)至终浓度为I.OmM进行诱导。继续培养4. 5小时，终止发酵，收集菌体，储存于-30°C 冰箱中备用。取表达目的蛋白后的菌体，进行SDS-PAGE电泳，观察目的蛋白CNTFnew/CC22 的表达结果见图5,其中，M为蛋白质marker;1为阴性对照；2-9分别为随机挑选的8个 CNTFnew/CC22工程菌菌落的结果。
[0095] 实施例4目的蛋白CNTFnew/CC22的纯化
[0096] 将按实施例3方法得到的发酵菌体，按1 :10比例加20mMTris-HCl，pH8. 0,高压匀 浆破碎，操作条件：l〇〇〇bar，温度控制在8°C以下。3次循环，10, 000rpm，4°C离心30分钟， 收集上清进行分离纯化。首先采用疏水层析，所选用的介质为辛基-琼脂糖介质（购自美国 GE公司，OctylSepharose4fastflow，层析柱为）(K26/20)。选用 50mMTris-HCl，pH8.0， IM(NH4)2SO4的缓冲液平衡层析柱，破碎上清中加入IM硫酸铵后上样，用平衡缓冲液淋洗I 个柱体积，随后采用梯度洗脱，5个柱体积内将缓冲液置换为50mMTris-HCl，pH8.0。收集 洗脱峰，调PH5. 0,用50mM乙酸-乙酸钠，pH5. 0缓冲液透析脱盐，脱盐后样品采用阳离子 交换介质CMFF进行精制纯化，所得CNTF纯度可达95%以上。纯化结果见图6 =CNTFnew/ CC22蛋白SDS-PAGE电泳图，其中左道为蛋白质分子量标准，右道为CNTFnew/CC22蛋白。
[0097] 实施例5CNTFnew/CC22蛋白的N端15个氨基酸序列测定
[0098] 序列比对为将CNTFnew/CC22蛋白的N端15个氨基酸序列与CNTF的N端测序结 果进行比对，测定结果见图7,结果说明CNTFnew/CC22蛋白的N端15个氨基酸序列的测序 结果与预先设计完全相同。
[0099] 实施例6CNTFnew/CC22蛋白的体外活性鉴定
[0100] TF-lCN5al细胞是一个依赖于GM-CSF的细胞系，其细胞表面具有rhCNTF高亲 和力受体，所以CNTF能促进TF-lCN5al细胞的增殖。将不同浓度的CNTFnew/CC22加入 TF-lCN5al细胞培养物中，观察细胞的生长情况，以测定CNTFnew/CC22体外活性，具体方法 如下：
[0101] 将TF-lCN5al细胞（购自美国ATCC，货号为CRL-2512TM)，常规培养于GM-CSF条件 (100mlRPMI1640中含有500ng的GM-CSF)的培养液中，实验时收集对数生长期的细胞，用 无血清的RPMI1640(购自invitrogen公司）洗液洗漆3遍，然后用10%小牛血清RPMI1640 培养液调整细胞数为I.OX106,每孔加50ill细胞悬液，使用实施例4中获得的CNTFnew/ CC22蛋白从初始浓度lOiig/ml按4倍系列稀释后，每孔加入50iU。以50iU无血清RPMI1640培养基作为阴性对照，以CNTF标准品（购自英国国家生物制品检定所NIBSC.货 号：94/684)为阳性对照，初始浓度为200ng/ml，进行4倍系列稀释后，每孔加入50yl。培 养板在37°C、5 %CO2条件下培养48h后，每孔加入50mg/ml的WST-8 (购自碧云天生物技术 研究所。货号：NIBSC94/684)溶液20iU，继续培养4h后，混匀后再酶标仪上比色，测定波 长为570nm，参比波长为630nm。每个实验结果均重复3次，最后取3次实验的平均结果。
[0102] 结果：实施例4获得的CNTFnew/CC22蛋白的体外活性：8. 37X106IU/mg。
[0103]实验同时设置了未突变的睫状神经营养因子对照组（购自sigma，C3710-10UG)， 实验结果证实未突变的睫状神经营养因子的体外活性约为8. 53X104IU/mg，经过定点突变 的睫状神经营养因子突变体的生物学活性高于未突变的天然分子。
[0104] 实施例7CNTFnew/CC22在小鼠体内活性的测定
[0105] 实验用小鼠使用雄性昆明鼠（得自北京维通利华实验动物技术有限公司），体重 18-22g。分为阳性对照组、阴性对照组和实验组，每组6只。用生理盐水溶解CNTF标准品 (购自英国国家生物制品检定所。货号：NIBSC94/684)，样品为CNTFnew/CC22纯品冻干粉 剂（实施例4所得蛋白进一步冻干所得），同样以生理盐水溶解并稀释为100yg/ml。以每 只小鼠125yg/kg/天的量进行注射。阴性对照即生理盐水。注射前分别称量每组每只小 鼠的体重。连续五天给药，称量小鼠的体重并观察其变化。
[0106] (1)流程如下表1:
[0107] 表I.CNTF对小鼠减重作用测定流程
【主权项】
1. 一种睫状神经营养因子突变体，其中，所述的睫状神经营养因子突变体是通过在睫 状神经营养因子的氨基酸序列的基础上，保留了第17位的半胱氨酸，将第63位的谷氨酰胺 突变为精氨酸，并且去除了 C末端的15个氨基酸而得到的。
2. 根据权利要求1所述的睫状神经营养因子突变体，其中，所述的睫状神经营养因子 突变体具有SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列。
3. -种DNA，其中，所述DNA的核苷酸序列为编码根据权利要求1或2所述的睫状神经 营养因子突变体的核苷酸序列。
4. 根据权利要求3所述的DNA，其中，所述DNA的核苷酸序列为SEQ ID NO :4所示的核 苷酸序列。
5. -种重组表达载体，其中，所述重组表达载体含有权利要求3或4的核苷酸序列。
6. 根据权利要求5所述的重组表达载体，其中，所述重组表达载体为如图1所示的 PET24a+/CNTFnew/CC22 表达载体。
7. -种遗传工程宿主细胞，其中，所述宿主细胞含有权利要求5或6所述的重组表达载 体。
8. 根据权利要求7所述的遗传工程宿主细胞，其中，所述宿主细胞为CNTFnew/CC22工 程菌。
9. 一种修饰型睫状神经营养因子突变体，其中，所述的修饰型睫状神经营养因子是通 过对根据权利要求1或2所述的睫状神经营养因子突变体的第17位半胱氨酸进行定点修 饰而得到的，所述定点修饰是通过在所述的第17位半胱氨酸上结合化学修饰剂而实现的。
10. 根据权利要求9所述的修饰型睫状神经营养因子突变体，其中，所述化学修饰剂为 聚乙二醇或聚乙二醇类聚合物。
11. 根据权利要求10所述的修饰型睫状神经营养因子突变体，其中，所述的化学修饰 剂选自：聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺琥珀酸酯、甲氧基聚乙 二醇-琥珀酰亚胺碳酸酯、甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯、甲氧基聚乙二醇-丙醛、甲氧 基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酯、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺α甲基丁酸酯、甲氧基聚 乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺、甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺或甲氧基聚乙二醇-乙醛；优选 为甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺。
12. 根据权利要求1或2所述的睫状神经营养因子突变体在制备用于治疗和/或预防 肥胖症及肥胖相关II型糖尿病的药物中的用途。
13. 根据权利要求9-11中任意一项所述的修饰型睫状神经营养因子突变体在制备用 于治疗和/或预防肥胖症及肥胖相关II型糖尿病的药物中的用途。
14. 一种用于治疗和/或预防肥胖症及肥胖相关II型糖尿病的药物组合物，其中，所述 的药物组合物包含根据权利要求1或2所述的睫状神经营养因子突变体和/或根据权利要 求9-11中任意一项所述的修饰型睫状神经营养因子突变体。
【专利摘要】本发明提供了一种睫状神经营养因子突变体及其修饰型突变体和用途。其中，所述的睫状神经营养因子突变体是通过在睫状神经营养因子的氨基酸序列的基础上，保留了第17位的半胱氨酸，将第63位的谷氨酰胺突变为精氨酸，并且去除了C末端的15个氨基酸而得到的。通过本发明的睫状神经营养因子突变体能够获得修饰专一性高的修饰型睫状神经营养因子，从而克服因修饰而带来的如修饰产物不均一，结果不稳定等系列问题，并使重组CNTF蛋白结构更为稳定，与天然蛋白相比具有更高的生物学活性和可溶性，并且修饰型睫状神经营养因子与未修饰型睫状神经营养因子相比具有长效作用。
【IPC分类】C07K1-113, C12N15-12, C12N1-20, A61P3-10, A61K38-18, C07K14-475, A61P3-04, C12N15-63
【公开号】CN104558148
【申请号】CN201310491131
【发明人】王健, 刘君, 李莉莉, 郑秀玉, 张振龙
【申请人】北京生物制品研究所有限责任公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月17日