一种检测宫颈癌标志物cdkn2a抗原表位多肽及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通过生物信息学模拟筛选的具有检测宫 颈癌标志物CDKN2A多肽片段，人群流行病学检测验证了其检测敏感度及特异度，为进一步 用于制备宫颈癌早期诊断试剂盒奠定基础。
【背景技术】
[0002] 大量研宄表明，血清或血浆中的肿瘤相关抗原能诱导机体产生自身抗体，在肿瘤 患者血清中既存在肿瘤抗原，也存在针对该肿瘤抗原的自身抗体。因此，既可以利用抗体检 测肿瘤抗原，也可以利用抗原检测肿瘤抗原的自身抗体，但利用肿瘤自身抗体检测肿瘤的 特异性和敏感性均比利用肿瘤抗原检测肿瘤要高得多。很多肿瘤相关抗原不仅在肿瘤患者 体内存在，在正常人体内也存在，因此检测肿瘤相关抗原作为诊断依据可信性差。而肿瘤 自身抗体在正常人体内含量很低检测不到或根本不存在，若体内肿瘤自身抗体水平明显增 高，则表明体内存在异常免疫情况，表明体内相关抗原水平发生波动，预示疾病的存在或原 有疾病加重。
[0003] 近年来的研宄表明，在恶性肿瘤体积发展到可用现代影像学技术检出之前3-5 年，患者血中可出现高浓度的肿瘤相关抗原自身抗体。因此，检测血中肿瘤相关抗原自身抗 体具有预测肿瘤发病风险和早期诊断肿瘤的重要价值。是肿瘤临床诊断领域的重点发展方 向之一。在国外已有诊断肺癌和乳腺癌的早期诊断试剂盒市售。然而，目前所报道的自身 抗体检测方法敏感度低，特异性差，假阴性比率可高达50%以上。其主要原因是由于每一种 肿瘤相关抗原自身抗体在癌症患者中的阳性检测率平均在10%左右。如何提高诊断试剂敏 感度是当前需要亟待解决的关键问题。比较行之有效的方法是寻找新的可充当肿瘤标志物 的自身抗体，然后与现有已知的肿瘤相关抗原自身抗体组合成具有敏感度高和特异性强的 诊断试剂盒。
[0004] 多重肿瘤抑制基因⑶KN2A，又名pl6,定位于人类染色体9p21的抑癌基因，直接参 与细胞周期调控，它编码一种分子量为1584?a的蛋白质，内含有一个的开放阅读框架，由 148个氨基酸组成。⑶KN2A基因可直接作用于细胞周期，抑制细胞的分裂；⑶KN2A蛋白可抑 制细胞周期依赖性激酶4和6,阻止细胞从Gl期进入S期，从而抑制癌细胞成长。当CDKN2A 基因失活，引起Gl期缩短，细胞周期加速，特别是DNA在没有修复前过早进入S期，这可能 是细胞恶化的关键。
[0005] ⑶KN2A蛋白位于细胞浆和细胞核内。除脑、骨骼和肌肉外，广泛地表达于各种组织 器官。当患者接受化疗、放疗后，肿瘤细胞死亡会释放出大量的CDKN2A蛋白的碎片，诱导免 疫系统产生自身抗体。
【发明内容】
[0006] 本发明提供一种检测宫颈癌标志物CDKN2A抗原表位多肽及应用。
[0007] 本发明采取的技术方案是：
[0008] -种检测宫颈癌标志物⑶KN2A抗原表位多肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1所述。
[0009] H-DWLATAAARGRVEEVRGALPNAPNSYGRRPDC-OH
[0010] 其纯度 >95%，pH>7. 0。
[0011] 本发明所述的检测宫颈癌标志物CDKN2A抗原表位多肽在制备宫颈癌早期诊断试 剂盒中的应用。
[0012] 本发明利用自行设计的⑶KN2A蛋白的线性多肽，采用ELISA法检测宫颈肿瘤患者 血清及血浆中抗CDKN2A蛋白的特异性自身IgG抗体。自身IgG抗体水平升高表明肿瘤患 者体内CDKN2A蛋白的表达量增加，预示患者可能出现原发性或继发性宫颈癌，可以预测宫 颈癌发生与复发的危险性，指导临床医生对宫颈癌的早期诊断。
[0013] 本发明优点是通过自行设计的CDKN2A的抗原表位多肽，检测宫颈癌患者血清及 血浆中自身抗体表达水平并开发相应的试剂，预测宫颈癌发生的危险性，并为制备宫颈癌 早期诊断试剂奠定基础。
【附图说明】
[0014] 图1是宫颈癌患者体内抗⑶KN2A的IgG抗体水平的ROC曲线分析图。
【具体实施方式】
[0015] -种检测宫颈癌标志物⑶KN2A抗原表位多肽的氨基酸序列，如SEQIDNO:1所 述。
[0016] H-DWLATAAARGRVEEVRGALPNAPNSYGRRPDC-OH
[0017] 其纯度 >95%，pH>7. 0。
[0018] 本发明所述的检测宫颈癌标志物CDKN2A抗原表位多肽在制备宫颈癌早期诊断试 剂盒中的应用。
[0019] 抗原抗体的结合实际上只发生在抗原决定簇和抗体的抗原结合位点之间，两者在 空间结构和空间构型上完全互补。因此抗原决定簇就可以代表整个蛋白与抗体结合的状 态与亲和特性。另外，以重组蛋白为抗原，要经过载体构建、转染、表达、筛选、纯化等繁琐的 过程，蛋白空间结构复杂，抗原表位不易暴露，因此抗原抗体结合的特异性差。另外，ELISA 法的高灵敏性对纯化技术的稳定性要求极高，成本昂贵。
[0020] 本发明人遵循以下原则设计线性多肽抗原：①选择细胞膜蛋白表面区域；②选择 不形成a-helix的序列；③两端的肽段比中间的排列合理；④避免蛋白内部重复；⑤避免同 源性强的肽段；⑥序列中尽量避免Cys和Glu，不可以有太多的Pro,但有1-2个Pro利于 肽链结构稳定，对产生特异性抗体有益。此外，该多肽抗原必须含有人类白细胞二类抗原 (HLA)系统的限制性表位，包括HLA-DR，HLA-DPandHLA-DQ的限制性表位。这些表位可被 90%以上华人群体的HLA二类抗原系统所识别。基于以上抗原设计原则及CDKN2A蛋白的 生物学特性，本发明利用生物信息学和多个表位预测模拟软件，分析与抗原性相关的参数， 设计了的线性氨基酸序列。CDKN2A线性多肽抗原由30个氨基酸残基组成，共含11个重叠 表位，可检测至少11种单克隆抗体，具有高度的特异性。
[0021] 下面结合具体实验例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例子仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。
[0022] ELISA法检测抗原表位
[0023] 采用ELISA方法，对收集的血液进行检测，并得到各样本OD值进行分析。
[0024] 质控：各样本设双复孔，取平均OD值。OD值离散度判定：离散度=0D1-0D2/ 0D1+0D2,离散度< 0. 1，为有效结果；离散度>0. 1，为无效结果。取100份健康人血清等体 积混合作为质控血（Qualitycontrol,QC)，代表人群的普遍情况，每板均设2个QC血衆孔， 以QC血浆孔的OD值变异水平判定结果的稳定性，批间变异CV=所有批次QC孔SD/所有 批次QC孔OD均值〈20 %。批内变异CV=每日各板QC孔SD/每日各板QC孔均值〈10 %。
[0025] 数据分析：采用SPSS17.Oforwindows进行统计学分析。采用特异结合指数 (Specificbindingindex，SBI)来判定Q3KN2A抗原多肽与血衆自身抗体的结合程度，SBI =CDKN2AOD值-NCOD值/QCOD值-NCOD值，NC为各样本的阴性对照。利用t检验 分别比较恶性肿瘤与健康对照之间SBI值之间的差异，a= 0. 05。
[0026] ROC曲线是根据一系列不同的二分类方式（分界值或决定阈），以真阳性率（灵敏 度）为纵坐标，假阳性率（1-特异度）为横坐标绘制的曲线。ROC曲线下的面积值在1.0和 0. 5之间。在AU>0. 5的情况下，AU越接近于1，说明诊断准确度越好。ROC曲线将灵敏度 与特异性以图示方法结合在一起，可准确反映某分析方法特异性和敏感性的关系，是试验 准确性的综合代表。该发明采用Analyse-itforMicrosoftExcel软件绘制ROC曲线，计 算曲线下面积（AU)，判定灵敏度和特异度。
[0027] 本发明应用CDKN2A抗原多肽检测到宫颈肿瘤患者血清及血浆中的特异性自身 IgG抗体，并且该反应具有尚特异性和尚灵敏性。
[0028] ⑶KN2A抗原表位多肽可用于制备宫颈癌早期诊断试剂盒。
[0029] 实施例1、试剂盒制备
[0030] 1、试剂：试剂配制见表1?6。
[0031] 表1抗原包被缓冲液（400ml体积）
[0032]
【主权项】
1. 一种检测宫颈癌标志物CDKN2A抗原表位多肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所述。
2. 如权利要求1所述的检测宫颈癌标志物CDKN2A抗原表位多肽在制备宫颈癌早期诊 断试剂盒中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种检测宫颈癌标志物CDKN2A抗原表位多肽及应用，属于生物技术领域。检测宫颈癌标志物CDKN2A抗原表位多肽的氨基酸序列如SEQ？ID？NO：1所述，所述的检测宫颈癌标志物CDKN2A抗原表位多肽在制备宫颈癌早期诊断试剂盒中的应用。优点是通过自行设计的CDKN2A的抗原表位多肽，检测宫颈癌患者血清及血浆中自身抗体表达水平并开发相应的试剂，预测宫颈癌发生的危险性，并为制备宫颈癌早期诊断试剂奠定基础。
【IPC分类】G01N33-564, G01N33-574, G01N33-68, C07K14-47
【公开号】CN104558147
【申请号】CN201510028522
【发明人】刘林林
【申请人】刘林林
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月20日