了所述WHV-S蛋白基因编码的WHV-S蛋白具有序列表中SEQ IDNO:2的氨基酸序列。WHV-S蛋白具有较明显的细胞毒性，属首次披露。本发明还提供了所述WHV-S蛋白基因编码全部或部分WHV-S蛋白序列、WHV-S蛋白的同源蛋白序列或者所述WHV-S蛋白序列和WHV-S蛋白的同源蛋白序列的缺失、突变或杂交序列，所述WHV-S蛋白的同源蛋白序列或者所述WHV-S蛋白序列和WHV-S蛋白的同源蛋白序列的缺失、突变或杂交序列具有序列表中SEQ ID NO:SEQ ID NO:6的氨基酸序列，可以在其上游相关启动子的作用下表达WHV-S蛋白(SEQ ID NO: 2)或其同源蛋白(SEQID NO: SEQ ID NO: 6)，使得含有空载体的细胞发生死亡。还包括一具有序列表中SEQ IDNO: 7的核昔酸序列的关键DNA序列，所述关键DNA序列编码的关键融合蛋白具有序列表中SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
本发明还提供了一种零背景DNA克隆载体，包含或部分包含所述WHV-S蛋白基因DNA分子。本发明还提供了一种零背景DNA克隆载体的构建方法，包含如下步骤
1)将野生型或人工合成的WHV-S蛋白基因的DNA序列PCR扩增，扩增的蛋白编码DNA至少包含WHV-S蛋白基因C末端146个氨基酸残基(SEQ ID NO:9)对应的DNA序列(SEQ IDNO: 10)，或者最小为50个氨基酸残基对应的DNA序列，在其PCR产物DNA的3’ -端添加终止密码；两端添加与载体适配的内切酶位点；
2)将目标克隆载体(如pUC18或pUC19)PCR扩增，打开LacZa基因3’-末端，得到在LacZa末端线性化的载体，去除LacZ α基因的固有终止密码，两端分别用合适的内切酶处理；
3)将步骤I)和步骤2)所得产物相互连接，将WHV-S蛋白基因顺向插入LacZα基因的下游；
4)将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，不加IPTG铺板；
5)挑取步骤4)所得大肠杆菌克隆，克隆鉴定后，扩增重组正确质粒DNA；
6)提取质粒DNA，行DNA测序分析，得到的阳性重组质粒即为零背景DNA克隆载体质
粒;
7)铺含有Ampicillin (50-100ug/mL)的1. 2-1. 5% 的琼脂平板；
8)待琼脂凝固后，铺40-80uL X-gal (40mg/mL)和 4_8uL IPTG (250mM);
9)用步骤6)的DNA质粒Ing转化大肠杆菌感受态细胞；
10)取等量原始pUC18或pUC19质粒转化相同的感受态细胞做为对照；
11)分别取IOOuL菌液和对照铺板，37°C温箱培养到对照平皿出现明显蓝斑菌落为止(约12-16小时左右)；
12)计算菌落总数和蓝斑比例。实施例
(一)载体的制备
(O由普通蓝白斑质粒改建，其方法与上述载体构建过程相同；
(2)多克隆区的构建策略
a)如果上游为诱导性启动子，可以直接将WHV-S蛋白基因放置在克隆区或克隆区下游，如图2所示。
b)如果上游为非诱导型启动子，则需在克隆区先行插入一段DNA分子使得下游序列发生错码或包含终止密码，阻碍WHV-S蛋白基因表达，以便载体在大肠杆菌中正常扩增。在克隆载体制备时，酶切去除这段插入的DNA，恢复正常读码框架，如果载体发生自连，则WHV-S蛋白基因表达，杀伤宿主菌，不能长成空载体克隆，如果有目的基因重组进克隆区，则破坏了 WHV-S的阅读框，重组体得以生存，长成克隆(菌落)。(二)载体的验证
见载体的构建过程中步骤7) 步骤12)，以pUC19改建来的pUC-zero载体为对照，以下数据(表1.)说明抑制空载体形成的效应
表1.含WHV-S蛋白基因片段克隆载体的蓝斑形成率(计算100个菌落)
权利要求
1.一种WHV-S蛋白基因，其特征在于所述WHV-S蛋白基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的一种WHV-S蛋白基因，其特征在于所述WHV-S蛋白基因编码的WHV-S蛋白具有序列表中SEQ ID N0:2的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的一种WHV-S蛋白基因，其特征在于所述WHV-S蛋白基因编码全部或部分WHV-S蛋白序列、WHV-S蛋白的同源蛋白序列或者所述WHV-S蛋白序列和WHV-S蛋白的同源蛋白序列的缺失、突变或杂交序列。
4.根据权利要求3所述的一种WHV-S蛋白基因，其特征在于所述WHV-S蛋白的同源蛋白序列或者所述WHV-S蛋白序列和WHV-S蛋白的同源蛋白序列的缺失、突变或杂交序列具有序列表中SEQ ID NO:SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的一种WHV-S蛋白基因，其特征在于还包括一具有序列表中SEQ ID N0:7的核昔酸序列的关键DNA序列,所述关键DNA序列编码的关键融合蛋白具有序列表中SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
6.一种基于权利要求1所述的WHV-S蛋白基因的零背景DNA克隆载体，其特征在于所述零背景DNA克隆载体包含或部分包含所述WHV-S蛋白基因DNA分子。
7.一种基于权利要求1所述的WHV-S蛋白基因的零背景DNA克隆载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤 步骤I)将所述的WHV-S蛋白基因与目标克隆载体质粒进行扩增、酶切和拼接； 步骤2)将步骤I)所得产物转化大肠杆菌感受态细胞； 步骤3)挑取步骤2)所得的大肠杆菌进行克隆，克隆鉴定后，扩增重组正确的质粒DNA ； 步骤4)提取质粒DNA，进行DNA测序分析，得到的阳性重组质粒即为零背景DNA克隆载体质粒。
8.根据权利要求7所述的零背景DNA克隆载体的构建方法，其特征在于所述步骤I)具体包括以下步骤 步骤a)将野生型或人工合成的WHV-S蛋白基因进行PCR扩增，所述扩增的蛋白编码DNA至少包含WHV-S蛋白基因C末端50个氨基酸残基所对应的DNA序列，所述PCR产物DNA的3’ -端添加终止密码，两端添加与DNA克隆载体适配的内切酶位点； 步骤b)将目标克隆载体进行PCR扩增，打开LacZ a基因3’ -末端，去除LacZ a基因的固有终止密码，两端分别用内切酶处理； 步骤c)将步骤a)所得产物连接到步骤b)所得产物的LacZ a基因的下游，构成一环状质粒载体。
9.根据权利要求7所述的零背景DNA克隆载体的构建方法，其特征在于所述目标克隆载体是PUC系列的质粒载体。
10.根据权利要求9所述的零背景DNA克隆载体的构建方法，其特征在于所述目标克隆载体为PUC18或pUC19。
全文摘要
本发明揭示了一种WHV-S蛋白基因及基于该基因的零背景DNA克隆载体的构建方法，所述WHV-S蛋白基因的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO:1的核苷酸序列。本发明利用旱獭肝炎病毒(Woodchuckhepatitisvirus，WHV)表面S蛋白(WHV-S)对细菌的细胞毒性构建零背景(自杀)克隆载体，以降低DNA克隆时空载体发生率，节省克隆鉴定成本和时间，提高了工作效率。
文档编号C12R1/93GK102994521SQ20121058232
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者李万波 申请人:盘古基因科技(苏州)有限公司, 姚卓