日本血吸虫SjP40蛋白的表达纯化方法及用图
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种日本血吸虫SjP40蛋白的表达纯化方法。
【背景技术】
[0002]现有技术中对日本血吸虫虫卵抗原SjP40的表达纯化方法相对复杂，而且日本血吸虫SjP40蛋白(中国大陆株P40蛋白)的用途没有得到有效开拓，是本领域长期以来一直研究的课题。
[0003]血吸虫病肝纤维化由血吸虫感染所引起，主要表现为以虫卵为中心的炎性肉芽肿形成以及肝纤维化。宿主肝脏中虫卵肉芽肿的形成以及肝纤维化的发生发展，最终将引起宿主出现门脉高压综合征，并发上消化道出血以及肝昏迷，最终导致宿主死亡。与其他诱因导致的肝纤维化一样，血吸虫病肝纤维化的关键环节为肝星状细胞的活化。活化的肝星状细胞中α -平滑肌肌动蛋白(a -SUK)及I型胶原等表达上调，ECM降解受抑，从而逐渐形成肝纤维化。传统观念认为，血吸虫肝纤维化的发生和发展与血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)密切相关，在血吸虫病肝纤维化进程中，SEA能够通过各种途径参与肉芽肿的形成，促进肝纤维化的发生和发展。然而，近年来有研究表明曼氏血吸虫虫卵与肝星状细胞株共同培养时，虫卵能够抑制肝星状细胞中a -SMA以及I型胶原等的表达。该实验室研究者进一步利用日本血吸虫虫卵与肝星状细胞株LX-2共培养，同样发现日本血吸虫虫卵可以抑制LX-2细胞中a -SMA以及I型胶原等的表达。本实验室前期的研究中则发现，利用SEA刺激不同状态的活化的肝星状细胞(LX-2细胞株、TGF-β I活化的原代培养肝星状细胞、日本血吸虫病肝纤维化小鼠模型分离培养的肝星状细胞)，均能抑制a-SMA的表达，主要与TGF-β信号通路相关。然而，SEA作为一种混合蛋白，其组分蛋白尤其Ρ40蛋白对肝星状细胞的作用如何，尚未见报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种简便、易操作的日本血吸虫SjP40蛋白(中国大陆株P40蛋白)的表达纯化方法。
[0005]本发明的目的还在于提供一种日本血吸虫SjP40蛋白的新用途。
[0006]本发明的技术解决方案是:
一种日本血吸虫SjP40蛋白的表达纯化方法，其特征是:包括下列步骤:
(I)重组表达质粒的构建与鉴定
Trizol 提取日本血吸虫虫卵总 RNA:米用 RevertAid First Strand cDNA SynthesisKit,以Oligo ( dT ) 18为模板将mRNA逆转录为cDNA ;根据Genebank数据库中日本血吸虫SjP40序列，利用primer 5.0软件设计SjP40基因上游引物和下游引物，SjP40 上游引物:5’ -GAAATTCGGTGTCGATAAAGC-3’ ；SjP40 下游引物:5’ -CACAAGTGAATATCATCATTACCAT-3’ ；以 cDNA 为模板，PCR 扩增 SjP40 基因；PCR 反应条件::94°C预变性3min;94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸2min，扩增30个循环；72°C继续延伸1min ；PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，胶回收试剂盒纯化^fPCR产物连入PMD19-T载体，连接产物转化入感受态细菌E.col1.DH5 α，挑取阳性克隆，提取质粒，进行测序，测序比对正确的质粒命名为PMD19-T- SJP40 ；
(2)设计引物，在引物两端加入限制性酶切位点及保护碱基，引入酶切位点以下划线表示；上游引物:5’ - GGAATTCCATATGATGTCGGGTACACATCAAAACCATG-3> (Nde I );下游引物:5，-CCCAAGCTTTAATGAGCGATTTCGTGTTGCTTCA-3，(Hind TTT ).以 pMD19_T_ SjP40 为模板进行PCR,PCR 反应条件:94°C 预变性3min;94°C 变性20s，60 °C 退火30s，72°C 延伸 lmin，扩增35个循环；72°C继续延伸5min ；PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，胶回收试剂盒纯化；胶回收产物与pET-28a ( + )质粒分别用Nde I和Hind III限制性内切酶进行双酶切，胶回收试剂盒纯化后，用T4 DNA连接酶连接，构建pET-28a-SjP40重组质粒。重组质粒经PCR和双酶切验证后，进行测序；
(3)重组蛋白的表达及纯化
将重组表达质粒转化至感受态菌E.col1.BL21(DE3)中，挑取阳性克隆，37 °C培养过夜；将菌液以1:100接种于含卡那霉素的液体LB培养基，37°C，200rpm培养至OD值为
0.4-0.6时，分别取出Iml未诱导的菌液作为对照，其余液体中加入异丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白的表达，收集菌体，通过SDS-PAGE电泳分析，鉴定重组蛋白的表达；经过对温度、时间、IPTG浓度等条件进行优化，最终确定诱导表达条件为:0.1mM的IPTG，30°C诱导8h，大量诱导表达后，收集上清，经N1-NTA柱纯化后，透析膜透析，最终使蛋白溶于PBS中，并进行去内毒素处理。一种日本血吸虫SjP40蛋白在制备抑制LX-2细胞中a -SMA以及I型胶原在蛋白水平的表达的制剂中的应用。
[0007]一种日本血吸虫蛋白SjP40在制备抑制由TGF-β I诱导的LX_2细胞的活化的制剂中的应用。
[0008]本发明方法简便、易操作，并提供了日本血吸虫SjP40蛋白的新用途。
【附图说明】
[0009]下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0010]图1是SjP40 PCR产物图(以虫卵cDNA为模板)。
[0011]图2是pET-28a_S jP40重组质粒鉴定示意图。
[0012]图3是rSjP40蛋白原核表达不意图。
[0013]图4是rSjP40原核表达蛋白鉴定(western blot)示意图。
[0014]图5是rSjP40原核表达蛋白对LX_2细胞活化的影响示意图。
[0015]图6是rSjP40原核表达蛋白对TGF-β I诱导的LX-2细胞活化的影响示意图。
[0016]图1 中:M:DL2000 DNA marker I:SjP40 PCR 产物。
[0017]图 2 中:M1: λ Hind III DNA ladder marker 1:pET_28a ( + )质粒 2:pET-28a-SjP40重组质粒3:pET-28a_SjP40重组质粒经Hind III内切酶单酶切产物4:pET-28a-SjP40重组质粒经Nde I和Hind III双酶切产物 5:菌液PCR产物 M2:DL2000DNA marker。
[0018]图3中:Ml:蛋白marker I: N1-NTA柱结合上清后流出液2:漂洗液3_7:含50，100，250，500，750mM咪唑洗脱液洗脱后8:pET-28a-SjP40重组菌诱导表达超声裂解上清液9:纯化后蛋白。
[0019]图4中:1 pET-28a ( + )诱导后蛋白，2 pET-28a_SjP40重组载体诱导后蛋白。
[0020]图5 中:1:阴性对照组(PBS) 2:SjP40 5 μ g /mL 3:10 μ g /mL 4:20 μ g /mL。
[0021]图 6 中:1:control 2:sjP40 3:TGF-^ I 4:TGF_ β 1+sjp40。
【具体实施方式】
[0022](一)材料与方法
1.材料
日本血吸虫虫卵购自江苏省血吸虫病防治研究所，LX-2细胞株购自中南大学湘雅中心实验室细胞库。大肠杆菌(E.colL) DH5a、BL21，原核表达载体pET-28a(+)质粒(Novagen公司产品)，由本室保存；人重组TGF-β I购自sigma公司。
[0023]Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂购自美国Fermentas公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；SYBR Premix Ex TaqTM Kit购自日本Takara公司；鼠抗人a-SMA, I型胶原多克隆一抗购自美国Santa Cruz公司，抗GAPDH抗体购自杭州贤至公司，HRP-标记羊抗兔、羊抗鼠抗体购自美国Santa Cruz公司。胎牛血清购自Hyclone公司，胰酶、DMEM粉(含高糖)购自美国Gibco公司。
[0024]2.方法
2.1重组表达质粒的构建与鉴定
T中国大陆株P40蛋白rizol提取日本血吸虫虫卵总RNA。采用RevertAid FirstStrand cDNA Synthesis Kit,以 Oligo ( dT ) 18 为模板将mRNA 逆转录为 cDNA。根据Genebank数据库中日本血吸虫SjP40序列(序列号:FJ531701.1 )，利用primer 5.0软件设计SjP40基因上游引物和下游引物，SjP40上游引物:5’-GAAATTCGGTGTCGATAAAGC-3’ ；SjP40 下游引物:5’_ CACAAGTGAATATCATCATTACCAT-3’.以 cDNA 为模板，PCR 扩增 SjP40基因。PCR反应条件::94°C预变性3min;94°C变性30s，60°C退火30s，7 2°C延伸2min，扩增30个循环；72°C继续延伸lOmin。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，胶回收试剂盒纯化。将PCR产物连入pMD19-T载体，连接产物转化入感受态细菌E.col1.DH5 α，挑取阳性克隆，提取质粒，送Invitrogen公司测序,测序比对正确的质粒命名为PMD19-T- SjP40。
[0025]设计引物，在引物两端加入限制性酶切位点及保护碱基，引入酶切位点以下划线表示。上游引物:5’ - GGAATTCCATATGATGTCGGGTACACATCAAAACCATG-3> (Nde I );下