聚乙二醇类聚合物修饰的睫状神经营养因子及其制备方法

专利名称：：聚乙二醇类聚合物修饰的睫状神经营养因子及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及生物领域，具体的说，涉及聚乙二醇类聚合物修饰的睫状神经营养因子及其制备方法。
背景技术：
：睫状神经营养因子(Ciliaryneurotrophicfactor,CNTF)最初在鸡胚眼球脉络膜、睫状体和虹膜中被发现，因能促进体外培养的鸡胚副交感睫状节神经元存活而命名。CNTF是约200个氨基酸组成的多肽激素，由成熟个体外周神经中的施旺细胞、星形细胞中的一些亚细胞群体和中枢神经系统分泌的胞液分子而非由靶组织分泌。CNTF最初被认为是睫状神经节副交感神经元培养时的营养因子，并由此命名。它可以促进多种祌经细胞和祌经胶质细胞的生长与分化，包括运动祌经元、感觉祌经元、交感神经元、海马神经元和少突细胞。90年代初期，人们将CNTF用于治疗肌萎縮性脊髓侧索硬化症(ALS)的实验研究。Regeneron的研究者们对一组ALS患者进行临床研究，研究开始不久便发现病人们的体重大大降低。ALS病人反馈资料表明，使用药物组体重比安慰剂组明显降低，且这一结果持续整个研究过程。Regeneron公司根据这一结果决定在肥胖症领域对其进行实验。结果表明，CNTF在体内可与下丘脑的特异性受体结合，激活抑制食欲的关键信号通道，抑制进食欲望且使机体不会产生饥饿感，从而降低体重。动物实验结果显示，CNTF不仅能使肥胖基因有缺陷的肥胖小鼠迅速减肥，而且对因高脂肪饮食造成的肥胖小鼠也有减肥作用(参见BluherS，MoschosS,BulenJJr等人，Ciliaryneurotrophicfac2torAx15altersenergyhomeostasis,decreasesbodyweight,andimprovesmetaboliccontrolindiet2inducedobeseandUCP12DTAmice，丄D励由，2004，53(1l):第2787-2796页)。已完成的临床研究表明，CNTF不仅具有与化学药物同水平的疗效，而且解决了化学药物毒副作用大的问题。但是，CNTF也存在着半衰期短，具有一定的免疫原性等特点。因此存在着进一步改善CNTF临床治疗效果的要求。为了使CNTF的使用更加方便、作用更加持久，更适于长期使用。本发明人考虑用可溶性高分子聚合物对其进行化学修饰，可以有效改变其体内分布和药动学性质。用高分子化学修饰剂对蛋白质和肽类分子进行化学修饰已经成为生物技术与生物医学领域的研究热点。在众多的高分子化学修饰剂中，以线性的、无毒的、无免疫原性的和具有双歧聚合物性质的聚乙二醇对蛋白质的化学修饰最引人注目。用作修饰蛋白的PEG实际上是单甲氧基聚乙二醇，该化合物在水和有机溶剂中具有高溶解性，不挥发，无味，体内应用无免疫原性和抗原性，长期肌肉或皮下注射无不良反应。体内代谢稳定，低的肾脏排除率，具有很高的柔韧性；生物相容性己经得到FDA的认证。蛋白质被PEG修饰后，偶联的PEG链在蛋白分子表面产生空间位阻效应，减弱了血液中各种水解酶对蛋白的水解作用，从而有效地延长了蛋白在循环系统内的保留时间。由于PEG空间位阻的存在，可阻止药物与蛋白表面的抗原决定簇接触，从而减少被免疫系统清除的几率，降低蛋白质的抗原性和免疫原性。亲水性PEG与蛋白质共价结合后，可使蛋白质颗粒表面形成较厚的水化层，阻止其凝集、沉淀，增加蛋白的稳定性。国内外对PEG修饰蛋白质类药物的研究主要集中于腺苷脱氨酶、天冬酰胺酶、白介素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、超氧化物歧化酶、水蛭素、尿激酶、血红蛋白、干扰素、重组人生长激素、促红细胞生成素等。目前，国内外未见高分子化学修饰剂修饰CNTF的报道。
发明内容本发明的目的在于提供一种聚乙二醇类聚合物修饰的睫状神经营养因子。本发明的目的还在于提供该聚乙二醇类聚合物修饰的睫状神经营养因子的制备方法。为了实现本发明的目的，本发明提供了一种修饰的睫状神经营养因子，其中每一分子睫状神经营养因子与至少一分子聚乙二醇类聚合物通过化学键相连接；所述聚乙二醇类聚合物为聚乙二醇(PEG)、甲氧基聚乙二醇(mPEG)、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺琥珀酸酯(mPEGSuccinimidylsuccinate,mPEG-SS)、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEGSuccinimidylcarbonate,mPEG-SC)、甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯(mPEGtresylate)、甲氧基聚乙二醇-丙醛(mPEG-propionaldehyde)、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG-SPA)、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺a甲基丁酸酯(mPEG-SMB)、甲氧基聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(mPEG2-NHS)、甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺(mPEG2-MAL)或甲氧基聚乙二醇-乙醛(mPEG2-ALD);所述聚乙二醇类聚合物的分子量为lkD100kD。优选的是，每一分子所述睫状神经营养因子与12个分子的所述聚乙二醇类聚合物通过化学键相连接；所述聚乙二醇类聚合物为甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺碳酸酯、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酯或甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺a甲基丁酸酯；所述聚乙二醇类聚合物的分子量为5kD50kD。更优选的是，每一分子所述睫状神经营养因子与一分子甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酯通过化学键相连接；甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酯的分子量为20kD。这些聚乙二醇类聚合物都是本领域技术人员所熟知的，并且是市售的。例如，可购自北京凯正生物工程发展有限公司、NEKTAR公司等。所述睫状神经营养因子是天然的睫状神经营养因子。优选的是，所述睫状神经营养因子是天然的睫状神经营养因子的突变体或变异体。更优选的是，所述睫状神经营养因子的突变体为睫状神经营养因子第17位的半胱氨酸突变为丙氨酸或丝氨酸而形成的突变体；睫状神经营养因子第63位的谷氨酰胺突变为精氨酸而形成的突变体；睫状神经营养因子中去除C末端的15个氨基酸而形成的变异体；或同时将睫状神经营养因子第17位的半胱氨酸突变为丙氨酸、将63位的谷氨酰胺突变为精氨酸、去除C末端的15个氨基酸后而形成的变异体。CNTF是本领域技术人员所熟知的，重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)是市售的，例如可购自武汉中美科技有限公司(中国湖北省武汉市)。CNTF突变体或变异体的制备方法在现有技术中也是已知的，例如CN1687413A、CN1760205A、CN1844392A、CN1760205A中就公开了睫状神经营养因子的各种突变体及其突变方法。本发明还提供了一种修饰的睫状神经营养因子的制备方法，包括将聚乙二醇类聚合物与浓度为0.5mg/mL5.5mg/mL的睫状神经营养因子溶液混合，聚乙二醇类聚合物与睫状神经营养因子的摩尔比为1:120:1，调节反应体系的pH为79.5，在437。C反应0.54小时。其中，所述聚乙二醇类聚合物与所述睫状神经营养因子优选按照摩尔比5:1混合，反应温度优选为室温，反应时间优选为2小时，所述睫状神经营养因子溶液的浓度优选为2.0mg/mL，所述反应体系的pH优选为8。本发明的所述的修饰的睫状神经营养因子能够保持修饰前睫状神经营养因子的生物学活性，同时又比修饰前睫状神经营养因子具有更好的稳定性、血浆清除率更低、体内循环半衰期更长、毒副作用显著降低。因此，作为治疗药物，它比修饰前睫状祌经营养因子更合适。同时，免疫原性实验表明，修饰的睫状神经营养因子能够显著降低睫状神经营养因子的免疫原性。图1为示出构建用于表达rhCNTF的表达载体的图。图2为示出rhCNTF的SDS-PAGE图，其中M为分子量标准，1为rhCNTF。图3为示出反应时间对修饰反应的影响的图，其中1为SPA-mPEG修饰的rhCNTF;2为SMB-mPEG修饰的rhCNTF;3为SC-mPEG修饰的rhCNTF。图4为示出反应温度对修饰反应的影响的图，其中1为SPA-mPEG修饰的rhCNTF;2为SC-mPEG修饰的rhCNIT;3为SMB-mPEG修饰的rhCNTF。图5为示出反应体系pH值对修饰反应的影响的图，其中1为SC-mPEG修饰的rhCNTF;2为SPA-mPEG修饰的rhCNTF;3为SMB-mPEG修饰的rhCNTF。图6为示出rhCNTF溶液浓度对修饰反应的影响的图，其中1为SPA-mPEG修饰的rhCNTF;2为SC-mPEG修饰的rhCNTF;3为SMB-mPEG修饰的rhCNTF。图7为示出聚乙二醇类聚合物与rhCNTF的摩尔比对修饰反应的影响的图，其中l为SPA-mPEG修饰的rhCNTF;2为SMB-mPEG修饰的rhCNTF;3为SC-mPEG修饰的rhCNTF。图8为QS-HighPerformance离子交换层析图。图9为QS-HighPerformance离子交换层析后的SDS-PAGE电泳图，其中h纯化前样品；2-3:峰l;4-7:峰2;M:分子量标准；8-11:峰3;12-13:峰4。图IO为示出飞行质谱法测精确分子量的图。图11为等电聚焦电泳图，其中1为ACNTF，M为IEF标准，2、3、4为rhCNTF-SPA-mPEGl。图12为rhCNTF在200-700nm的紫外-可见光谱扫描图。图13为rhCNTF-SPA-mPEGl在200-700nm的紫外-可见光谱扫描图。图14为示出使用rhCNTF期间小鼠体重变化的图，其中，l为Na2HPCXt组，2为阴性对照组，3为rhCNTF组(0.3mg/kg)。图15为示出使用rhCNTF期间小鼠体重变化的图，其中，l为Na2HP04组，2为阴性对照组，3为rhCNTF组(l.Omg/kg)。图16为示出使用rhCNTF-SPA-mPEG1期间小鼠体重变化的图，其中，l为Na2HP04组，2为阴性对照组，3为rhCNTF-SPA-mPEGl组(0.3mg/kg)。图17为示出使用rhCNTF-SPA-mPEG1期间小鼠体重变化的图，其中，l为Na2HP04组，2为阴性对照组，3为rhCNTF-SPA-mPEGl组(1.0mg/kg)。图18为示出使用rhCNTF对小鼠摄食的影响的图，其中1为阴性对照组，2为rhCNTF组(0.3mg/kg)。图19为示出使用rhCNTF对小鼠摄食的影响的图，其中1为阴性对照组，2为rhCNTF组(1.0mg/kg)。图20为示出使用rhCNTF-SPA-mPEGl对小鼠摄食的影响的图，其中1为阴性对照组，2为rhCNTF-SPA-mPEGl组(0.3mg/kg)。图21为示出使用rhCNTF-SPA-mPEGl对小鼠摄食的影响的图，其中l为阴性对照组，2为rhCNTF-SPA-mPEGl组(1.0mg/kg)。图22为rhCNTF及rhCNTF-SPA-mPEGl在4T条件下第0天的SDS-PAGE电泳图，其中1、2、4、7为rhCNTF，3、5、6为rhCNTF-SPA-mPEGl，M为分子量标准。图23为rhCNTF及rhCNTF-SPA-mPEGl在4"C条件下第12天的SDS-PAGE电泳图，其中1、2、4、7为rhCNTF,3、5、6为rhCNTF-SPA-mPEGl。图24为示出rhCNTF促进TF-1CN5al细胞增殖曲线的图。图25为示出rhCNTF-SPA-mPEGl促进TF-1CN5al细胞增殖曲线的图。图26为rhCNTF禾BrhCNTF-SPA-mPEGl的免疫印迹分析图，其中l为蛋白标准，2为rhCNTF-SPA-mPEGl,3为rhCNTF。图27为示出不同时间点rhCNTF的血清浓度的图。图28为示出不同时间点rhCNTF-SPA-mPEGl的血清浓度的图。具体实施例方式以下结合附图通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。实施例1rhCNTF的制备根据天然的人CNTF基因序列(来自GENEBANK)，设计两条引物PI:GACCATATGGCTTTCACAGAGCATTCACCG;P2:GGTCAGCTCGGATCCTTAATCAGTGCTTGCCAC。以人cDNA为模板(方法参见金冬雁等译，《分子克隆实验指南提取》U996版)，第463-469页)，力口入P1禾口P2引物，在50(^1的反应体系(10x缓冲液，含Mg2+5.0ji1，dNTP(2.5mmol/L)l.O(il'PI(30(imol/L)1.0|li1，P2(30pmol/L)1.0|il，PfuDNA聚合酶1U，加超纯水至总体积至50.0|il}中，95'C变性30秒后，于93匸变性30秒、55'C退火60秒、68'C延伸2分钟，重复上述循环30次，最后68。C延伸8分钟；反应结束后，快速降温至4。C。将上述PCR产物用Ndel和BamHI(均购自北京中原公司)双酶切后，与经同样酶切(Ndel和BamHI)的表达载体pET32a十(购自Novagen公司)相连接，构建出了原核表达载体pET32a+/CNTF。参见图1。用表达载体pET32a+ZCNTF转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自Novagen公司，货号69387-3)后，制备出CNTF工程菌(命名为pCNTF/BL21)。将CNTF工程菌(pCNTF/BL21)划线接种于LB琼脂平板(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaC15g，琼脂10g，加水定容至1L，高压灭菌，当温度降到5(TC左右时加入Amp至终浓度为200|ig/ml，取20ml倒培养皿，凝固后即成LB琼脂平板)，37t:培养过夜。从培养过夜的LB平板上挑选单菌落接种于含LB的试管中，37"C培养10h，然后转种至含200mlLB培养液(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g，加水定容至1L，高压灭菌，分装三角瓶，每瓶200ml)的三角瓶中，37'C培养过夜制得种子液。次日，将种子液按1%比例接种于含30升2YT培养液的50L发酵罐中，发酵培养基为2YT[胰蛋白胨(bacto-tryptone，购自OXOID公司)480g，酵母提取物(bacto-yeastextract,购自OXOID公司)300g，NaCl150g，加入蒸馏水溶解，5NNaOH体调节pH至7.0，定容到30升，高压灭菌(0.12Mpa，121°C，30min余下同)]，培养体积30L。控制发酵温度37'C、转速250450r/min、通气量3050L/min、pH7.3，培养至A600-1.2左右后，加入异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.4mM进行诱导。继续培养5h，终止发酵，收集菌体，储存于-3(TC冰箱中待用。从-30'C冰箱中取出发酵菌体，按1%比例用0.02mol、pH7.2的磷酸盐溶液重新悬浮菌体，通过高压匀浆破碎细菌，5000r/min离心15min，收集包涵体沉淀，再经变性[每克包涵体使用400ml变性液(8M盐酸胍、50MmTris-Hcl、pH8.3)处理4小时]、复性(通过透析法复性，透析液为50mMTris-Hcl、pH8.3，透析时间为24小时)、Q-SepharoseHP层析步骤进行纯化而获得rhCNTF。做SDS-PAGE并用AlphaDigiDoc凝胶成像分析仪进行分析，对rhCNTF进行纯度鉴定，由图2可见，rhCNTF纯度可达100%。实施例2修饰物的制备以及修饰条件的选择所使用的聚乙二醇类聚合物如下所示SPA-mPEG，购自北京凯正生物工程发展有限责任公司，批号20060101，分子量20KD;SC-mPEG，购自北京凯正生物工程发展有限责任公司，批号20051019，分子量20KD;SMB-mPEG，购自NEKTAR公司，批号PT-02E-13，分子量20KD。在以下实施例中，除非另有说明，所使用的rhCNTF溶液与PEG溶液均是使用0.02M磷酸盐缓冲液(pH为7.2)作为溶剂配制而成的。在本实施例中，结合单个分子聚乙二醇类聚合物的rhCNTF用rhCNTF-PEGl表示。1、反应时间对修饰反应的影响取rhCNTF(1.016mg/ml)lml，按摩尔比20:1的比例加入SPA-mPEG，室温反应。分别于0.5、1、2、3、4h取出0.2ml。做分离胶12%，浓縮胶4%的非还原SDS-PAGE电泳。以rhCNTF-PEGl在修饰产物中所占比例的高低作为指标，采用AlphaDigiDoc凝胶成像分析仪进行分析。SC-mPEG、SMB-mPEG以相同的方法进行测定。实验结果表明，反应时间从0.5、1、2、3、4h，rhCNTF-PEGl所占的比例分别为24.7%、30%、39.6%、28.5%、27.4%(图3)。反应时间为2h时，rhCNTF-PEGl所占的比例最高。当反应时间大于2h时，rhCNTF-PEGl在整个修饰物中所占的比例下降。因此，综合考虑，选择2h作为修饰反应的时间。同等条件下，SPA-mPEG修饰后CNTF-PEG1所占的比例高于其他两种修饰剂修饰后所占的比例。因此SPA-mPEG更适合用来修饰rhCNTF。2、反应温度对修饰反应的影响取rhCNTF(1.016mg/ml)0.6ml，按摩尔比10:1的比例加入SPA-mPEG，混匀，分装于3支试管中，每管0.2ml，分别于4'C、25°C、37。C反应2h，做分离胶12%，浓縮胶4%的非还原SDS-PAGE电泳。以rhCNTF-PEGl在修饰产物中所占比例的高低作为指标，采用AlphaDigiDoc凝胶成像分析仪进行分析。SC-mPEG、SMB-mPEG以相同的方法进行测定。实验结果表明，在温和的实验条件下(4T:或25'C)修饰反应即可发生(图4)。随着温度的升高，rhCNTF-PEGl所占的比例有所增加，分别为50.6%、51.8%、54.2%，但增加的幅度不明显。为了尽可能的保证rhCNTF的活性，选择25"C作为反应温度。同等条件下，SPA-mPEG修饰后CNTF-PEG1所占的比例高于其他两种修饰剂修饰后所占的比例。因此SPA-mPEG更适合用来修饰rhCNTF。3、溶液pH值对修饰反应的影响取rhCNTF(1.016mg/ml)0.6ml，分别取1ml置于6支试管中，调节pH值分别为7.0、7.4、8.0、8.4、9.0、9.2。每支试管中以摩尔比10:1的比例分别加入SPA-mPEG，常温反应2h。做分离胶12%,浓縮胶4%的非还原SDS-PAGE电泳。以rhCNTF-PEGl在修饰产物中所占比例的高低作为指标，采用AlphaDigiDoc凝胶成像分析仪进行分析。SC-mPEG、SMB-mPEG以相同的方法进行测定。实验结果表明，pH值在7.0、7.36、8.03、8.42、9.0、9.23的条件下，rhCNTF-PEGl所占的比例分别为20%、29.8%、35.9%、32%、30.3%、27.1%(图5)。其中以pH值在8.03时rhCNTF-PEGl所占的比例最高。为了方便，选择pH值8作为反应体系的pH值。同等条件下，SPA-mPEG修饰后CNTF-PEG1所占的比例高于其他两种修饰剂修饰后所占的比例。因此SPA-mPEG更适合用来修饰rhCNTF。4、CNTF浓度对修饰反应的影响取rhCNTF(5.33mg/ml)0.4ml，取出0.15ml加入0.05ml透析液将其浓度稀释到4.0mg/ml，立刻稀释3次，使5支试管中的蛋白浓度分别为5.33mg/ml、4.0mg/ml、2.0mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml，体积为0.2ml。按摩尔比10:1的比例分别加入SPA-mPEG，混匀，常温反应2h。做分离胶12%，浓縮胶4%的非还原SDS-PAGE电泳。以rhCNTF-PEGl在修饰产物中所占比例的高低作为指标，采用AlphaDigiDoc凝胶成像分析仪进行分析。SC-mPEG、SMB-mPEG以相同的方法进行测定。实验结果表明，蛋白浓度在5.43mg/ml、4.0mg/ml、2.0mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml时，rhCNTF-PEGl所占的比例分别为24.6%、29.4%、39.9%、36.5%、32.9%(图6)。当蛋白浓度为2.0mg/ml时，rhCNTF-PEG1所占的比例最高。因此选择蛋白浓度为2.0mg/ml作为修饰反应中rhCNTF的最适浓度。同等条件下，SPA-mPEG修饰后CNTF-PEG1所占的比例高于其他两种修饰剂修饰后所占的比例。因此SPA-mPEG更适合用来修饰rhCNTF。5、反应物摩尔比对修饰反应的影响取rhCNTF(1.016mg/ml)5ml，置于5支试管中，每管1ml。分别按摩尔比1:1、1:2、1:5、1:10、1:20的比例加入SPA-mPEG,混匀，常温反应2h。做分离胶12%，浓縮胶4%的非还原SDS-PAGE电泳。以rhCNTF-PEGl在修饰产物中所占比例的高低作为指标，采用AlphaDigiDoc凝胶成像分析仪进行分析。SC-mPEG、SMB-mPEG以相同的方法进行测定。聚乙二醇类聚合物与rhCNTF的摩尔比对修饰反应影响较为显著。在SPA-mPEG与rhCNTF的摩尔比为1:1、2:1、5:1、10:1、20:1时，rhCNTF-PEGl所占的比例分别为27.3%、37%、37.3%、38.4%、28.4%(图7)。由图6可知，摩尔比为5:1为修饰反应的最佳摩尔比。同等条件下，SPA-mPEG修饰后CNTF-PEG1所占的比例高于其他两种修饰剂修饰后所占的比例。因此SPA-mPEG更适合用来修饰rhCNTF。综上所述，选择SPA-mPEG作为修饰剂，修饰条件为反应时间2小时，反应温度25。C，反应体系的pH为8，rhCNTF溶液的浓度为2.0mg/mL，SPA-mPEG与rhCNTF的摩尔比为5:1。实施例3SPA-mPEG修饰的rhCNTF的制备及纯化取实施例1制备的rhCNTF进行透析，透析液为0.1mol/L的四硼酸钠水溶液，pH值为9.2。在4。C下透析48h,中间换液4次，透析后取样，Lowry法测定rhCNTF蛋白浓度。然后取透析后的rhCNTF(2mg/ml)200ml，按摩尔比1:5的比例加入SPA-mPEG，在25°C条件下，反应体系的pH值控制在8,反应时间为2h，加入6NHC1终止反应。为了更好的将未修饰的rhCNTF、结合单分子SPA-mPEG的rhCNTF和结合多分子SPA-mPEG的rhCNTF分开，采用QS-HighPerformance离子交换层析进行研究。取上述终止反应后的溶液40ml，上柱分离。色谱条件如下层析介质为QS-HighPerformance,柱长为2.6x40cm，柱体积159ml，流动相为分别含有50mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM的NaCl的O.OIM磷酸盐缓冲液(pH7.2)，流速1.0ml/min、检测波长280nm。收集各洗脱峰。从色谱图(图8)中可以看出有四个洗脱峰(其中第四个峰为盐峰)。经SDS-PAGE鉴定(图9)，峰1主要为结合多分子SPA-mPEG的rhCNTF，峰2为结合单分子SPA-mPEG的rhCNTF蛋白(下文中称为rhCNTF-SPA-mPEGl)，峰3为未反应的rhCNTF。选择性的收集目的蛋白，合并，浓縮后透析于5mMNa2HP04溶液中，-20°。保存，用于下一步修饰物的评价。实施例4rhCNTF-SPA-mPEGl的理化特性鉴定1、纯度以及分子量测定用飞行质谱法测定精确分子量，结果见图10。由飞行质谱检测结果可知(图10)，在分子量为21084.65处出现一个峰，该峰为rhCNTF;在41441.38处出现另一个峰，该峰为rhCNTF-SPA-mPEGl，与理论分子量一致。2、修饰率的测定如HabeebA.F.S.A，《AnalyticalBiochemistry〉〉(1966)14，第328-336页禾口JohnB,etal.《AnalyticalBiochemistry》(1997)，254，第254-262页中所述，经TNBS法测定rhCNTF-SPA-mPEGl的修饰率为14.76%。rhCNTF分子中含有7个赖氨酸(Lys)，由于SPA-mPEG是针对赖氨酸(Lys)残基进行非定点修饰，因此从其修饰率可以推断出SPA-mPEG修饰的rhCNTF为结合单个SPA-mPEG分子的rhCNTF。3、等电点的测量由等电聚焦电泳结果可知，rhCNTF的等电点为5.8，与文献报道的相一致。采用AlphaDigiDoc凝胶成像分析仪计算rhCNTF-SPA-mPEGl的等电点为5.98。电泳图见图11。4、紫外-可见光谱扫描结果对rhCNTF以及rhCNTF-SPA-mPEGl在200-700nm之间进行紫外一可见光谱扫描，结果显示，rhCNTF(图12)与rhCNTF-SPA-mPEGl(图13)的最大吸收光谱均为279.5nm。说明单个SPA-mPEG分子对rhCNTF的修饰没有改变rhCNTF的空间构象。图12和图13的检测结果分别见表1、2。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>此外，从小鼠的摄食变化图可知(图1821)，给药期间小鼠的摄食量明显减少，停药后摄食量稍有增加。因此可见，rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEG1均能抑制小鼠的食欲而使小鼠体重降低。实施例6稳定性的研究分别取蛋白浓度为0.8mg/ml的rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl放置于4"C，每隔6天做一次SDS-PAGE电泳(分离胶浓度12%，浓縮胶浓度4%，上样量为15^1，恒压110V,电泳1.5小时)，通过电泳图谱比较rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl的稳定性。从SDS-PAGE电泳图谱(图22、23)中发现，在不加任何保护剂的情况下，rhCNTF在4。C条件下仅12天即可完全降解，而rhCNTF-SPA-mPEGl在4°C下12天也不见任何的降解带。说明SPA-mPEG修饰rhCNTF后能够增加rhCNTF的稳定性。实施例7rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl体外活性的研究将TF-1CN5al细胞(购自美国ATCC，货号为CRL-2512)常规培养于GM-CSF条件(100mlRPMI1640中含500ng的GM-CSF)的培养液中，实验时收集对数生长期的细胞，用无血清的RPMI1640(购自invitrogen公司，货号为11875-101)洗液洗涤1遍，然后用10%小牛血清的RPMI1640培养液调整细胞数为1.0xlO、每孔加50^1细胞悬液，rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl按2倍系列稀释后，每孔加入50|ul，以无血清RPMI1640培养基作对照，培养板在37°C、5%C02条件下培养48h后，每孔加入5mg/ml的四甲基偶氮唑盐(MTT，购自北京中原公司)溶液20pl，继续培养4-6h后，加入酸性异丙醇(异丙醇-HCl，pH4.0)溶液，混匀后在酶标仪上比色，测定波长为570nm，参比波长为630nm。每个实验取3次实验的平均结果。TF-1CN5al是一个依赖于GM-CSF的细胞系，其细胞表面具有rhCNTF高亲和力受体，所以CNTF能促进TF-1CN5al细胞的增殖。将不同浓度的rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl加入TF-1CN5al细胞培养物中，观察细胞的生长情况，发现1.967xl0'7ng/ml-1.22xl(r5ng/ml的rhCNTF即明显促进其增殖；9.766xl(T5ng/ml-0.00625ng/ml的rhCNTF-SPA-mPEGl能促进其增殖，见图24、25。实验结果说明，rhCNTF-SPA-mPEG1的体外活性基本没有受到影响。实施例8修饰物的免疫反应性以rhCNTF的单克隆抗体作为特异性抗体进行蛋白质免疫印迹实验，研究免疫反应性。用rhCNTF的单克隆抗体(购自SIGMA公司)作为结合抗体，以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG作为酶标二抗，以二氨基联苯胺作为反应体系(实验方法参见金冬雁等译，《分子克隆实验指南提取》(1996版)，第888-897页)。首先将rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl做SDS-PAGE电泳，分离胶浓度12%,浓縮胶浓度4%，上样量为15^1，恒压110V，电泳1.5小时，终止电泳，将凝胶转入NC膜上，加二氨基联苯胺反应，用水终止反应。结果表明(图26)，rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl均能够与rhCNTF的单克隆抗体特异性结合，说明它们具有相似的免疫反应性。修饰后没有改变rhCNTF与抗体结合的特性。从实验结果还可以看出，rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl均仅出现单一条带，也说明了rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl均为单一组分，也间接说明了rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl具有高的纯度。实施例9rhCNTF禾PrhCNTF-SPA-mPEGl的药物代谢动力学研究使用pH7.2的0.02M磷酸盐缓冲液将rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl的蛋白浓度分别稀释到0.2-0.3mg/ml，过滤除菌。家兔(2.02.5kg/只)随机分为两组，每组三只，每只每天皮下给药一针，两种样品的给药剂量均为200ug/kg。注射rhCNTF组分别于给药后的0.5、1、3、5、6、7、24小时于耳缘静脉采血0.5ml。分别收集于小管中，4匸过夜，第二天离心收集血清，置-2(TC冰箱中保存。采用双抗体夹心法(方法为取CNTF单克隆抗体(购自SIGMA公司)(l|ig/ml)包被酶标板，4。C过夜，洗涤l次；5%卵清白蛋白封闭，37t:孵育60分钟，洗涤3次。加入2倍系列稀释的兔血清，每孔10(^1，37'C孵育60分钟，洗涤3次；加入酶标记的CNTF多克隆抗体(1:100)每孔lO(Hil，37t:孵育60分钟，洗涤6次。加入底物液ioow，室温放置15分钟，终止液每孔50pl，492nm波长下检测OD值)，测定收集到的血清中rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl的浓度。结果见图27、.28，血清中rhCNTF的浓度在lh达到最高值，随后开始下降，7小时血清中浓度己经很低。24h的血清浓度已经基本降至基线。说明rhCNTF在体内很快被降解。rhCNTF-SPA-mPEGl在4h达到最高值，随后开始下降；从血清浓度趋势图上看，rhCNTF-SPA-mPEGl在48h血清中仍有分布。说明聚乙二醇类聚合物修饰后延长了rhCNTF在血循环中存在的时间。药物代谢动力学分析结果表明(表4),rhCNTF-SPA-mPEGl的半衰期有一定的提高，为原来的16倍；清除率下降，为原来的36.26%;血桨峰浓度提高到原来的2.57倍；时量曲线下面积提高到原来的2.76倍。rhCNTF的达峰时间为lh，rhCNTF-SPA-mPEGl的达峰时间为4h。结果说明，应用聚乙二醇类聚合物对rhCNTF进行修饰，能够明显改善rhCNTF的药物代谢动力学性质。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>实施例10rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl免疫家兔后抗体水平(ELISA法测定)rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl免疫家兔后，均产生了不同程度的结合抗体。二种免疫原均在免后第二周诱导产生结合抗体，抗体滴度在免后四周达到最高水平，随后开始逐渐下降。对rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl免后四周的结合抗体滴度进行统计学分析表明，rhCNTF-SPA-mPEGl诱导产生的结合抗体的能力明显低于rhCNTF，差异具有显著性(P<0.05)，见表5。本实验证明，用聚乙二醇类聚合物对rhCNTF进行修饰可以显著降低rhCNTF的免疫原性。表5_抗体滴度rhCNTFrhCNTF-SPA-mPEGl免后1周--免后2周5079.68±2.23251.98±4.96免后3周40637.46±1.49634.96±2.23免后4周51200±2.00a765.17±3.08b免后5周25600±2.00660.38±5.63免后6周20318.73±2.88634.96±4.231.avs.bP<0.05;2."-"检测不到。权利要求1.一种修饰的睫状神经营养因子，其特征在于每一分子睫状神经营养因子与至少一分子聚乙二醇类聚合物通过化学键相连接；所述聚乙二醇类聚合物为聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺琥珀酸酯、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺碳酸酯、甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯、甲氧基聚乙二醇-丙醛、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酯、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺α甲基丁酸酯、甲氧基聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺、甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺或甲氧基聚乙二醇-乙醛；所述聚乙二醇类聚合物的分子量为1kD～100kD。2.如权利要求1所述的修饰的睫状神经营养因子，其特征在于每一分子所述睫状神经营养因子与12个分子的所述聚乙二醇类聚合物通过化学键相连接；所述聚乙二醇类聚合物为甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺碳酸酯、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酯或甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺a甲基丁酸酯；所述聚乙二醇类聚合物的分子量为5kD50kD。3.如权利要求2所述的修饰的睫状神经营养因子，其特征在于每一分子所述睫状神经营养因子与一分子甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酯通过化学键相连接；甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酯的分子量为20kD。4.如权利要求13任意一项所述的修饰的睫状神经营养因子，其特征在于，所述睫状神经营养因子是天然的睫状神经营养因子。5.如权利要求13任意一项所述的修饰的睫状神经营养因子，其特征在于，所述睫状神经营养因子是天然的睫状神经营养因子的突变体或变异体。6.如权利要求5所述的修饰的睫状祌经营养因子，其特征在于，所述睫状神经营养因子为睫状神经营养因子第17位的半胱氨酸突变为丙氨酸或丝氨酸而形成的突变体；睫状神经营养因子第63位的谷氨酰胺突变为精氨酸而形成的突变体；睫状神经营养因子中去除C末端的15个氨基酸而形成的变异体；或同时将睫状神经营养因子第17位的半胱氨酸突变为丙氨酸、将63位的谷氨酰胺突变为精氨酸、去除C末端的15个氨基酸后而形成的变异体。7.—种修饰的睫状神经营养因子的制备方法，包括将聚乙二醇类聚合物与浓度为0.5mg/mL5.5mg/mL的睫状神经营养因子溶液混合，其中所述聚乙二醇类聚合物与所述睫状神经营养因子的摩尔比为1:120:1，反应体系的pH为79.5，在437"C下反应0.54小时。8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇类聚合物与所述睫状神经营养因子按照摩尔比为5:1混合，反应温度为室温，反应时间为2小时。9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述睫状神经营养因子溶液的浓度为2.0mg/mL。10.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述反应体系的pH为8。全文摘要本发明涉及一种聚乙二醇类聚合物修饰的睫状神经营养因子及其制备方法。该方法包括将聚乙二醇类聚合物与睫状神经营养因子混合反应即可。本发明所述的聚乙二醇类聚合物修饰的睫状神经营养因子保持了睫状神经营养因子在体内的活性，并且毒副作用显著降低，同时实验结果表明，修饰后的睫状神经营养因子能够明显改善睫状神经营养因子的药物代谢动力学性质，并且显著降低睫状神经营养因子的免疫原性。文档编号A61K47/48GK101185762SQ20071019854公开日2008年5月28日申请日期2007年12月11日优先权日2007年12月11日发明者倪道明,江姜,张振龙申请人:北京生物制品研究所