二甲双胍在制备治疗淋巴瘤疾病药物中的应用的制作方法

专利名称：二甲双胍在制备治疗淋巴瘤疾病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及二甲双胍的新用途，具体地说，是二甲双胍在制备治疗淋巴瘤疾病药物中的应用。
背景技术：
淋巴瘤是一种起源于淋巴结或结外淋巴组织的恶性肿瘤。随着环境污染的加重、 生活节奏的加快及人口老龄化，淋巴瘤的发病率越来越高，并且呈现年轻化趋势。据世界卫生组织统计，恶性淋巴瘤发病率年增长率为7. 5%，是目前发病率增长最快的恶性肿瘤之一。全球每年约有35万新发病例，死亡人数超过20万。我国恶性淋巴瘤发病率为0.02%。， 每年新增病例2. 5万人，死亡2万人，呈上升趋势。恶性淋巴瘤的发病年龄以儿童和青壮年最为多见，是儿童最常见的恶性肿瘤之一。死于淋巴瘤的患者平均年龄为49. 9岁，明显低于所有恶性肿瘤平均死亡年龄58. 2岁。恶性淋巴瘤分为霍奇金淋巴瘤(Hodgkin Lymphoma，HL)和非霍奇金淋巴瘤 (Non-Hodgkin Lymphoma, NHL)两类，其中，以NHL为主，大约占到80_90%。NHL常常采用联合化疗、放疗、免疫靶向治疗及骨髓移植等综合治疗方案。CHOP方案一直是NHL治疗的标准方案，虽然对60% 70%患者有效，但是仍有30%-40%的淋巴瘤患者对治疗无效或治疗后迅速复发，疾病进展快，预后差。因此寻找新的治疗方法就显得犹为重要，尤其是特异性靶向淋巴瘤细胞生存相关的信号传导途径药物的研究已成为目前淋巴瘤研究的热点。AMPK是一个主要的细胞能量感应器，近来研究发现AMPK是mTOR上游信号分子，成为新陈代谢和肿瘤相互关系中的一个关键的因子。AMH(是一异源三聚体，包括α催化亚单位和β、Y调节亚单位。在人类各有2到3个不同的基因编码各亚单位(α 1，α 2，β 1， β 2, γ 1, γ2, Y 3)，因此有12种可能的组合。AMPK是一个能量感应器，处于非激活状态。 当细胞内能量耗竭，ΑΜΡ/ΑΤΡ比例升高时，ΑΜΡΚ172位苏氨酸残基被上游激酶磷酸化而激活。比如葡萄糖缺乏、缺氧、氧化应激、高渗、组织缺血、肌肉收缩等情况下ATP消耗，AMP上升，激活AMPK。ΑΜΗ(—旦被激活，即通过增加葡萄糖摄取、糖酵解、脂肪酸氧化等分解代谢过程，减少脂肪酸、胆固醇、蛋白质合成等ATP消耗过程而恢复细胞内能量水平。当细胞内存在足够的能量资源，细胞才进行有丝分裂，因此ΑΜΗ(可以作为一个理想的能量监视器。二甲双胍是一个双胍类抗糖尿病药物，用于临床已有50年历史。流行病学资料显示使用二甲双胍的糖尿病的患者癌症的发生率低，如乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌等，这一现象促进了大家对AMPK/mTOR途径的认识。研究发现服用二甲双胍的糖尿病患者与服用磺脲类降糖药的糖尿病患者相比，癌症的发生率降低23%。在另一个研究中，10309 个糖尿病患者分2组，一组用二甲双胍，另一组用磺脲类药物，后一组肿瘤相关死亡率明显高于二甲双胍组。研究资料显示，二甲双胍对这些瘤细胞有显著的抑制作用。最新的临床资料表明，患有糖尿病的乳腺癌患者接受化疗及二甲双胍联合用药有一个更高的病理学完全缓解率。二甲双胍通过提高肝和肌肉对胰岛素敏感性而控制血糖。二甲双胍通过胰岛素受体增强其信号，减少糖尿病患者胰岛素耐受，成为胰岛素增敏器。二甲双胍也通过抑制肝糖异生而降低胰岛素水平。另外，肥胖、胰岛素耐受、高胰岛素血症及其相关的雄激素增多症参与乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌等恶性肿瘤的起动，这与二甲双胍使用者癌症低发生率相符合。在分子水平，二甲双胍通过激活AMPK，AMPK调节下游控制细胞增殖的信号通路。 在上皮细胞二甲双胍活化AMPK，抑制mTOR活性，进而抑制mRNA翻译，蛋白合成及细胞增殖。 但是关于二甲双胍在制备治疗淋巴瘤疾病药物中的应用目前还未见报道。

发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种二甲双胍在制备治疗淋巴瘤疾病药物中的应用。本发明的再一的目的是，提供一种具有协同作用的治疗淋巴瘤的组合药物。本发明的另一的目的是，提供一种具有协同作用的治疗淋巴瘤的组合药物的应用。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是二甲双胍在制备治疗淋巴瘤疾病药物中的应用。淋巴瘤细胞为2-8X IO5个细胞/毫升时，二甲双胍的使用量为10_20mM。二甲双胍在制备治疗Burkitt’ s淋巴瘤药物中的应用。二甲双胍在制备治疗弥漫大B细胞淋巴瘤药物中的应用。二甲双胍在制备治疗T细胞急性淋巴母细胞白血病药物中的应用。二甲双胍在制备治疗耐6巯基嘌呤的T细胞急性淋巴母细胞白血病药物中的应用。二甲双胍在制备治疗皮肤T细胞淋巴瘤药物中的应用。二甲双胍在制备治疗Kappas间变大细胞淋巴瘤药物中的应用。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是一种具有协同作用的治疗淋巴瘤的组合药物，所述的组合药物由二甲双胍和阿霉素组成。所述的二甲双胍和阿霉素的比例为1. 25-20 mM: 6. 25_50ng/ml。一种具有协同作用的治疗淋巴瘤的组合药物，所述的组合药物由二甲双胍和地塞米松组成。所述的二甲双胍和地塞米松的比例为1.25-20 mM: 1-1000 nM。一种具有协同作用的治疗淋巴瘤的组合药物，所述的组合药物由二甲双胍和mTOR 抑制剂iTemsirolimus组成。所述的二甲双胍和Temsirolimus 的比例为 1. 25-20 mM: 0. 1-10 nM。为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是所述的组合药物在制备治疗淋巴瘤疾病药物中的应用。所述的组合药物在制备治疗Burkitt淋巴瘤、或弥漫大B细胞淋巴瘤、或T细胞急性淋巴母细胞白血病、或皮肤T细胞淋巴瘤药物中的应用。本发明优点在于
1、通过使用本发明的药物，可以抑制恶性淋巴瘤细胞生长增殖，使淋巴瘤细胞株周期阻滞，上调P21，调节AMPK/mTOR信号传导通路；
2、本发明开拓了传统降糖药物二甲双胍的新用途，二甲双胍费用低，安全，耐受性好， 易被患者接受，抑制淋巴瘤细胞生长增殖，并且提高淋巴瘤细胞对化疗药物阿霉素和mTOR 抑制剂Temsirolimus的敏感性，为淋巴瘤的治疗提供了新的策略。


图IA =MTT实验中二甲双胍处理各种淋巴瘤细胞株(SU-DHL-4、Namalwa, DB、 SU-DHL-5、Daudi、Jurkat、6-TCEM、Kappas、H9、Hut78 ) IC50 结果。图IB 不同浓度二甲双胍处理Daudi、SU-DHL_4、Hut78和Jurkat细胞株72小时。 显示二甲双胍对4个细胞株都存在增殖抑制作用，且存在剂量依赖性。图 IC :10mM 二甲双胍处理 Daudi、SU-DHL_4、Hut78 和 Jurkat 细胞株 24、48、72 小时。显示二甲双胍对4个细胞株的增殖抑制作用存在时间依赖性。图2A 流式细胞分析显示，IOmM 二甲双胍处理细胞36小时后，4个细胞株都引起 G0/G1 期阻滞。ClGO/Gl 期，S 期， ■ G2/M 期。图2B :10mM二甲双胍处理细胞24、36及48小时后。免疫印迹结果显示，二甲双胍上调P21，但不影响P27、P53和CyclinDl。图3A :10mM 二甲双胍处理细胞24、36及48小时。免疫印迹结果显示，二甲双胍上调 p-AMPK,导致下游 p-mTOR、p_P70S6K、ρ_4Ε_ΒΡ1 水平降低。图3B IOmM 二甲双胍处理Jurkat细胞24、36及48小时。AKT和P-AKT无明显变化。图3C 二甲双胍对AKT过表达的Jurkat细胞抗增殖效应和Jurkat细胞类似。图3D 二甲双胍和AKT特异性抑制剂MERCK124005共同作用于Jurkat细胞，二甲双胍的抗增殖效应未受影响。图4A 二甲双胍提高B淋巴瘤细胞Daudi、SU-DHL_4对化疗药物阿霉素、地塞米松和mTOR抑制剂Temsirolimus的敏感性。图4B 二甲双胍提高T淋巴瘤细胞Hut78和Jurkat对化疗药物阿霉素、地塞米松和mTOR抑制剂Temsirolimus的敏感性。图 5A =AMPK siRNA 转染 Jurkat 细胞，AMPK siRNA Jurkat 细胞 AMPK 表达下调。图 5B =AMPK siRNA Jurkat 细胞与 Con siRNA Jurkat 细胞相比，P21 的诱导上升和mTOR的抑制效应也被削弱。图5C:Con siRNA Jurkat 细胞存在G0/G1 期周期阻滞效应，而 AMPK siRNA Jurkat 细胞G0/G1期周期阻滞效应被取消。图5D =AMPK siRNA Jurkat细胞二甲双胍的抑制作用被减弱，同时，也削弱了二甲双胍对阿霉素和Temsirolimus增敏作用。图6A:10 mM二甲双胍应用48小时后原代白血病/淋巴瘤细胞生长抑制为33. 5%。图6B 不同剂量二甲双胍应用48小时对造血干细胞的影响。图6C 腹腔注射二甲双胍抑制小鼠Daudi移植瘤生长，分小剂量组(2 mg/kg)和大剂量组(4 mg/kg)。
图6D 腹腔注射二甲双胍抑制小鼠Jurkat移植瘤生长，分小剂量组(2 mg/kg)和大剂量组(4 mg/kg)。图6E 二甲双胍治疗组Daudi细胞P21表达明显上调。图6F 二甲双胍治疗组Jurkat细胞P21表达明显上调。图6G 二甲双胍联合阿霉素治疗Daudi组，明显抑制小鼠移植瘤生长。图6H 二甲双胍联合阿霉素治疗Jurkat组，明显抑制小鼠移植瘤生长。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。 实施例一、实验方法
(一)试剂
二甲双胍购自Sigma公司，用PBS溶解。MTT，碘化丙啶(PI)，蛋白酶抑制剂，抗GAPDH 抗体购自Sigma公司。P21、P27、cyclin Dl抗体，辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠二抗， 羊抗兔二抗和鼠抗羊二抗均购自Santa Cruz公司。P53、AMPK、P-AMPK、mTOR、p-mTOR、 P70S6K、p-P70S6K、4EBP-l、p-4EBP_l、AKT、p-AKT，购自 Cell Signaling 公司。AKT 抑制剂 MERCK124005 购自 Merck 公司。( 二 )细胞培养
本研究应用了以下几种人淋巴瘤细胞株Burkitt’ s淋巴瘤细胞株Namalwa、Daudi，该病即Burkitt淋巴瘤(BL)；弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株SU-DHL-4、SU-DHL-5、DB, T细胞急性淋巴母细胞白血病细胞株Jurkat，耐6巯基嘌呤的T细胞急性淋巴母细胞白血病细胞株 6T-CEM，皮肤T细胞淋巴瘤细胞株Hut78和H9，Kappas间变大细胞淋巴瘤。所有细胞株均购自美国ATCC，均用含10%热灭活胎牛血清(Hyclone or Gibco)的RPMI1640培养液培养， 置于37°C、95%空气、5%C02湿度培养箱中培养。隔日换液，调整细胞浓度为3-5X105/ml。 用台盼蓝计数计算细胞存活率。瑞氏染色法观察细胞形态学改变。(三)MTT 实验
检测不同浓度的二甲双胍对各淋巴瘤细胞株的增殖抑制作用，计算半数生长抑制浓度 (IC50)o各淋巴瘤细胞株，以每孔20000个细胞接种于96孔板中，分别用终浓度为1、10、20 和40mM的二甲双胍处理细胞。72小时后，向每孔中加入0. Img MTT, 37°C孵育4小时，在分光光度计490nm处检测标本吸光度值。每个药物浓度设3复孔，并重复3次实验。(四)流式细胞仪检测细胞周期
收集1-2 X IO6细胞，PBS洗涤，_20°C下75%乙醇固定过夜。检测前加50mg/L的RNA酶 37°C孵育30分钟，50mg/L的PI染色，流式细胞仪检测。(五)免疫印迹分析
收集各处理组细胞 6X106，用 100μ1 RIPA 裂解液(50mM Tris-HCl pH 8. 0,150mM NaCl，0. 1% SDS, 1% Nonidet P-40,0. 5% Na-deoxycholate)，加入终浓度各为 ImM 的 PMSF、 NaF、Na3VO4和lPg/ml cocktail蛋白酶抑制剂置于冰上，裂解30分钟，12000rpm离心20 分钟后，收集上清即为总蛋白；再加入1/5体积的6XLoading Buffer (0. 35mM Tris-HClpH6. 8,10% SDS, 5% β -mercaptoethanol, 36% glycerol, 0. 012% Bromophenol Blue)煮沸 10分钟，分装-80°C冻存。取蛋白在含SDS的89Γ15%聚丙烯酰胺凝胶中电泳，然后转移至 PVDF膜上；PVDF膜用 TBS(20mM Tris-Hcl PH7. 4,150mM NaCl)配制的 5%脱脂牛奶室温封闭1小时，之后与一抗在4°C孵育过夜。经TBS-T(20mM Tris-Hcl PH7. 4,150mM NaCl, 0. 1% Tween20)漂洗3次，每次10分钟后，在摇床上与辣根过氧化物酶偶联的二抗室温孵育 1 小时。再用 TBS-T 漂洗 3 次 X 10 分钟。用 Chemiluminescent Western Detection System (Cell Signaling Technology，USA)进行化学发光显影，X光片记录影像。GAPDH作为内参调整不同样品的上样量。条带的信号强度用Quantity One version 4. 4.0 software软件分析。(六)免疫组化染色
用superfrost玻璃片捞片，60°C烘烤30分钟后，在Vatana半自动免疫组化仪上进行抗原修复及染色。(七)AMPKsiRNA转染淋巴瘤细胞
(1)取Jurkat细胞2 X 106，离心后弃上清，尽可能吸弃上清。(2)配转染液solution ν 82μ1 + supplement 1 18μ1 + 质粒。(3)用转染液重悬细胞，转入电转杯，加盖。(4)电转，选择程序X-001。(5)取出电转杯后，加500μ1预热培养基后，小心转入12孔板，终体积^iil。(6) 24小时后加嘌呤霉素，筛选浓度ml, 10-14天后浓度减半维持。(A)建立Daudi，Jurkat细胞淋巴瘤小鼠模型
雌性裸鼠(5-6周)购自上海实验动物中心，在无菌条件下饲养。注射Daudi细胞的裸鼠接种M小时前进行300c Gy照射。每只小鼠右侧肩部皮下注射l*107Daudi细胞， 4*107Jurkat细胞，3周左右在注射部位可及可测量的肿瘤，开始注射药物治疗。小鼠随机分组，一组为对照组，对照组注射相同量的PBS，二甲双胍腹腔注射治疗组分二组，小剂量组 (2 mg/kg)和大剂量组(4 mg/kg)，每日一次；连续治疗21天。二甲双胍联合阿霉素组分四组对照组，阿霉素组，二甲双胍口服治疗组，二甲双胍联合阿霉素组。对照组注射相同量的 PBS ；阿霉素组ang/kg，每周二次，连续二周；二甲双胍口服治疗组，口服:3mg/kg，二甲双胍联合阿霉素组，二甲双胍口服:3mg/kg和阿霉素ang/kg，每周二次，连续二周。每组6只小鼠，每2天记录小鼠肿瘤的长径(a)和短径(b)。第35天处死小鼠，取出肿瘤分3部分，一部分做电镜，一部分瞬时冰冻-80°C保存，另一部分中性甲醛固定，石蜡包埋。(九)统计分析
实验结果采用三次独立实验的平均值和标准差表示，用t检验比较差异。P值小于0. 05 认为有统计学差异。所有统计采用SPSS16.0软件。二、实验结果
(一)二甲双胍抑制淋巴瘤细胞株生长
用MTT法检测二甲双胍对人淋巴瘤细胞株生长的影响。二甲双胍对所有细胞株的半数生长抑制浓度(IC5tl)在8. 5 21. 2mM之间(图1A)。不同浓度的二甲双胍对所有被检测的细胞株均有生长抑制作用。Daudi细胞显示对二甲双胍的抑制作用最敏感，其余B细胞如 Namalwa、SU-DHL-5，DB 和 T 细胞如 Jurkat、6T_CEM、Kappas、Hut78 和 H9 的 IC5tl 介于 15 20mM之间。SU-DHL-4和Jurkat对二甲双胍相对不敏感。图IB为Daudi, SU-DHL-4和Hut78、 Jurkat的剂量效应曲线。图IC为4个细胞株的时间效应曲线，表明二甲双胍对淋巴瘤细胞株生长抑制作用存在剂量和时间依赖性。淋巴瘤细胞2-8X IO5个细胞/毫升时，二甲双胍的使用量为10-20mM。(二)二甲双胍对人类淋巴瘤细胞株有周期阻滞
我们用IOmM 二甲双胍分别处理Daudi、SU-DHL-4、Hut78和Jurkat 4个细胞株，36小时后检测细胞周期(图2A)。结果显示，对照组Daudi和SU-DHL-4的G0/G1期的比例分别为 32. 6%士 1. 0%、33. 5%士4. 6%, 二甲双胍(IOmM)治疗组分别为 54. 6%士2. 3%,47. 8%士 1%。 两组相比均有显著统计学意义(P < 0. 001 ；P < 0.01)。T细胞淋巴瘤/白血病细胞株 Hut78 和 Jurkat 也有相似的结果。(45. 9%士5. 9%,62. 3%士9. 5%, P < 0. 05 ；44. 5%士 1. 9%, 51. 2%士 1. 1%，P < 0. 01)。(三)二甲双胍上调P21，但不影响P27、P53和CyclinDl
细胞周期由周期蛋白如CyclinDl，周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂P21，P27及抑癌蛋白P53 (图2B)。P21蛋白在肿瘤细胞中几乎不表达或弱表达，经二甲双胍处理后，其表达水平随处理时间的延长而显著升高。这说明二甲双胍通过P21上调阻滞肿瘤细胞进入细胞周期，抑制肿瘤细胞的增殖和生存。已有研究表明，P27在许多人类肿瘤中是低表达甚至检测不到其活性。在淋巴瘤细胞株，我们检测到P27的表达。但用二甲双胍处理细胞后，未检测到P27的显著上调，说明二甲双胍并不通过P27这条信号通路来发挥作用。抑癌蛋白 P53负调节细胞周期，我们发现P53在Daudi和SU-DHL-4两个B淋巴瘤细胞株中高表达， 而在Hut78和Jurkat两个T淋巴瘤细胞株中弱表达，当用二甲双胍处理细胞后，P53未有明显变化。D型的周期蛋白在Gl期特别重要，有三种D型周期蛋白(Dl、D2、D3)，CyclinDl 在调节所有类型细胞的Gl期中起核心作用。在细胞Gl期，有丝分裂信号如生长因子，激活 CyclinDl基因的转录，增加了 CyclinDl-⑶K4/6复合物的浓度，促进细胞通过调控点，进入下一个调控节点。但是二甲双胍对CyclinDl未有明显的影响。因此二甲双胍能使4个细胞株的P21明显上调，而CyclinDl，P27，P53不变。二甲双胍所致的肿瘤细胞生长抑制是由于P21上调阻滞细胞周期引起的。(四)二甲双胍上调AMPK活性
在乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，胰腺癌，二甲双胍通过激活AMPK发挥抗肿瘤活性。因此我们推测二甲双胍的抗淋巴瘤增殖活性涉及的是相同的信号通路。免疫印迹分析显示，二甲双胍能刺激AMPK磷酸化，并明显地下调下游的效应分子mTOR，P70S6K, 4E-BP1的磷酸化 (图3A)。以上结果表明，二甲双胍通过活化AMI3K来干扰淋巴瘤细胞生长。mTOR的抑制可能会促发负反馈调节，导致AKT信号的活化。而AKT是细胞内重要的促存活分子。若负反馈激活AKT会削弱二甲双胍的抗肿瘤效应。然而我们发现二甲双胍未引起总AKT和P-AKT的增加(图;3B)。同时二甲双胍对AKT过表达的Jurkat细胞抗增殖效应和Jurkat细胞类似(图3C)。而且二甲双胍和AKT特异性抑制剂MERCK124005共同作用于Jurkat细胞，二甲双胍的抗增殖效应未受影响(图3D)。以上资料表明二甲双胍未引起 AKT信号的活化。(五)二甲双胍提高淋巴瘤细胞对化疗药物和mTOR抑制剂Temsirolimus的敏感性二甲双胍联合化疗药物如阿霉素、地塞米松及mTOR抑制剂"Temsirol imus处理Daudi、SU-DHL-4、Hut78和Jurkat 4个细胞株，72小时后通过MTT检测细胞生长抑制率。结果显示二甲双胍显著增加这些药物对淋巴瘤的细胞毒作用，即使在一个相对小的浓度1. 25mM 时也能发挥作用。因此二甲双胍能提高化疗药物的敏感性(图4A、B)。二甲双胍与阿霉素作为具有协同作用的治疗淋巴瘤的组合药物时，二甲双胍和阿霉素的比例为1. 25-20 mM: 6. 25-50ng/ml ；二甲双胍与地塞米松作为具有协同作用的治疗淋巴瘤的组合药物时，二甲双胍和地塞米松的比例为1.25-20 mM: 1-1000 nM ； 二甲双胍与Temsirolimus作为具有协同作用的治疗淋巴瘤的组合药物时，二甲双胍和 Temsirolimus 的比例为1. 25-20 mM: 0. 1-10 nM。为了检测二甲双胍的抗增殖效应是否为AMPK依赖的，我们使用了 AMPK小干扰RNA 转染Jurkat细胞。图5A显示AMPK siRNA Jurkat细胞与Con siRNA Jurkat细胞相比， AMPK的表达下调。图5B显示P21的诱导上升和mTOR的抑制效应也被削弱了。同时二甲双胍处理AMPK siRNA Jurkat细胞，G0/G1期周期阻滞效应也被取消(图5C)。Jurkat细胞 AMPK- α亚单位下调后，部分抵消了二甲双胍对Jurkat细胞的抑制作用。同时也削弱了二甲双胍对阿霉素和Temsirolimus增敏作用(图5D)。因此二甲双胍对淋巴瘤的的抗增殖效应为AMPK依赖性。(六)二甲双胍对患者原代细胞的作用
为了进一步确定二甲双胍对原代细胞的作用，我们收集了 3例T-细胞白血病/淋巴瘤患者的骨髓标本。MTT结果显示，IOmM 二甲双胍应用48小时后肿瘤细胞生长抑制为33. 5% (图6A)。另外，我们也观察了二甲双胍对正常人造血干细胞的影响，结果发现二甲双胍应用 48小时后，对从外周血分离的⑶34+造血干细胞没有明显生长抑制作用(图6B)。(七)二甲双胍抑制移植小鼠中肿瘤生长
我们通过小鼠移植瘤模型研究了二甲双胍在体内的抗白血病/淋巴瘤活性。在所用的四种细胞株中，接种Daudi和Jurkat细胞后，裸鼠接种部位出现瘤块，并且，所有裸鼠在皮下接种细胞观天后，接种部位都出现了瘤块。二甲双胍腹腔注射治疗组，小剂量组(2 mg/ kg)和大剂量组(4 mg/kg)裸鼠的瘤体积明显小于对照组裸鼠的瘤体积(图6C、D)。为了进一步证实体外P21在细胞周期阻滞中的作用，我们通过免疫组化方法检测了瘤组织切片中P21表达情况，结果显示治疗组肿瘤细胞P21表达明显高于对照组(图6E、 F)。体外试验中，二甲双胍增加阿霉素的化疗敏感性，在小鼠移植瘤模型中，我们进一步验证了该结果。二甲双胍联合阿霉素治疗组裸鼠的瘤体积明显小于对照组及单一药物治疗组裸鼠的瘤体积，进一步在体内证实了二甲双胍的增敏作用(图6G、H)。三、讨论
本发明显示，二甲双胍在体内和体外实验中对淋巴瘤细胞有抑制作用。首次把二甲双胍用于淋巴细胞恶性肿瘤的治疗。二甲双胍通过上调P21，细胞周期阻滞于G0/G1期而抑制淋巴瘤细胞生长。文献也有类似报道，Zhuang等研究显示，二甲双胍上调乳腺癌细胞P21 致细胞周期阻滞。除了淋巴瘤细胞株，二甲双胍还抑制原代T-白血病/淋巴瘤细胞的增殖， 对从外周血分离的⑶34+造血干细胞没有明显毒性，保证了二甲双胍临床使用的安全性。 而且二甲双胍显著抑制小鼠移植瘤的生长，没有明显的全身毒性。这预示着二甲双胍有可能成为治疗肿瘤的一个老药新用的例子。本发明探讨了二甲双胍对细胞周期的影响。本发明发现二甲双胍可导致G0/G1期阻滞，这个结果与其它文献报道一致。本发明进一步探讨了对细胞周期相关蛋白的影响。细胞周期由周期蛋白如CyclinDl，周期蛋白依赖性蛋白激酶(⑶K)及⑶K抑制剂(CKI)P21， P27等。周期蛋白和相应的蛋白激酶形成复合物，蛋白激酶获得活性，推动细胞周期不断运行。而CKI能抑制大多数CDK的激酶活性。既往研究显示在乳腺癌细胞中二甲双胍下调 CyclinDl，导致细胞周期阻滞，并且周期阻滞效应依赖P21和P27的存在。在胰腺癌细胞中， 二甲双胍下调CyclinDl，上调P27致细胞周期阻滞。本发明的研究发现对于淋巴瘤细胞二甲双胍上调P21，从而阻滞细胞周期，抑制肿瘤细胞增值和生存，但CyclinDl、P27、P53未见明显变化。在细胞有丝分裂期，AMPK是一个重要的参与者。AMPK是mTOR上游信号分子，具有肿瘤抑制活性，成为新陈代谢和肿瘤相互关系中的一个关键的因子二甲双胍活化能量感受器AMPK，抑制肿瘤细胞生长。本发明研究显示二甲双胍激活AMPK而抑制下游的mTOR信号。既往研究显示在乳腺癌细胞中AMH(上调P21和P53导致细胞周期阻滞。本发明的研究发现对于淋巴瘤细胞二甲双胍上调P21，但P53未见明显变化。本发明用AMPK-α si RNA 下调AMPK来进一步研究AMPK的作用。本发明发现，不仅二甲双胍的G0/G1期周期阻滞效应被削弱，而且对淋巴瘤细胞的抑制作用和对阿霉素和Temsirolimus增敏作用也被削弱。 说明二甲双胍对淋巴瘤的的抗增殖效应为AMH(依赖性。实际上，AMPKa催化亚单位的活化形式和细胞中间体和中心体的有丝分裂调节因子相互作用协调细胞有丝分裂时基因分开的基本生理过程，而这也与AMPK的肿瘤抑制活性有着直接的关系。mTOR信号控制mRNA翻译和蛋白合成，在淋巴瘤细胞中持续活化。二甲双胍不仅能调节细胞周期，它还调节mTOR信号通路。本发明的结果也显示，二甲双胍以AMPK依赖的方式抑制mTOR信号，从而抑制淋巴瘤细胞生长。mTORCl特异性抑制剂雷帕霉素及其衍生物CCI779已经作为抗肿瘤药物应用于临床试验。但是临床试验表明这两种化合物的抗肿瘤效应有限。比如在急性髓系白血病AML或与化疗药物联合使用时抗肿瘤效应有限。其原因有AKT反馈性地激活和P-4EBP1持续高表达。而二甲双胍未导致AKT反馈性地激活，且能显著下调P-4EBP1。而且二甲双胍与mTOR抑制剂CCI779有协同效应，更加提示二甲双胍在淋巴瘤治疗中的有效性。二甲双胍能增加化疗药物的抗肿瘤效应。二甲双胍抑制耐药的卵巢癌细胞的增殖，P21上调，细胞周期阻滞，P-mT0R降低。回顾性分析显示把二甲双胍作为乳腺癌一个新的辅助治疗可以提高病人病理学完全缓解率。本发明研究显示小剂量二甲双胍和化疗药物有协同效应。体内，二甲双胍显著加强阿霉素的疗效。这些结果表明有必要在以后的临床试验中进一步评估二甲双胍的抗肿瘤效应。总之，淋巴瘤存在mTOR信号通路的失调，故靶向AMPK的治疗提供了一个机会。二甲双胍便宜，安全，耐受性好，为淋巴瘤的治疗提供新的策略。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.二甲双胍在制备治疗淋巴瘤疾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，淋巴瘤细胞为2-8X IO5个细胞/毫升时， 二甲双胍的使用量为10-20mM。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，二甲双胍在制备治疗Burkitt’s淋巴瘤药物中的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，二甲双胍在制备治疗弥漫大B细胞淋巴瘤药物中的应用。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，二甲双胍在制备治疗T细胞急性淋巴母细胞白血病药物中的应用。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，二甲双胍在制备治疗耐6巯基嘌呤的T细胞急性淋巴母细胞白血病药物中的应用。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，二甲双胍在制备治疗皮肤T细胞淋巴瘤药物中的应用。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，二甲双胍在制备治疗Kappas间变大细胞淋巴瘤药物中的应用。
9.一种具有协同作用的治疗淋巴瘤的组合药物，其特征在于，所述的组合药物由二甲双胍和阿霉素组成。
10.根据权利要求9所述的组合药物，其特征在于，所述的二甲双胍和阿霉素的比例为 1.25-20 mM: 6.25-50ng/mlo
11.一种具有协同作用的治疗淋巴瘤的组合药物，其特征在于，所述的组合药物由二甲双胍和地塞米松组成。
12.根据权利要求11所述的组合药物，其特征在于，所述的二甲双胍和地塞米松的比例为 1. 25-20 mM: 1-1000 nM。
13.一种具有协同作用的治疗淋巴瘤的组合药物，其特征在于，所述的组合药物由二甲双胍和mTOR抑制剂Temsirolimus组成。
14.根据权利要求13所述的组合药物，其特征在于，所述的二甲双胍和Temsirolimus 的比例为 1. 25-20 mM: 0. 1-10 nM。
15.根据权利要求9-14任一所述的组合药物在制备治疗淋巴瘤疾病药物中的应用。
16.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述的组合药物在制备治疗Burkitt’s 淋巴瘤、或弥漫大B细胞淋巴瘤、或T细胞急性淋巴母细胞白血病、或皮肤T细胞淋巴瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及二甲双胍在制备治疗淋巴瘤疾病药物中的应用。本发明还提供一种具有协同作用的治疗淋巴瘤的组合药物及其应用。本发明优点在于通过使用本发明的药物，可以抑制恶性淋巴瘤细胞生长增殖，使淋巴瘤细胞株周期阻滞，上调P21，调节AMPK/mTOR信号传导通路；本发明开拓了传统降糖药物二甲双胍的新用途，二甲双胍费用低，安全，耐受性好，易被患者接受，抑制淋巴瘤细胞生长增殖，并且提高淋巴瘤细胞对化疗药物阿霉素和mTOR抑制剂Temsirolimus的敏感性，为淋巴瘤的治疗提供了新的策略。
文档编号A61K31/704GK102327256SQ201110282718
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月22日 优先权日2011年9月22日
发明者施文瑜, 王黎, 肖丹, 赵维莅 申请人:上海交通大学医学院附属瑞金医院