专利名称：检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法，尤其涉及一种高灵敏性的应用二重PCR扩增技术检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法。
背景技术：
柑橘冬生疫霉褐腐病原菌Phytophthora hibernalis Carne具有寄主范围广，为害柑橘生产严重，分布地域广的特点，且都可以带病果实、组织或无性繁殖材料进行远距离传播。我国柑橘种植区域分布广泛，近年来这些病原菌随着引进优质的种子苗木传人我国的几率越来越大。一旦该病传入，将对我国柑橘产业造成极大危害。柑橘冬生疫霉褐腐病原菌引起的柑橘冬生疫霉褐腐病害是在澳大利亚西部的柑橘果实上首次发现的，随后在其他国家和地区也陆续发现。该疫病是侵染柑橘引起的是一种毁灭性病害，侵染初期，果实表皮出现浅褐色变色，感染部位皮质坚硬，湿度适合时长出白色菌丝体。受害果实味苦、具腐臭味。中国的柑橘种植区域广泛，地理气候多样，有适合病害发生的地区，故定殖可能性大。 近距离传播方式有风雨、工具等传播途径，远距离传播主要以土壤、果实、繁殖材料进行传播。该病害一直持续困扰着意大利、葡萄牙等地的柑橘生产。
柑橘枝瘤病原菌Sphaeropsis tumefaciens Hedges,主要危害墨西哥酸橙、来檬和大多数的橘科植物。表现枝瘤和丛枝两类症状,但以枝瘤及枝瘤溃疡为主。带病的植物组织可传病原菌。病原菌可借风、雨等近距离传播，带病的植物组织如树枝、病叶以及繁殖材料是远距离传播病原菌的途径。许多柑橘栽培种都对此病敏感，影响极大。2008年5月 22日，欧盟食品安全局发布由法国当局完成的关于柑橘有害生物的风险评估报告就包括了该病原菌的评估。
目前针对疫霉属真菌的系统发育已有部分研究，针对柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的分子检测技术也有PCR检测的报道。2008年，张海峰等比较分析了冬生疫霉和其它疫霉的ITS序列，在此基础上设计了 I对检测冬生疫霉的特异引物751F/752R，该对引物可从冬生疫霉菌中扩增到一条长616 bp的DNA条带，而其它19种疫霉和其它真菌均无扩增条带。其检测限度可达到每25 UL反应体系只需10 fg基因组DNA的水平，但带菌柑橘样品的扩增条带不特别明显。
针对柑橘枝瘤病原菌，目前，柑橘枝瘤病原菌的检测仅见到有使用通用引物ITS4 和ITS5进行PCR检测的报道。从NCBI的数据库中搜索，也只有区区2条核糖体序列。因此，PCR引物设计成了难题。
由上可见，柑橘枝瘤病原以及柑橘冬生疫霉褐腐病原菌是国外的柑橘中常见的两种对柑橘的危害很大的两种病菌，因此提供一种更高灵敏性的同时检测上述两种病菌的检测方法，成了本领域内的研究热点。发明内容`
本发明解决了上述背景技术中的难题，提供了一种基于二重PCR扩增检测柑橘枝瘤病原以及柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的方法，该方法步骤简单、能够有效果的对两种病菌进行检测。
实现本发明上述目的所采用的技术方案为
一种基于二重PCR扩增检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法，其特征在于包括以下步骤(I)、取一只无菌离心管，在离心管中依次加入灭菌去离子水、PCR缓冲液、dNTPs混合物、正义引物PHIB1、反义引物PHIB2、正义引物SPT1、反义引物 SPT2、目标物DNA以及TaqDNA聚合酶，然后将其混合均匀后离心，将反应液离心至管底；
(2)、将离心管置于PCR仪上进行扩增，扩增后得到PCR反应产物；
(3)、PCR产物用2%-3%琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭溶液染色12_20min后， 在紫外透射仪上观察PCR反应结果。
步骤(I)中所述的PCR缓冲液为IO X PCR缓冲液，所加入的去离子水、PCR缓冲液、 dNTPs混合物、正义引物PHIB1、反义引物PHIB2、正义引物SPT1、反义引物SPT2、目标物DNA 以及TaqDNA聚合酶之间的体积比为16 2. 5 1 1 1 1 1 1 :0. 5，其中正义引物PHIB1、反义引物PHIB2、正义引物SPTl以及反义引物SPT2的浓度均为10 μ M，dNTPs混合物的浓度为2. 5 mM each, TaqDNA聚合酶的浓度为5υ/μ 1，目标物DNA的浓度为100-200 ng/μ I。
步骤(2)中扩增的程序为94°C3min，94°C 30S，62°C 30S，72°C 30S，循环 32-36 次，最后72°C补时5min。
本发明提供的基于二重PCR扩增检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法有以下优点(I)、该方法能准确诊断出柑橘是否携带有这两种检疫性的病原真菌；(2)该方法采用二重PCR的方法，只需要半天就可以鉴定出柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的种类，可以快速通关；(3)该方法重复性好，灵敏度高，目标物DNA只需要 IOOng/ μ L就可以鉴定出柑橘携带病原真菌的种类。
图1为实施例1中的凝胶电泳检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明。
本实施例中菌种柑橘冬生疫霉褐腐病原菌(Phytophthora hibernalis Carne)购自美国ATCC菌种保藏中心，编号为32995 ，并严格按照检疫危险性菌种进行操作与使用。 使用前经过DNA的PCR扩增、克隆和测序的验证。
本实施例所用菌种柑橘枝瘤病原菌(Sphaeropsis tumefaciens Hedges)购自美国ATCC菌种保藏中心，编号为20908 ，并严格按照检疫危险性菌种进行操作与使用。使用前经过DNA的PCR扩增、克隆和测序的验证。
本实施例中目标物DNA的提取方法如下将100 μ I浓度为IO7孢子悬液涂布于铺有灭菌玻璃纸的PDA和V8平板上，18°C下培养7-10天，刮取 菌丝冷冻备用。取O. 5g菌丝，置于离心管中，加2ml己预热(65°C)的CTAB提取缓冲液中，将离心管颠倒混匀，65°C 水浴5min,轻轻混勻;力口入等体积的苯酌·:氯仿:异戍醇(25:24:1),混勻，12000r/min离心15min，取上清液于离心管中，再加入等体积氯仿异戊醇(24:1)混匀，12000r/min离心 15min，取上清液于离心管中，加入2倍体积的100%乙醇颠倒混匀，12000r/min离心lOmin，倾去上清液，用70%乙醇将沉淀洗涤两次。洗涤结束后将含有DNA的离心管置于37°C温箱中干燥。干燥后加30 μ I TE溶解沉淀，于-20°C保存备用。
以下实施例中正义引物PHIBl的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示 5，-TCGGGTCTGAGCTAGTAGTCTT-3’ ；反义引物 PHIB2 的核苷酸序列如 SEQ ID NO 2 所示 5，-CTTCCACAACCAATTCCATTATGC-3。正义引物 SPTl 的核苷酸序列如 SEQ ID NO 3 所示 5' -GAACGCAGCGAAATGCGATAAG- 3';反义引物 SPT2 的核苷酸序列如 SEQ ID NO :4 所示 5' -ATGCTNAAGTTCAGCGGGTAT- 3' 。
实施例1
本实施例中二重PCR反应体系的总体积为25μ 1，具体的检测方法如下(1)取一只无菌离心管，在离心管中依次加入灭菌去离子水、PCR缓冲液、浓度为2. 5mM each的 dNTPs混合物、浓度为1(^11的正义引物？!1181、浓度为10 μ M的反义引物PHIB2、浓度为 10 μ M的正义引物SPT1、浓度为10 μ M的反义引物SPT2、浓度为lOOng/μ I的目标物DNA以及浓度为5υ/μ I的TaqDNA聚合酶，各物质的体积分别为:16 μ 1、2· 5 μ 1、1 μ 1、1 μ 1、1 μ1、 1μ1、1μ1、1μ1、0. 5μ1。然后将其混合均匀后离心,将反应液离心至管底。
(2)、将离心管置于PCR仪上进行扩增，扩增程序为94°C下3min，94°C下30S， 62°C下30S，72°C下30S，循环36次，最后72°C下补时5min，扩增后得到PCR反应产物。
(3)、PCR产物用3%琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭溶液染色20min后，在紫外透射仪上观察PCR反应结果。
结果显示应用引物对PHIB1/PHIB2与SPT1/SPT2进行二重PCR扩增，同时检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌，在琼脂糖凝胶上可以观察到仅有泳道5上有2 条清晰的特异性的DNA片段(307bp和407 bp)，如图1所示，图1中泳道M，DL2000;泳道 1，冬生疫霉菌+水；泳道2，枝瘤病原菌+水；泳道3，冬生疫霉菌+PHIB，泳道4，枝瘤病原菌+SPT ;泳道5，冬生疫霉菌+枝瘤病原菌+PHIB +SPT ;泳道6，冬生疫霉菌+SPT ;泳道7， 枝瘤病原菌+ PHIB0
实施例2
本实施例中二重PCR反应体系的总体积为25μ 1，具体的检测方法如下(1)取一只无菌离心管，在离心管中依次加入灭菌去离子水、PCR缓冲液、浓度为2. 5mM each的 dNTPs混合物、浓度为1(^11的正义引物？!1181、浓度为10 μ M的反义引物PHIB2、浓度为 10 μ M的正义引物SPT1、浓度为10 μ M的反义引物SPT2、浓度为200ng/μ I的目标物DNA以及浓度为5υ/μ I的TaqDNA聚合酶，各物质的体积分别为14 μ 1、2. 5 μ1、I μ1、I μ1、I μ1、 I μ IU μ 1>1 μ1、0. 5μ1。然后将其混合均匀后离心,将反应液离心至管底。
(2)、将离心管置于PCR仪上进行扩增，扩增程序为94°C下3min，94°C下30S， 62°C下30S，72°C下30S，循环33次，最后72°C下补时5min，扩增 后得到PCR反应产物。
(3)、PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭溶液染色13min后，在紫外透射仪上观察PCR反应结果。
结果显示应用引物对PHIB1/PHIB2与SPT1/SPT2进行二重PCR扩增，同时检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌，在琼脂糖凝胶上可以观察到有2条清晰的特异性的 DNA 片段(307bp 和 407 bp)。
氨基酸序列表<ιιο>:中华人民:ft.和W湖北出入境检验检疫局<120>；检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法<!60> 4<210> I <211> 22 <212> DNA <213>:人工序列 <400>:1tcgggtctga gctagtagtc tt72<210> 2 <21 > 24<212> DNA <213>人Τ:序列 <400> 2cttccacaac caartccatt atgc<210>3 <211>22<212>；DNA <213>:人工序列<400>3gaacgcagcg aaatgcgata ag22
<210> 4 <211> 21 <212> DNA<213>:人工序列 <400> 4atgctnaagt tcagcgggta t2权利要求
1.一种基于二重PCR扩增检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法，其特征在于包括以下步骤(1)、取一只无菌离心管，在离心管中依次加入灭菌去离子水、PCR缓冲液、dNTPs混合物、正义引物PHIB1、反义引物PHIB2、正义引物SPT1、反义引物SPT2、目标物DNA以及TaqDNA聚合酶，然后将其混合均匀后离心，将反应液离心至管底； (2)、将离心管置于PCR仪上进行扩增，扩增后得到PCR反应产物； (3)、PCR产物用2%-3%琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭溶液染色12-20min后，在紫外透射仪上观察PCR反应结果。
2.根据权利要求1所述的基于二重PCR扩增检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法，其特征在于步骤(I)中所述的PCR缓冲液为IOXPCR缓冲液，所加入的去离子水、PCR缓冲液、dNTPs混合物、正义引物PHIB1、反义引物PHIB2、正义引物SPT1、反义引物SPT2、目标物DNA以及TaqDNA聚合酶之间的体积比为16 :2. 5:1 1 1 :1 :1 :1 :0. 5，其中正义引物PHIB1、反义引物PHIB2、正义引物SPTl以及反义引物SPT2的浓度均为10 μ M，dNTPs混合物的浓度为2. 5 mM each, TaqDNA聚合酶的浓度为5U/ μ 1，目标物DNA的浓度为 100-200 ng/μ I。
3.根据权利要求1所述的基于二重PCR扩增检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法，其特征在于步骤(2)中扩增的程序为94°C 3min，94°C 30S，62°C 30S，72°C 30S，循环 32-36 次，最后 72°C补时 5min。
全文摘要
本发明提供了一种基于二重PCR扩增检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法，包括以下步骤首先取一只无菌离心管，在离心管中依次加入灭菌去离子水、PCR缓冲液、dNTPs混合物、正义引物PHIB1、反义引物PHIB2、正义引物SPT1、反义引物SPT2、目标物DNA以及TaqDNA聚合酶，然后将其混合均匀后离心，将反应液离心至管底；将离心管置于PCR仪上进行扩增，扩增后得到PCR反应产物；将PCR产物用2%-3%琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭溶液染色12-20min后，在紫外透射仪上观察PCR反应结果。本发明提供的方法步骤简单、能够有效果的对两种病菌进行检测。
文档编号C12Q1/04GK103031383SQ20121058342
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者王振华, 张建坤, 徐家文, 冯汉利 申请人:中华人民共和国湖北出入境检验检疫局