专利名称：测定生防真菌和化学药剂对靶标病原菌增效作用的方法
技术领域：
本发明涉及农业病虫害防治领域，具体地说，涉及一种测定生防真菌和化学药剂对靶标病原菌增效作用的方法。
背景技术：
随着生物农药的不断出现和投入生产应用，农业病虫害的防治已进入真正意义上的化学防治与生物防治并存的新时代。将生防菌剂应用于防治植物病害，减少化学药剂的绝对用量，符合人们对生态保护和食品安全的要求，符合绿色植保的发展方向。生物农药应用于农业病虫害的防治，与化学药剂相遇将是不可回避的问题。生物测定表明，大部分化学药剂对生防菌有一定的抑制作用，只有少数化学药剂对特定的生防菌无抑制作用，所以有选择地使用生防菌剂与化学药剂才能使两者共同作用于病原菌。如果不清楚两者的相互作用关系，将两者任意结合，可能出现的化学药剂对生防菌的抑制作用消弱或完全限制生防菌剂对病源菌的作用，达不到对植物病害防治的预想效果。由此可见，探明生防菌剂与化学药剂两者对病原菌的协同作用机制，将化学防治技术和生物防治技术有效地结合在一起并应用于防治植物病害之中成为亟待解决的问题。化学药剂之间的协同作用评价方法已经得到广泛地应用，例如，1925年提出的Abbott法多用于两种杀虫剂混用增效作用的评价，1960年提出的Gowing法多用于除草剂混用联合作用的评价，1967年提出的Wadely法用于两种杀菌剂混用增效作用的评价。鉴于生物农药与化学农药的协同作用的评价方法尚未见到报道，建立生防菌剂与化学药剂协同作用的评价系统，研究生防菌剂与化学药剂之间的相互作用关系，筛选合理的生防菌剂与化学药剂组合或指导二者的合理应用具有现实意义。
发明内容
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本发明的目的是提供一种测定生防真菌和化学药剂对靶标病原菌增效作用的方法。由于不同类别的化学药剂与生防真菌的协同作用要求采用不同的评价方法。因此，本申请是在菌丝生长速率法的基础上，采用对峙接种培养来测定生防真菌与化学药剂(杀菌剂)协同对靶标病原菌的抑制作用，形成了不同于化学药剂之间协同作用的新评价方法。化学药剂与生防真菌协同作用于靶标菌，理想的目标是二者产生对靶标菌的增效作用。这种作用要显著大，而二者自身的相互抑制作用要尽量小，也就是说，促进大于抵消。不考虑生防真菌对化学药剂的反作用，也不考虑靶标菌对化学药剂和生防真菌的反作用，那么化学药剂与生防真菌对靶标菌的抑制应大于化学药剂对生防真菌的抑制，生防真菌才有对病原菌的作用。为了实现本发明目的，本发明的一种测定生防真菌和化学药剂对靶标病原菌增效作用的方法，包括以下步骤:
I)以相同的接种量，将生防真菌和靶标病原菌同时接种于含有化学药剂的培养基中进行对峙培养，培养一段时间后，测量菌落半径，生防真菌和靶标病原菌的菌落半径分别以RTt和RBt表示；同时设置对照培养，以与对峙培养相同的接种量，将生防真菌和靶标病原菌分别接种于不含所述化学药剂的，且与对峙培养使用的相同的培养基中进行培养，培养条件及培养时间与对峙培养相同，培养结束后测量菌落半径，生防真菌和靶标病原菌的菌落半径分别以Rra和Rbck表示；2)根据公式(I)计算协同系数:协同系数(S)= (RBt - Rbck)/(RTt - Rtck)公式(I)若S彡1.5,表不生防真菌和化学药剂具有增效作用，若I < S < 1.5,表不生防真菌和化学药剂具有相加作用，若S < I，表示生防真菌和化学药剂具有拮抗作用。前述方法中所述生防真菌为真菌生物农药，所述化学药剂为农用杀菌剂等。前述方法中所述靶标病原菌为植物病原真菌。前述方法中，接种对象为真菌的菌丝或菌饼。前述方法中所述生防真菌和化学药剂对靶标病原菌具有抑制作用。本发明的优点在于:本方法能评价出对生防真菌没有抑制作用以及对生防真菌抑制作用较小的化学药剂(杀菌剂)与所述生防真菌的协同增效作用，能准确评价并淘汰掉杀菌剂与生防真菌协同增效不明显的组合。理论上讲，当杀菌剂对生防真菌有抑制作用时，随着浓度的增大，其与生防真菌协同增效作用越小。本发明方法获得的结果与上述推断相一致，经离体叶片法验证增效作用并采用Abbott法进一 步检验其增效作用大小，表明本方法准确性高。与Gowing法、Abbott法相比,本方法不仅能评价出对生防真菌没有抑制作用或者抑制作用较小的化学药剂与生防真菌的协同增效作用，还能够评价出杀菌剂低浓度范围与生防真菌存在的微弱的协同增效作用。生防真菌与化学药剂可以组合在一起，并且二者共同作用可以促进对病菌的抑制；这种促进的程度是可以进行评价的。本评价方法可以找出生防真菌与化学药剂共同应用的剂量范围，对开发和评价生防真菌与化学药剂的共同应用有实际意义。
图1为本发明实施例1中对照培养组中哈茨木霉菌和番茄灰霉菌的菌落半径。图2为本发明实施例1中对峙培养组中哈茨木霉菌和番茄灰霉菌的菌落半径。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1对峙培养测定木霉菌(生防真菌)与啶酰菌胺对灰霉菌(病原菌)的协同作用I 目的木霉菌属于真菌，筛选出具备对农业病原菌有抑制作用的菌株经过工程化后用于农业病害的防治。这些菌株对同一种杀菌剂的敏感性不同，同一菌株对不同种杀菌剂的敏感性也不同；杀菌剂对真菌的抑制作用是有选择性的，一种杀菌剂对真菌的抑制作用程度也表现在不同浓度范围内。实践中对生防木霉菌绝对没有抑制作用的杀菌剂很少，而是存在一定的范围内，需要一一对应测定。建立木霉菌与杀菌剂协同增效的评价方法时要求必须能准确评价出木霉菌与各种杀菌剂的协同增效作用。2材料和药剂2.1供试菌株生防菌:哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum), T-S-2单抱菌株病原菌:番爺灰霉菌(Botrytis cinerea), B-Z-13-2单孢菌株2.2供试培养基马铃薯琼脂培养基(PDA)2.3供试药剂99.6%唳酰菌胺(boscalid)原药(巴斯夫欧洲公司)原药0.0lg用ImL有机溶剂(丙酮)溶解后,加水配制成IX 104μ g/mL的母液，4°C保存备用。3试验方法分别准确量取啶酰菌胺母液稀释成0、0.125,0.25,0.5、1、5 μ g/mL六个不同的梯度浓度，用移液枪吸取药液2mL加入已灭菌的18mL PDA中，制成含药PDA平板，在平板上以相同的接种量同时接种经活化培养(25°C，2天)的木霉菌和灰霉菌菌饼(两菌饼相距3cm，菌饼直径5mm)，进行对峙培养(图2);以单独接入木霉菌和番茄灰霉菌的平板为药剂对照；同时设置对照培养(图1)，以与对峙培养相同的接种量，分别将木霉菌和灰霉菌接种于不加药的PDA平板作为空白对照。倒置于25°C恒温培养箱中培养48h。每个浓度处理重复4次，试验重复3次。培养结束后测量各处理的菌落半径，取平均值。根据公式(I)计算协同系数(S):S= (Rm - Rbck) / (Rn - Rtck)公式(I)其中，Rm表示对峙培养组中灰霉菌菌落相向半径Rlt表示对峙培养组中木霉菌菌落相向半径Rbck表示对照培养组中灰霉菌菌落半径Rtck表示对照培养组中木霉菌菌落半径上述协同系数计算 公式中，减去对照值是为了消除试验误差。gSSl.5，表示生防木霉菌和啶酰菌胺具有增效作用，若I < S < 1.5，表示二者具有相加作用，若S < I，表示二者具有拮抗作用。4 结果表I对峙培养测定木霉菌与啶酰菌胺对灰霉菌的抑制作用
权利要求
1.一种测定生防真菌和化学药剂对靶标病原菌增效作用的方法，其特征在于，包括以下步骤 1)以相同的接种量，将生防真菌和靶标病原菌同时接种于含有化学药剂的培养基中进行对峙培养，培养一段时间后，测量菌落半径，生防真菌和靶标病原菌的菌落半径分别以RTt和Rm表示；同时设置对照培养，以与对峙培养相同的接种量，将生防真菌和靶标病原菌分别接种于不含所述化学药剂的，且与对峙培养使用的相同的培养基中进行培养，培养条件及培养时间与对峙培养相同，培养结束后测量菌落半径，生防真菌和靶标病原菌的菌落半径分别以Rtck和Rbck表不； 2)根据公式(I)计算协同系数 协同系数(S) = (RBt - Rbck)/(RTt - Rtck)公式(I) 若S > 1. 5，表示生防真菌和化学药剂具有增效作用，若I < S < I. 5，表示生防真菌和化学药剂具有相加作用，若S < I，表示生防真菌和化学药剂具有拮抗作用。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述生防真菌为真菌生物农药。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述化学药剂为杀菌剂。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述靶标病原菌为植物病原真菌。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，接种对象为菌丝或菌饼。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述生防真菌和化学药剂对靶标病原菌具有抑制作用。
全文摘要
本发明涉及一种测定生防真菌和化学药剂对靶标病原菌增效作用的方法，将生防真菌和病原菌同时接种于含有化学药剂的培养基中进行对峙培养，培养一段时间后，测量菌落半径，生防真菌和病原菌的菌落半径分别以RTt和RBt表示；同时设置对照培养，将生防真菌和靶标病原菌分别接种于不含所述化学药剂的培养基中，培养条件及培养时间与对峙培养相同，培养结束后测量菌落半径，生防真菌和靶标病原菌的菌落半径分别以RTCK和RBCK表示，根据(RBt–RBCK)/(RTt–RTCK)计算协同系数(S)，若S≥1.5，表示生防真菌和化学药剂具有增效作用，若1≤S＜1.5，表示二者具有相加作用，若S＜1，表示二者具有拮抗作用。
文档编号C12Q1/18GK103255198SQ201310148580
公开日2013年8月21日 申请日期2013年4月25日 优先权日2013年4月25日
发明者马志强, 牛芳胜, 毕秋艳 申请人:河北省农林科学院植物保护研究所