一种胎球蛋白a重组蛋白及多克隆抗体的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及本生物科学技术领域，特别涉及一种重组胎球蛋白A重组蛋白及其多 克隆抗体的制备方法。
【背景技术】
[0002] 胎球蛋白A(fetuin_A/AHSG)也称之为a-2-HS糖蛋白，是由两个氨基末端抑制 域和一个较小的羧基末端域组成的59kDa分子量的糖蛋白；由肝脏合成，分泌至血流，成年 哺乳动物体内的浓度范围在〇.5-1.Og/L;婴儿期的血清胎球蛋白A含量高，参与蛋白酶抑 制活性，与钙代谢和骨生成调节相关；累积于骨和牙齿内，作为生物学上非胶原骨蛋白的主 要部分，它在人体血液中的含量与外伤感染、心血管疾病、结石、SARS等疾病相关。AHSG具 有高度的遗传多态性，其基因的多态性位点与II型糖尿病、血管钙化和SARS的易感性等相 关，研究表明，胎球蛋白A是循环中主要的钙化抑制剂；干涉钙盐沉淀；近期研究显示低水 平胎球蛋白A的慢性肾脏衰竭患者与心血管病的高死亡率显著相关；另一方面，糖尿病老 年人血清胎球蛋白A含量比正常人高，这是独立于胰岛素抑制剂的其他标记物；另外，高胎 球蛋白A水平还可作为心血管疾病的的危险标记物。
[0003]AHSG有多种生物学功能：能够抑制碱性磷酸I丐（basiccalciumphosphate,BCP) 沉淀，维持体液中钙含量；能够参与巨噬细胞失活，调控炎症程度；能够抑制胰岛素受体自 身磷酸化和其酪氨酸激酶的活性，导致产生胰岛素抵抗和II型糖尿病；能够与转化生长因 子-0(transforminggrowthfactor,TGF-0)结合，进而抑制肠肿瘤的生长。因此，测定 胎球蛋白A的表达量，有很大的价值，通常测定蛋白浓度的方法是通过ELISA等免疫检测方 法来实现的，这就需要效价很高的可用于诊断原料的胎球蛋白抗体。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种胎球蛋白A重组蛋白及多克隆抗体的制备方法，该方法 制备的胎球蛋白A重组蛋白表达产量高，抗体干粉可作为血清学检查的诊断原料。
[0005] 本发明采用的技术方案是：
[0006] -种胎球蛋白A重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：
[0007] (1)胎球蛋白A抗原表位分析：通过抗原表位分析选择目的片段用作胎球蛋白A 的重组表达，所述目的片段的基因序列如序列表中SEQIDNO. 1所示；
[0008] (2)重组胎球蛋白A的合成：将选定的目的片段的DNA通过PCR扩增后插入到表 达载体，然后进行转化大肠杆菌细胞，大肠杆菌在生长的同时，目的蛋白也将得到表达。
[0009] 进一步地，步骤（2)中所述的PCR扩增的引物序列为SEQIDNo. 2和SEQIDNo. 3 所示。
[0010] 一种胎球蛋白A重组蛋白抗体的制备方法，将分离纯化后的权利要求1制备的重 组胎球蛋白A作为抗原去免疫兔子，得到含抗重组胎球蛋白A抗体的抗血清。
[0011] 进一步地，得到含抗重组胎球蛋白A抗体的抗血清后，进行分离纯化，得到抗重组 胎球蛋白A抗体干粉。
[0012] 进一步地，所述的重组胎球蛋白A的分离纯化包括：
[0013] 分离，收集培养的大肠杆菌，离心弃上清；冰上在细胞中加入1/20细胞生长体积 的NTA-OBuffer和PMSF，然后向缓冲体系中加入溶菌酶，置冰上冷却处理；将细胞悬浮起 来，加入10%TritonX-100,使TritonX-100的终浓度为0? 05%，充分混匀，冰上放置15 分钟，间或混匀；冰上超声破碎细胞，后用离心机离心取上清再离心一次，再过0. 22ym的 滤膜过滤；
[0014] 纯化，将Ni-NTA树脂装入合适的层析柱，用10倍柱床体积的NTA-OBuffer冲洗， 然后将样品加到Ni-NTA层析柱中，流速控制在0. 5ml/min，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分 析蛋白质的结合情况；层析用10倍柱床体积的NTA-OBufTer冲洗，流速控制在lml/min，后 用20mM、60mM、200mM和500mM咪唑溶液洗Ni-NTA柱，直至检测G250不变蓝为止，分别收集 流出液体，SDS/PAGE分析，确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。
[0015] 进一步地,所述免疫兔子的具体方法为：取纯化后的重组胎球蛋白A免疫家兔,免 疫剂量为500 - 600ug/只，第一次免疫用弗氏完全佐剂，以后用不完全弗氏佐剂，免疫间隔 时间为2 - 3周，免疫3 - 4次，兔子背部多点注射，静脉采血，得到含抗重组胎球蛋白A抗 体的抗血清。
[0016] 进一步地，所述含抗重组胎球蛋白A抗体的抗血清进行分离纯化的具体步骤为： 将抗血清过ProteinA柱；吸附后进行洗脱；收集的解吸液，透析、冷冻干燥，既得重组胎球 蛋白A抗体干粉。
[0017] 本发明提供的胎球蛋白A抗体的制备方法，通过对胎球蛋白A的抗原表位分析，把 两端没有免疫原性的位点去掉，而对可产生较强免疫原性位点的基因片段选择合适的引物 (参见序列表SEQIDNo. 2和SEQIDNo. 3)进行扩增，并采用该位点的氨基酸序列制备重 组蛋白片段，用此片段免疫动物得到特异性针对该位点的抗体。在重组蛋白制备的中采用 大肠杆菌表达系统，能很好的保证重组蛋白的表达，表达产量高，有利于大批量的制备重组 胎球蛋白A及其抗体，适合于作为诊断原料和疫苗开发的技术。
【附图说明】
[0018] 图1为本发明实施例提供的胎球蛋白A重组蛋白的电泳图。
[0019] 图2为本发明实施例提供的全长表达的胎球蛋白A制备的多克隆抗体和优化后的 片段表达的胎球蛋白A制备的多克隆抗体的免疫胶乳实验对比结果图。
【具体实施方式】
[0020] 实施例1 一种胎球蛋白A重组蛋白及其多克隆抗体的制备方法
[0021] ( -）抗原表位分析
[0022] 采用DNAStar软件进行抗原表位分析，分析结论，SEQIDNo. 1的抗原性良好，抗 原决定簇主要集中在N端22个氨基酸和C端50个氨基酸，根据抗原决定簇分析结果，考虑 将SEQIDNo. 1进行原核表达，并根据序列设计特异性引物。
[0023](二）表达载体的构建
[0024] 1、基因犾取
[0025]I.IRNA提取：利用TRIzol法提取U251细胞总RNA
[0026] 1)取IO6-IO7个细胞于EP管中，PBS清洗后，加入ImlTransZol，吹吸混勻，然后 室温孵育5min;
[0027] 2)加入0. 2ml氯仿，涡旋剧烈震荡15s，室温孵育3min;
[0028] 3)IlOOOrmp4°C离心15min，此时溶液分为3层，RNA主要在上层水相中；
[0029] 4)将无色的水相转移到新的I.5mLEP管中，加入500ul异丙醇，室温孵育IOmin;
[0030] 5)IlOOOrmp4°C离心lOmin，去上清，在侧管和底管形成胶状沉淀；
[0031] 6)加Iml75%乙醇（用DEPC处理的水配制，并现配现用），剧烈涡旋至管底的胶 状沉淀悬其并分散为止；
[0032] 7) 8000rmp4°C离心5min，弃上清，室温晾干沉淀，沉淀溶于30-100ulRNA溶解液 中，保存样品于_7〇°C长期备用。
[0033] 1. 2利用RT-PCR法获取目的基因
[0034]I)RT:按表1将溶液依次从多至少加入PCR管中；
[0035]表1
[0036]
[0037]
【主权项】
1. 一种胎球蛋白A重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 胎球蛋白A抗原表位分析：通过抗原表位分析选择目的片段用作胎球蛋白A的重 组表达，所述目的片段的基因序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示； (2) 重组胎球蛋白A的合成：将选定的目的片段的DNA通过PCR扩增后插入到表达载 体，然后进行转化大肠杆菌细胞，大肠杆菌在生长的同时，目的蛋白也将得到表达。
2. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2)中所述的PCR扩增的引物序列 为 SEQ ID No. 2 和 SEQ ID No. 3 所示。
3. -种胎球蛋白A重组蛋白抗体的制备方法，其特征在于，将分离纯化后的权利要求1 制备的重组胎球蛋白A作为抗原去免疫兔子，得到含抗重组胎球蛋白A抗体的抗血清。
4. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，得到含抗重组胎球蛋白A抗体的抗血清 后，进行分离纯化，得到抗重组胎球蛋白A抗体干粉。
5. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的重组胎球蛋白A的分离纯化包 括： 分离，收集培养的大肠杆菌，离心弃上清；冰上在细胞中加入1/20细胞生长体积的 NTA-OBuffer和PMSF，然后向缓冲体系中加入溶菌酶，置冰上冷却处理；将细胞悬浮起来， 加入10% Triton X-100,使Triton X-100的终浓度为0· 05%，充分混匀，冰上放置15分 钟，间或混匀；冰上超声破碎细胞，后用离心机离心取上清再离心一次，再过0. 22 μ m的滤 膜过滤； 纯化，将Ni-NTA树脂装入合适的层析柱，用10倍柱床体积的NTA-OBuffer冲洗，然后 将样品加到Ni-NTA层析柱中，流速控制在0. 5ml/min，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析 蛋白质的结合情况；层析用10倍柱床体积的NTA-OBufTer冲洗，流速控制在lml/min，后用 20mM、60mM、200mM和500mM咪唑溶液洗Ni-NTA柱，直至检测G250不变蓝为止，分别收集流 出液体，SDS/PAGE分析，确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。
6. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述免疫兔子的具体方法为：取纯化后 的重组胎球蛋白A免疫家兔，免疫剂量为500 - 600ug/只，第一次免疫用弗氏完全佐剂，以 后用不完全弗氏佐剂，免疫间隔时间为2 - 3周，免疫3 - 4次，兔子背部多点注射，静脉采 血，得到含抗重组胎球蛋白A抗体的抗血清。
7. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述含抗重组胎球蛋白A抗体的抗血清 进行分离纯化的具体步骤为：将抗血清过Protein A柱；吸附后进行洗脱；收集的解吸液， 透析、冷冻干燥，既得重组胎球蛋白A抗体干粉。
【专利摘要】本发明提供一种胎球蛋白A重组蛋白及多克隆抗体的制备方法，包括：胎球蛋白A抗原表位分析获得目的片段用作胎球蛋白A的重组表达，将选定的目的片段的DNA通过PCR扩增后插入到表达载体，然后进行转化大肠杆菌细胞，表达重组胎球蛋白A，分离纯化后作为抗原去免疫兔子，得到含抗重组胎球蛋白A抗体的抗血清。本发明能很好的保证重组蛋白的表达，表达产量高，有利于大批量的制备重组胎球蛋白A及其抗体，制备的抗体干粉适合于作为诊断原料和疫苗开发。
【IPC分类】C07K14-47, C07K16-18, C12N15-70
【公开号】CN104558145
【申请号】CN201410848365
【发明人】华权高, 易汪雪, 徐春雷
【申请人】华权高
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月30日