一种抗绿脓杆菌多肽及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学和生物技术领域，涉及一种抗绿脓杆菌多肽及其制备方法和 应用。
【背景技术】
[0002] 传统抗生素的毒副作用及其耐药菌株的出现，迫使人们去寻找新型的抗微生物制 剂。而具有抗微生物等多种生物学功能的抗菌肽有着广阔的应用前景，它们广泛存在于多 种生物体内，是生物体对抗外界病原体侵染而产生的一系列免疫反应的产物，能快速杀死 病原微生物，有着独特的不同于传统抗生素的抗菌机理，相对不具有免疫原性，而且对其有 抵抗力的细菌也不多，分子量小，性能稳定，具有较强的广谱抗菌能力，显示出广阔的应用 潜力，故潜在的治疗性抗菌肽是开发新型、理想的抗生素药物的重要途径。母乳中大量的蛋 白对致病菌、病毒和真菌具有抑制作用。其中一些蛋白可以单独发挥作用，而另一些蛋白则 必须协同发挥作用。多种成分作用于同一种病原菌貌似是一种冗余，其实际是一种多重保 护系统。体内蛋白酶的水解作用产生了大量的母乳多肽，这些母乳多肽除了提供氨基酸作 为营养还发挥作用的生理功能。进一步研宄发现大量的母乳多肽展现出多重的抗微生物作 用，为新生儿提供免疫保护。
[0003] 由于抗菌肽（antimicrobialpeptides,AMPs)天然资源有限，有望廉价获得的化 学合成和基因工程手段成为热点，化学合成肽类成本高，而基因工程方法大量表达抗菌肽 使之成为新一代肽类抗菌药物的途径更为现实，并显示出良好前景。口前在抗菌肽转基因 植物、动物及微生物等方面都做了大量研宄工作，进展快、成果多。尽管抗菌肽功能显著，应 用前景广阔，但天然抗菌肽产量很低，无法从动植物体内大量提取，而化学合成肽价格昂 贵。因此，利用基因工程技术生产抗菌肽就成为必然选择。
[0004] Intein(内含肽）是存在于前体蛋白中的一段序列，在前体蛋白转化为成熟蛋 白质的过程中，依靠自我剪切作用从前体蛋白中释放出来，时间将两端的蛋白质外显肽 (extein)连接在一起，该过程即蛋白质剪接过程。在蛋白质纯化过程中，Intein的自动切 割可避免了外源蛋白酶的加入以及后期对蛋白酶的清除步骤。
[0005]ELP(类弹性蛋白）可进行可逆相变，在低温环境下的水溶液中，ELP呈无序结构 状，均匀可溶分布于溶液中，但当温度逐渐升高达到一定相变温度时，它们会逐渐脱去结合 水，各ELP分子的疏水区互相接触，最终发生相变聚集成团，这一相变具有典型的可逆性， 并且可以通过向溶液中加入盐来加速启动。将ELP作为融合标签与目标蛋白融合表达时， 融合蛋白同样具有这种相变特征。当携带ELP的整合蛋白发生聚集时，其他杂蛋白不发生 聚集，因此可以通过高速离心将密度高的聚集体融合蛋白与不发生聚集的杂蛋白分开，从 而达到纯化目的。
[0006]ELP-Intein系统是充分利用ELP的自聚集以及Intein的自切割特征而构建的一 种非常独特的蛋白质纯化系统。将表达出的可溶性的"ELP-Intein-目标蛋白"三联体经过 相变聚集进行纯化，再诱导Intein发生自切割以释放目的蛋白，再经过一次相变过程，将 附带Intein的ELP标签聚集体去除而得到纯化的目标蛋白。运用ELP系统大大降低了蛋 白纯化成本，为工业规模的应用提供了可能性。
[0007] 我们借助超滤技术分离出母乳中小于IOKDa的多肽成分，进一步借助串联质谱技 术对其具体组成进行鉴定分析。结果发现这些多肽主要是从人0-酪蛋白（Homosapiens betacasein，基因Bank号：NM_001891)中断裂下来的片段，天然存在于母乳中。现有技术 中没有对这些片断及其功能进一步研宄的报道，为此，我们筛选了一些多肽进行深入的研 宄。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是针对上述技术问题提供一种抗绿脓杆菌多肽。
[0009] 本发明的另一个目的是提供上述抗绿脓杆菌多肽的制备方法。
[0010] 本发明还有一个目的是提供上述抗绿脓杆菌多肽的应用。
[0011] 本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
[0012] -种抗绿脓杆菌多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。
[0013] 表达上述抗绿脓杆菌多肽的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
[0014] 所述多肽的扩增引物，其中上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，下游引物 的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。
[0015] 所述抗绿脓杆菌多肽的制备方法，该方法包括下列步骤：
[0016] a.构建权利要求1所述多肽的表达载体pET-EI-GFP ;
[0017] b.pET-EI-GFP融合蛋白的诱导表达；
[0018] c.pET-EI-GFP融合蛋白的纯化；
[0019] d.pET-EI-GFP融合蛋白的自动切割；
[0020] e.重组多肽的纯化、收集。
[0021] 所述的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0022] a.构建权利要求1所述多肽的表达载体pET-EI-GFP :
[0023] 人工合成该多肽核酸序列，利用上述的上下游引物（SEQIDNO:3,SEQIDNO:4) 通过PCR技术扩增出含有BsrGI和HindIII酶切位点的该多肽核酸片段进行胶回收，回 收产物双酶切后载入pET-EI-GFP载体；
[0024] b.pET-EI-GFP融合蛋白的诱导表达：
[0025] 1)测序正确的表达载体转入感受态细胞BLR(DE3)，接种于含氨苄青霉素的LB培 养液培养；
[0026] 2)收集菌体，重悬后加入IPTG诱导pET-EI-GFP融合蛋白表达；
[0027]c.pET-EI-GFP融合蛋白的纯化：
[0028] 诱导表达后的菌液沉淀PBS缓冲液重悬后，超声破碎，离心，取上清液加热进行相 变聚集，离心，弃上清液，沉淀用预冷的PBS缓冲液重悬，离心，取上清液再次加热进行下一 轮相变聚集，离心，弃上清液，沉淀用切割缓冲液重悬；
[0029] d.融合蛋白的自动切割：
[0030] 切割缓冲液与蛋白混合后，开始自动切割过程，释放重组多肽的目的蛋白；
[0031] e.重组多肽的纯化、收集：
[0032] 切割过程结束，再次进行相变聚集，切割下的ELP-Intein标签和未切割完全的融 合蛋白将转变为沉淀，失去标签的目的蛋白则保持