睫状神经营养因子突变体及其修饰型突变体和用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体而言，涉及一种修饰型睫状神经营养因子突变体、 DNA、重组表达载体、遗传工程宿主细胞、修饰型睫状神经营养因子突变体、所述睫状神经营 养因子突变体以及修饰型睫状神经营养因子突变体的用途、药物组合物。
【背景技术】
[0002] 睫状神经营养因子（Ciliaryneurotrophicfactor,简称为CNTF)是一种小分子 蛋白，全长由200氨基酸组成，分子量在23KD左右。CNTF在体内以两个二聚体形式进行储 存，经过酶解成单体后发生生物学作用。CNTF可以促进包括运动神经元、感觉神经元、交感 神经元、海马神经元等多种神经细胞和神经胶质细胞的生长和分化。
[0003]CNTF因为最初是从鸡的睫状体中提取出来，并可维持鸡副交感神经节的存活而得 名。90年代，在将人源CNTF用于治疗肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS)的实验研究中发 现，对一组ALS患者进行临床研究发现病人的体重大大降低，使用药物组体重比安慰剂组 明显降低。CNTF曾被用来治疗肌萎缩侧索硬化症（ALS)，但因副反应太大及疗效不确切而 终止了临床实验，但在实验中意外地发现用药者的体重都明显下降。后Regeneron公司根 据这一发现，开发了重组人CNTF药物并已完成肥胖症的三期临床实验，并取得了统计学上 具有显著性差异的结果。研究表明CNTF可通过激活位于下丘脑的受体而对机体的体重设 定点进行调节，从而起到减少摄食、减轻体重的作用。针对这一结果进行在肥胖症领域进 行实验，结果表明CNTF在体内可与下丘脑的特异性受体结合，激活抑制食欲的关键信号通 路，抑制进食欲望且使机体不会产生饥饿感，从而使体重减轻。研究发现，CNTF具有多种功 能，能促使多种神经细胞的存活、营养肌肉，促进糖、脂代谢和调节能量平衡以及摄食行为。 在神经系统，肌肉系统，肥胖症极其相关疾病的治疗中具有重要意义和广阔的临床前景。
[0004] 而由于CNTF在治疗或预防肥胖症及其相关疾病中存在半衰期短，活性较低的缺 陷，目前现有技术中已开发出了各种CNTF的突变体（或称变异体），因此CNTF突变体的常 规制备方法对于本领域技术人员是已知的。
[0005] 例如中国专利申请公开No.CN1687413A公开了一种CNTF突变体（hCNTF)，该 hCNTF的第17位的半胱氨酸替换为丙氨酸；第63位的谷氨酰胺替换为精氨酸；第64位的 组氨酸替换为丙氨酸；去除hCNTF的C末端1-30个氨基酸。此外，CN1687413A还公开了一 种CNTF突变体，其第17位半胱氨酸变为丝氨酸，并去掉C端的16个氨基酸。
[0006] 中国专利申请公开No.CN1387568A公开了一种商品化的CNTF突变体--Axl5,其 63位的谷酰胺酸被突变为精氨酸、而且C末端的15个氨基酸被取代，以及第17位的半胱氨 酸被替换。
[0007] 而上述CNTF突变体虽然在治疗或预防相关疾病的活性有所提高，但是仍存在半 衰期短，免疫原性高以及活性较低的缺陷，临床中需要多次注射才能获得令人满意的疗效， 这给病人带来巨大的经济压力、精神压力和身体反应。因此，目前急需开发出一种具有较高 活性且疗效时间较长的CNTF突变体药物势在必行。
[0008] 而现有技术中已知使用聚乙二醇（PEG)修饰蛋白的方法有如下益处：分子量增 大、半衰期延长、免疫原性降低。PEG拥有独特的亲-疏水平衡。当偶联到药物分子表面 时，将其优良性质赋予修饰后的药物，改变它们在水溶液中的生物分配行为和溶解性，在其 修饰的药物周围产空间屏障，减少药物的酶解。覆盖蛋白表面的抗原决定簇，降低蛋白的免 疫原性。增加蛋白的分子量和体积，减少肾小球的滤过作用，使蛋白在体内作用时间更长。 PEG于1940年首次商业生产化。PEG的使用通过了美国FDA认证，符合美国药典（USP)、国 家处方集（NF)、食品化学法典（FCC)标准，被广泛应用于食品、饲料、个人护理品、化学、医 药化工等生产生活领域。因此，人们希望使用PEG或PEG类聚合物对CNTF进行修饰，以提 高药物的疗效，延长药物在体内作用的时间，并降低使用次数。
[0009] 例如，中国专利申请公开No.CN101185762A公开了一种使用PEG类聚合物修饰 CNTF突变体的方法。但是由于CNTF突变体中，具有极性的氨基酸残基的侧链基团均能够进 行化学修饰，即在CNTF或CNTF突变体中至少有赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨 酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和肽链的N-端氨基和C-端羧基等。因此，在实践中发 现使用PEG类聚合物对CNTF或CNTF突变体的修饰位点不稳定，结果造成很难获得修饰后 性状均一的修饰产物。
【发明内容】
[0010] 为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种修饰型睫状神经营养因子 突变体、DNA、重组表达载体、遗传工程宿主细胞、修饰型睫状神经营养因子突变体、所述睫 状神经营养因子突变体以及修饰型睫状神经营养因子突变体的用途、药物组合物。
[0011] 具体而言，本发明提供：
[0012] (1) 一种睫状神经营养因子突变体，其中，所述的睫状神经营养因子突变体是通过 在睫状神经营养因子的氨基酸序列的基础上，保留了第17位的半胱氨酸，将第63位的谷氨 酰胺突变为精氨酸，并且去除了C末端的15个氨基酸而得到的。
[0013] (2)根据（1)所述的睫状神经营养因子突变体，其中，所述的睫状神经营养因子突 变体具有SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。
[0014] (3) -种DNA，其中，所述DNA的核苷酸序列为编码根据⑴或⑵所述的睫状神 经营养因子突变体的核苷酸序列。
[0015] (4)根据⑶所述的DNA，其中，所述DNA的核苷酸序列为SEQIDNO:4所示的核 苷酸序列。
[0016] (5) -种重组表达载体，其中，所述重组表达载体含有（3)或（4)的核苷酸序列。
[0017] (6)根据（5)所述的重组表达载体，其中，所述重组表达载体为如图1所示的 PET24a+/CNTFnew/CC22 表达载体。
[0018] (7) -种遗传工程宿主细胞，其中，所述宿主细胞含有（5)或（6)所述的重组表达 载体。
[0019] (8)根据（7)所述的遗传工程宿主细胞，其中，所述宿主细胞为CNTFnew/CC22工程 菌。
[0020] (9) -种修饰型睫状神经营养因子突变体，其中，所述的修饰型睫状神经营养因子 是通过对根据（1)或（2)所述的睫状神经营养因子突变体的第17位半胱氨酸进行定点修 饰而得到的，所述定点修饰是通过在所述的第17位半胱氨酸上结合化学修饰剂而实现的。
[0021] (10)根据（9)所述的修饰型睫状神经营养因子突变体，其中，所述化学修饰剂为 聚乙二醇或聚乙二醇类聚合物。
[0022] (11)根据（10)所述的修饰型睫状神经营养因子突变体，其中，所述的化学修饰剂 选自：聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺琥珀酸酯、甲氧基聚乙二 醇-琥珀酰亚胺碳酸酯、甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯、甲氧基聚乙二醇-丙醛、甲氧基 聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酯、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺a甲基丁酸酯、甲氧基聚乙 二醇-N-羟基琥珀酰亚胺、甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺或甲氧基聚乙二醇-乙醛；优选为 甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺。
[0023] (12)根据（1)或（2)所述的睫状神经营养因子突变体在制备用于治疗和/或预防 肥胖症及肥胖相关II型糖尿病的药物中的用途。
[0024] (13)根据（9)-(11)中任意一项所述的修饰型睫状神经营养因子突变体在制备用 于治疗和/或预防肥胖症及肥胖相关II型糖尿病的药物中的用途。
[0025] (14) -种用于治疗和/或预防肥胖症及肥胖相关II型糖尿病的药物组合物，其 中，所述的药物组合物包含根据（1)或（2)所述的睫状神经营养因子突变体和/或根据 (9)-(11)中任意一项所述的修饰型睫状神经营养因子突变体。
[0026] 本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
[0027] 1.本发明选择了在蛋白的氨基酸序列中数量相对较少的半胱氨酸，并意外地 发现通过保留在CNTF第17位的半胱氨酸，可以获得修饰专一性高的修饰型睫状神经营 养因子，修饰专一性高于本领域使用的氨基修饰型睫状神经营养因子（例如中国专利 No.CNlOl185762A)，从而克服因修饰而带来的如修饰结果不稳定等系列问题。
[0028] 2.本发明选择了CNTF第17位的半胱氨酸作为定点修饰位点，使重组基因工程 CNTF与原始CNTF蛋白序列与结构最为接近，使重组CNTF突变体蛋白稳定性、可溶性和生物 学活性高于天然蛋白。
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