心肌梗死的风险因子和预测的制作方法

专利名称：心肌梗死的风险因子和预测的制作方法
心肌梗死的风险因子和预测对相关申请的引用本申请要求2009年11月13日提交的美国临时申请第61/261，155号的优先权和权益,其全部内容通过引用并入本文。
背景技术：
心肌梗死(MI)，通常称为心脏病发作，与可修饰的风险因子有夫，但是尽管如此，仍然是世界范围内死亡和重度残疾的主要原因(Yusuf S, Hawken S，Ounpuu S，etal.Efiect of potentially modifiable risk factors associated with MI in52countries(the INTERHEART study) :case-controlstudy. Lancet. 364:937-52 (2004))。为了预防，美国和欧洲的现代指导方针都推荐整合的两步法，在所述方法中，如果需要，在风险评估(预测)后，进行个体化风险降低(治疗)；风险越高，则规定的预防性护理越激进(Third Report of tne National Cnolesterol Education Program(NCEP)Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol inA dults (Adult Treatment Panel III)final report Circulation 106:3143-421(2002);Europeanguidelines on cardiovascular disease prevention in clinical practice:executivesummary. Eur. Heart J. 28:2375-414(2007))。在最近40年，MI初级预防的风险评估，并未发生显著变化。其仍然基于20世纪60年代弗雷明汉心脏研究所引入的风险因子概念(Kannel WBj Dawber TRj KaganA, Revotskie N，Stokes Jj 3rd.Factors oi risk in the development oi coronaryheart disease—six year follow-up experience. The FraminghamStudy. AnnInternMed. 55:33-50(1961)) o因为个体风险因子，如血浆胆固醇和血压，具有较低的独立预测會泛力(Ware JH. Thelimitations of risk factors as prognostic tools. N. Engl.I. Med. 355:2615-7(2006))，因此已将它们联合来产生全局风险评估尺度，如弗雷明汉风险评分(Framingham Risk Score, FRS)和欧洲评分(European SCORE)(系统性冠状动脉风险评估(Systematic Coronary Risk Evaluation)). (Third Report of the NationalCholesterol Education Program(NCEP)Expert Panel on Detection,Evaluation,andTreatment of High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III)finalreport. Circulation 106:3143-421 (2002);European guidelines on cardiovasculardisease prevention in clinical practice:executive summary.Eur.HeartJ. 28:2375-414(2007)) o这些多变量风险预测模型提供了 10年的绝对风险和相对风险评价。绝对风险主要用于评估药理风险降低的需要，而相对风险则更常用于鉴定生活方式发生改变的较年轻个体以减少他们其他的高的终身风险。尽管该两步预防法是可靠的，但是就其目前的形式而言，其远不是完美的，因为建立的风险因子，即使在组合时，也具有优先的预测能力(Wald NJj Morris JKj Rish
The efficacy oi combining several risk factors as a screeningtest. J. Med.Screen. 12:197-201 (2005))，且不管推荐的“最佳”治疗的开始如何，亚临床疾病向临床 MI 事件的进展仍然发生(Koenig W. Treating residual cardiovascular risk:willlipoprotein-associated phospho lipase A2 inhibit ion live up to its promise .!.Am. Coll. Cardiol. 51:1642-4 (2008))。大多数 MI 事件发生在分类于 FRS/SC0RE 低和中等风险类别的个体，即错误分类的个体中。此外，即使在最有效的医药治疗的情况下，实质性剩余风险仍然存在(Koenig W. Treating residual cardiovascular risk: willlipoprotein-associated phospholipase A2innibitionlive up to its promise .!.Am.ColI.Cardiol. 51:1642-4(2008) ;Naghavi M，Falk E，Hecht HS，et al.Fromvulnerable plaque to vulnerable patient—Part III!Executive summary of theScreening for Heart Attack Prevention and Education (SHAPE)Task Force report.Am. J. Cardiol. 98:2H~15H (2006);Lauer MS. Primary prevention of atheroscleroticcardiovascular disease: the high public burden of low individual risk. TAMA. 297:1376-8 (2007))。因此，需要提高处于最高MI事件风险的个体的检测和治疗。 发明概述已经发现了能预测个体在将来会经历MI或心脏病发作风险的生物标志物組。特别是，本文所鉴定的生物标志物组，与传统临床风险因子(如年龄、抽烟状况以及胆固醇水平)相比，为预测个体是否会经历MI，提供了优越的辨别能力。具体而言，在本发明教导的多种实施方案中，ー组生物标志物包括癌胚抗原和￠2微球蛋白。在某些实施方案中，生物标志物组还包括N末端B型钠尿肽前体、a I抗胰蛋白酶以及C反应蛋白中的至少ー种。另夕卜，提供了用于测量本文所鉴定的ー种或多种生物标志物来预测个体会经历MI的可能性的试剂盒。因此，在多种实施方案中，诊断个体MI风险的方法通常包括，测量个体的样品中ー组生物标志物的水平；诸如通过使所述生物标志物的测量水平加权，计算个体的风险评分；以及利用风险评分确定个体会经历心肌梗死的可能性。样品可以包括血液，且个体可以是人。所述方法可以包括将与个体中心肌梗死可能性有关的信息传输、显示、存储或打印或输出至用户界面装置、计算机可读存储介质、本地计算机系统或远端计算机系统。本教导方法的各个特征和步骤可以用合适的程控计算机或在合适的程控计算机的辅助下进行，特别是经设计和/或构造而如此的计算机。在本教导的方法中，生物标志物的水平，可以通过本领域已知的多种技术测定,例如通过免疫測定、比色測定、浊度测定以及流式细胞术中的至少ー种。当然，所用的具体技术将部分取决于待测量的生物标志物的属性。在本教导的某些实施方案中，计算风险评分包括，对生物标志物的測量水平进行对数转换，以便产生每ー种测量的生物标志物的转换值；将每ー种生物标志物的转换值乘以生物标志物常数，以便产生每ー种生物标志物的相乘值(multiplied value);以及将每ー种生物标志物的相乘值求和，以产生风险评分。可以将风险评分与标准风险评分或參照风险评分进行比较。參照风险评分可以是标准或阈值。鉴定的生物标志物(即包括于本教导的数组生物标志物的那些生物标志物)广泛包括碱性磷酸酶、a I抗胰蛋白酶、甲胎蛋白、载脂蛋白Al、载脂蛋白B、载脂蛋白E、P 2微球蛋白、癌胚抗原、补体成分3、肌酸酐、纤维蛋白原、Y-谷氨酰转肽酶、C反应蛋白(其包括高敏感性C反应蛋白)、铁、淋巴细胞计数、嗜中性粒细胞计数、N末端B型钠尿肽前体(其包括B型钠尿肽)、转铁蛋白饱和度以及血管内皮生长因子A。根据本教导，可以使用这些生物标志物中两种或更多种的任意组合。例如,生物标志物组可以包括这些生物标志物中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种或至少19种。在某些实施方案中，所述方法使用包括3种生物标志物的ー组生物标志物。包括3种生物标志物的生物标志物组的实例是癌胚抗原、P 2微球蛋白和a I抗胰蛋白酶；癌胚抗原、P 2微球蛋白和C反应蛋白；以及癌胚抗原、P 2微球蛋白和N末端B型纳尿妝如体。如果ー组生物标志物包括3种生物标志物即癌胚抗原、P 2微球蛋白和a I抗胰蛋白酶，则本教导方法的多种实施方案使用还包括除了那3种生物标志物外的生物标志物的ー组生物标志物。例如，某些实施方案使用ー组还包括N末端B型钠尿肽前体的4种生物标志物；一些实施方案使用ー组还包括载脂蛋白Al和载脂蛋白B的5种生物标志物；具体实施方案使用ー组还包括载脂蛋白Al、载脂蛋白B、甲胎蛋白和转铁蛋白的7种生物标志物；以及多种实施方案使用ー组还包载脂蛋白Al、载脂蛋白B、甲胎蛋白、转铁蛋白和血管内皮生长因子A的8种生物标志物。如果ー组生物标志物括3种生物标志物即癌胚抗原、^ 2微球蛋白和C反应蛋白，则本教导方法的多种实施方案使用一组除了上文直接所列的3种外还包括载脂蛋白Al、载脂蛋白B和N末端B型钠尿肽前体的6种生物标志物。在具体实施方案中，所述方法使用包括7种生物标志物的ー组生物标志物即a I抗胰蛋白酶、C反应蛋白、载脂蛋白Al、载脂蛋白B、肌酸酐、碱性磷酸酶和转铁蛋白饱和度。相关地，本教导方法的多种实施方案使用一组除了上文直接所列的7种外还包括载脂蛋白E、纤维蛋白原、Y-谷氨酰转肽酶、补体C3、嗜中性粒细胞计数和淋巴细胞计数的13种生物标志物。在另一方面，提供了用于诊断个体的MI风险的试剂盒。试剂盒可以包括一套特异 性測量个体样品中ー组生物标志物的水平的试剂和使用所述试剂盒诊断心肌梗死风险的说明书。在一些实施方案中，所述试剂測量蛋白水平。附图
简要说明当与附图一起阅读时，根据多种示例性实施方案的下列描述，将会获得对本文所公开的本教导更全面的了解。应当了解到，下文所述附图仅用于说明的目的，并非意图以任何方式限制本教导的范围。图I是示例性实施方案的表，其显示了根据推断的生物标志物的五分值基线水平的五分值(quintile),追踪4年过程中的优势比(odds ratio)。图2是示例性实施方案的表，其显示了无效事件(对照)个体中所选的风险因子之间的斯皮尔曼相关系数(Spearman correlation coefficient)。图3表示根据示例性实施方案，基于风险模型发生MI的接受者工作特征曲线，所述风险模型仅包括建立的风险因子以及包括建立的风险因子和13种推断的风险因子。图4是根据示例性实施方案，从仅包含建立的风险因子(左轴)的模型和从包含建立的风险因子和13种推断的生物标志物(横轴)的模型，为每ー个个体的近期MI计算的病例对照概率的散点图。图5表示根据示例性实施方案，MI病例个体和对照个体中，13种推断的生物标志物多标志物综合评分的基线频数分布和C反应蛋白的类似频数分布。显示了(a)C反应蛋白和(b)包括13种生物标志物的多标志物评分的基线频数分布。图6是根据示例性实施方案的接受者工作特征曲线，其证明模型风险分析在751名个体中预测未来MI的性能。图7是根据示例性实施方案的接受者工作特征曲线，其显示模型风险分析在751名个体中预测未来MI的性能。图8是根据示例性实施方案的接受者工作特征曲线，其显示模型风险分析在751名个体中预测未来MI的性能。 图9是根据示例性实施方案，根据本教导而得到的风险评分与在4年内经历MI的相对概率之间的相互关系曲线。图IOA是根据示例性实施方案，根据751名个体的研究，病例和对照间风险评分的分布图，751名个体中有252名在4年的血液测试中经历了 MI。图IOB是根据示例性实施方案，对于751名个体研究中的个体，基于每ー个体的风险评分值，预测的4年内MI相对概率的分布图，在751名个体中有252名在4年的血液测试中经历了 MI。详细描述已经发现了能预测个体会患有未来心肌梗死(MI)或心脏病发作的风险的生物标志物组。“生物标志物”可以是任何生物特征或变量，其在如人类的个体的生物系统中的定性或定量存在、不存在或水平，是所述系统生物状态的标志。因此，生物标志物可以用于评估个体的健康状况或状态。例如，可以利用加权分析或算法分析多种生物标志物的水平，以产生个体的风险评分。风险评分可以表示个体会患有未来MI事件的可能性。在一些实施方案中，风险评分的大小可能与该个体的风险水平相关。例如，风险评分较高可以表示未来MI事件的可能性较高，而风险评分较低可以表示未来MI事件的可能性较低。如实施例所详细描述的，本教导可以用于鉴定看起来健康但是可能处于经历未来MI风险的个体。提供了这种信息后，处于风险的个体可以采取主动步骤如锻炼、节食和/或寻求医药干预来减低在未来患有MI的可能性。因此，本教导可以更准确地用于预测未来MI以及可能挽救生命。另外，本教导可以用于监测个体的疾病状态或疾病进展。本文所述的生物标志物组可以单独使用或与其他生物标志物和/或临床风险因子联合使用，来測量与MI有关的ー个或多个生物过程、致病过程、疾病或对治疗干预的响应的开始、进展、严重程度、病理、侵入性、等级、活性、残疾、死亡率、发病率、疾病亚分类或其他潜在的特征。实际上，存在于样品中且可以从所述样品分离或在所述样品中测量的任何生物化合物都可以用作生物标志物。生物标志物种类的非限制实例包括多肽、蛋白、蛋白聚糖、糖蛋白、脂蛋白、碳水化合物、脂质、核酸、有机或无机化学品、天然多聚体、代谢物以及小分子。生物标志物还可以包括人体的物理測量，如血压和细胞计数，以及两种或多种生物特征或变量的比率或比例。在一些实施方案中，可以选择不同生物类别的生物标志物来产生风险评分。不同生物类别的非限制实例包括炎症敏感性血浆蛋白、载脂蛋白、铁超载标志物、生长因子以及白细胞计数。
生物标志物的“水平”或“量”，可以通过本领域已知的任何方法測定，并且会部分取决于生物标志物的属性。例如，生物标志物水平可以通过免疫測定、比色測定、浊度測定以及流式细胞术中的ー种或多种测量。应当理解到，不必測定生物标志物的绝对量，而是可以测定相对量。另外，可以通过生物样品中生物标志物的浓度、与生物标志物结合的抗体的浓度或生物标志物的功能活性(即结合活性或酶促活性)来表示生物标志物的量。如本文所用的，“參照”或“对照”或“标准”每个都表示健康个体或对照群体中生物标志物的量或表示来源于健康个体或对照群体中ー种或多种生物标志物的风险评分。生物标志物的量可以由健康个体的样品測定，或可以由对照群体的样品測定。如本文所用的，“样品”指采自个体的任何生物样品，包括血液、血浆、血清、脑脊液、胆汁酸、唾液、滑液、胸膜液、心包液、腹水、汗、粪便、鼻液、眼液、细胞内液、细胞间液、淋巴、尿、组织、肝细胞、上皮细胞、内皮细胞、肾细胞、前列腺细胞、血细胞、肺细胞、脑细胞、月旨肪细胞、肿瘤细胞以及乳腺细胞。生物样品类型的来源可以是不同的个体；不同时间的同一个体；不同状态的同一个体，例如在药物治疗前以及药物治疗后；不同性別；不同种类，例 如，人类和非人类哺乳动物；以及多种其他组合。此外，在评估之前，可以差异性地处理生物样品类型，例如利用不同的诊断检查方案(work-up protocol)。本教导通常提供诊断个体如人类或患者的MI风险(例如MI的近期风险)的方法。本文所用的“近期(near-term) ”表示从基线开始的约0到约6年，其中基线被定义为从个体采集样品用于分析的日期。例如，近期包括从基线开始的约I周、约I个月、约2个月、约3个月、约6个月、约9个月、约I年、约2年、约3年、约4年、约5年或约6年。本文所用的“近期风险”表示在近期内个体会经历MI事件的风险。在多种实施方案中，所述方法通常包括，测量个体的样品中多种生物标志物(例如ー组生物标志物)的水平(或利用所测量的水平)；通过诸如使所测量的生物标志物的測量水平加权，计算个体的风险评分；以及利用风险评分确定个体会经历心肌梗死的可能性(例如基于风险评分，确定个体中MI事件的可能性)。在一些实施方案中，所述方法包括，利用合适的程控计算机，基于ー种或多种生物标志物的測量水平，计算风险评分。在某些实施方案中，所述方法包括将与个体中MI可能性有关的信息传输、显示、存储或打印或输出至用户界面装置、计算机可读存储介质、本地计算机系统或远端计算机系统。在多种实施方案中，所述方法使用ー组生物标志物，其包括但不限于癌胚抗原、
32微球蛋白和a I抗胰蛋白酶；癌胚抗原、P 2微球蛋白和C反应蛋白；以及癌胚抗原、^ 2微球蛋白和N末端B型纳尿妝如体；癌胚抗原、^2微球蛋白和a I抗膜蛋白酶以及N末端B型纳尿妝如体；癌胚抗原、^ 2微球蛋白和a I抗膜蛋白酶、载脂蛋白Al以及载脂蛋白B ；癌胚抗原、P 2微球蛋白、a I抗膜蛋白酶、载脂蛋白Al、载脂蛋白B、甲胎蛋白以及转铁蛋白；癌胚抗原、￠2微球蛋白、a I抗胰蛋白酶、载脂蛋白Al、载脂蛋白B、甲胎蛋白、转铁蛋白以及血管内皮生长因子A ;癌胚抗原、P 2微球蛋白、C反应蛋白、载脂蛋白Al、载脂蛋白B以及N末端B型钠尿肽前体；a I抗胰蛋白酶、C反应蛋白、载脂蛋白Al、载脂蛋白B、肌酸酐、碱性磷酸酶以及转铁蛋白饱和度；以及a I抗胰蛋白酶、C反应蛋白、载脂蛋白Al、载脂蛋白B、肌酸酐、碱性磷酸酶、转铁蛋白饱和度、载脂蛋白E、纤维蛋白原、Y谷氨酰转肽酶、补体C3、嗜中性粒细胞计数以及淋巴细胞计数。在某些实施方案中，ー组生物标志物包括选自a I抗胰蛋白酶、鉄、C反应蛋白、肌酸酐以及纤维蛋白原中的两种或更多种生物标志物。在具体实施方案中，ー组生物标志物包括选自a I抗胰蛋白酶、鉄、C反应蛋白、肌酸酐以及纤维蛋白原中的3种或更多种、4种或更多种或5种生物标志物。生物标志物的水平，可以通过本领域已知的多种技术进行測定，这部分取决于生物标志物的属性。例如，生物标志物的水平可以通过免疫測定、分光光度法、酶促測定、紫外线测定、动力学測定、电化学測定、比色測定、浊度測定、原子吸附测定以及流式细胞术中的至少ー种进行測定。如果合适，可以使用其他分析技木，如质谱分析，诸如高效/压液相色谱分析(HPLC)的液相色谱分析、气相色谱分析、核磁共振光谱分析、其相关技术和组合以及杂合，例如，液相色谱串联质谱分析(LC-MS)仪器。 在一些实施方案中，计算风险评分包括对生物标志物的測量水平进行对数转换，以便产生每ー种测量的生物标志物的转换值；将每ー种生物标志物的转换值乘以生物标志物常数，以便产生每ー种生物标志物的相乘值；以及将每ー种生物标志物的相乘值求和，以产生风险评分。当然，基于ー组生物标志物的测量水平，本领域技术人员已知的其他方式也可以用于计算风险评分或相似评分，所述评分能够预测个体经历MI事件的可能性。可以将风险评分与标准或參照风险评分进行比较。參照风险评分可以是标准(例如数值)或阈值(例如图表中的线)。在某些实施方案中，如果风险评分大于參照风险评分，则个体经历MI例如未来MI事件的可能性增加。在一些实施方案中，如果风险评分小于參照风险评分，则个体经历MI例如未来MI事件的可能性降低。在一些实施方案中，个体风险评分的大小，或其超过參照风险评分的量，可以表示该个体的风险水平或与该个体的风险水平相关。例如，风险评分较高可以表示未来MI事件的可能性较高，而风险评分较低可以表示未来MI事件的可能性较低。相反，如果个体的风险评分低于參照风险评分，则个体不可能处于经历未来MI事件的显著风险中。为ー组具体的生物标志物建立參照风险评分、标准、阈值、判别界限或“截止”评分(统ー为“參照风险评分”)，在本领域中是已知的(Szklo, Moyses and Nieto, F.Javier. Epidemiology:beyond the basics. Second Edition, ^udburyjMA:Jones andBartlett Publishers (2007) ;Schlesselman，James J. Case-Control Studies. NewYork:0xford University Press (1982);Anderson KM，Odell PM, Wilson PWj KannelWB. Cardiovascular disease risk profiles. Am Heart J. 121:293-8 (1991);EichlerK，Puhan MA，Steurer J，Bachmann LM. Prediction of first coronary events withthe Framingham score : a systematic review. Am Heart J. 153 (5):722-31,731.el-8 (2007) ; Hoffmann U, Massaro JMj Fox C S，Manders E，O’Donnell CJ. Defining normaldistributions of coronary artery calcium in women and men from the FraminghamHeart Study. Am ,I Cardiol. 102(9) :1136-41, 1141. el. (2008))。本教导的方法不仅允许诊断未来MI事件例如近期MI事件的可能性或风险，而且如果个体被鉴定为心肌梗死的可能性増加，还可以包括推荐、授权或实施治疗。在所述方法的一些实施方案中，可以将与个体MI事件的可能性有关的信息传输给医疗企业、医疗保险供应商、健康护理供应商的员エ或传输给医师。而且，用于将个体鉴定为经历MI的可能性増加的相同的方法，可以适用于其他用途。例如，风险评分可以用于筛选能够减轻导致MI的致病因素的候选药物。在这种情况下，通过监测生物标志物水平和/或风险评分，可以监测候选药物的治疗。而且，利用已经发现能够有效降低未来MI可能性的任何药物，可能的是，某些个体是响应者而有些个体可能是非响应者。因此，可以在治疗过程中监测个体的风险评分，来确定药物是否有效。例如，如果个体的风险评分响应治疗而降低，则个体可以响应治疗，并因此经历未来事件的风险可以降低。当然，可能不存在响应者和非响应者的任何现有的、已知的群体，使得应当且可以随时间监测有关个体的任何未来MI事件的药物治疗的功效。就药物无效而言，可以停止其使用，并供应另ー种药物来代替它。可以利用包括其他电子装置的合适的程控计算机，如本文所述，计算风险评分。另夕卜，该合适的程控计算机或另ー个合适的程控计算机，可以将风险评分与參照风险评分进行比较，用于确定个体会经历MI的可能性的目的。合适的程序设计可以包括例如能使计算机处理、分析和/或将测量的生物标志物水平转化为风险评分并基于所述风险评分解释MI的可能性的软件、固件或其他程序代码。这类程序设计可以包括于计算机内或可以植入计算机可读介质如便携式计算机可读介质。当然，本教导的其他步骤或方法可以利用合适的程控计算机来实施或由合适的程控计算机辅助进行，例如測量生物标志物的水平、 使用风险评分、推荐和/或授权治疗，以及传输、显示、存储、打印和/输出信息。在确定风险评分和/或MI可能性后，可以将有关个体的未来MI的风险评分和/或可能性的信息显示于或输出至用户界面装置、计算机可读存储介质或本地或远端计算机系统。这类信息可以包括例如，ー种或多种生物标志物的測量水平、其风险评分或其等同项(如图表、数字、符号等)，以及与本文所述方法有关的任何其他数据。显示或输出信息表示，利用任何介质，例如ロ头、书面或打印输出，通过可视的显像计算机可读介质、计算机系统或其他电子装置(例如智能手机、个人数字助理(PAD)、便携式电脑等)，将所述信息传达给用户。对本领域技术人员显然的是，输出信息并非限于向用户或相连的外部元件，如计算机系统或计算机内存输出，而是可选地或另外地输出到诸如任何计算机可读介质的内部元件。计算机可读介质可以包括但不限于硬盘、软盘、⑶_R0M、DVD以及DAT。计算机可读介质不包括载波或用于数据传输的其他波形式。对本领域技术人员显然的是，本文公开和请求保护的各种样品评估和诊断方法，可以但不必是计算机执行的，并且例如，可以通过例如ロ头或书面(例如书写)传达给人，而进行显示或输出步骤。根据多种实施方案，可以将风险评分、MI的可能性、测量的生物标志物的水平、參照风险评分以及以上的等同项中的至少ー种显示于屏幕或可触摸介质上。在某些实施方案中，可以将这类信息传输给医药企业、医疗保险供应商、健康护理供应商的员エ或传输给医师。本教导还包括可用于进行本文所述诊断方法的试剂盒和系统。本文所述方法可以通过例如诊断实验室、服务供应商、实验室以及个体进行。除了这些环境以外，试剂盒还可以用于其他环境中。试剂盒可以包括用于测量个体的样品中ー种或多种生物标志物、分析測量水平以及鉴定个体是否处于MI风险中的试剂和材料。例如，在一些实施方案中，试剂盒可以包括针、注射器、小瓶或用于获得和/或含有个体的样品的其他仪器。在一些实施方案中，试剂盒可以包括至少ー种用于特异性检测或定量本文所公开的生物标志物的试剂。换而言之，本领域技术人员可以很容易地选择合适的试剂和技术，用于包括于检测或定量那些生物标志物的试剂盒中。例如，如果生物标志物是蛋白，则试剂盒可以包括适合利用例如免疫测定(如化学发光免疫測定)、比色測定或浊度测定检测蛋白的试剂(如抗体)。如果生物标志物是细胞，则试剂盒可以包括适合利用例如流式细胞术检测细胞的试剂。如果生物标志物是有机或无机化学品、脂质或小分子，则试剂盒可以包括适合利用例如HPLC、酶促測定、分光光度法、紫外线测定、动力学測定、电化学測定、比色測定、原子吸附测定以及质谱分析检测此类生物标志物的试剂。如果生物标志物是核酸(如RNA)或核酸编码的蛋白，则试剂盒可以包括适合利用例如PCR、杂交技术以及微阵列检测核酸的试剂。取决于待测量的生物标志物，试剂盒可以包括提取缓冲液或试剂、扩增缓冲液或试剂、反应缓冲液或试剂、杂交缓冲液或试剂、免疫检测缓冲液或试剂、标记缓冲液或试剂以及检测工具。试剂盒也可以包括对照，其可以是对照样品、參照样品、内部标准或以前产生的经验数据。对照可以对应于正常、健康个体或患有已知的MI疾病状态的个体。另外，可以为 每ー生物标志物提供对照，或对照可以是參照风险评分。试剂盒可以包括每种个体试剂的ー个或多个容器。根据管理机构的要求，试剂盒还可以包括进行本文所述方法和/或解释结果的说明书。另外，软件可以包括于试剂盒中，用于分析检测的生物标志物水平、计算风险评分和/或确定MI的可能性。优选地，将试剂盒包装于适合商业配送、销售和/或使用的容器中。进行本文公开的方法的系统可以包括，用于测量ー组生物标志物的水平的分析仪器，以及用于进行所述方法的一个或多个步骤的合适的程控计算机。例如，合适的程控计算机可以进行或辅助下述中的ー个或多个测量个体的样品中ー组生物标志物的水平；通过本领域已知的或本文所教导的各种技术计算风险评分；利用风险评分确定个体会经历心肌梗死的可能性；以及显示与MI的可能性有关的信息，如测量的生物标志物水平、风险评分、MI的可能性、參照分析评分以及以上的等同项。为了举例说明而非限制，提供了下述实施例。实施例I :推断的生物标志物的鉴定方法研究群体本研究的目的是，通过专注于在风险评估后的4年内发展MI的个体，改善处于最高风险的个体的检测。以前并未报道这类近期MI的风险因子和预测物(predictor)，主要是因为大多数研究都太小，而不能累积充足数量的近期MI事件。显然，以叠加于发炎和破裂的动脉粥样硬化斑块上的血栓形成为主导的如同MI —祥的近期事件的风险因子，不同于以动脉粥样硬化的缓慢发展为主导的较长期事件的风险因子。为此，使用基于大社区的前瞻性巢式病例对照研究，即利用45，735名男子和女子的哥本哈根一般群体研究(Copenhagen General Population Study)与哥本哈根市心脏研究(Copenhagen CityHeart Study)的联合。參与者来自哥本哈根市心脏研究2001-2003年检查以及来自哥本哈根一般群体研究2003-2007年检查。哥本哈根市心脏研究是在1976年发起的丹麦一般群体的前瞻性心血管群体研究，包括參与ー项或几项检查的丹麦后裔的白种男人和女人(NordestgaardBGjBenn M，Schnohr P，Tybjaerg-Hansen A. Nonfasting triglycerides and risk ofMI，ischemic heart diseaseand death inmenand women. JAMA. 298:299-308 (2007))0在2001-2003年的检查中，从5907名个体(50%的参与率)中釆集血液样品。哥本哈根一般群体研究(CGPS)是2003年发起且仍然还在招募的丹麦一般群体的前瞻性研究(Noraestgaard BG, Benn M, Schnohr P，Tybaerg-Hansen A. Nonfastmg triglyceridesand risk of MI, iscnemic heart disease, and death in men and women. TAMA. 298:299-308(2007);Frikke-Schmidt R, Nordestgaard BG, Stene MC, et al. Association ofIoss-of-function mutations in the ABCA lgene with high-density lipoproteincholesterol levels and risk of ischemic heart disease. TAMA. 299:2524-32(2008)),目标是精确查明哥本哈根市心脏研究中的总计100，000名參与者。在2003年至2007年间，哥本哈根一般群体研究的39，828名个体返回了血液样品(45%參与率)。在联合研究中在抽血的4年内，鉴定了发生非致命或致命MI的252名參与者。使对照与同一研究的病例匹配，以2:1的比值从具有血液样品而无MI历史(但是他们以前可能经历其他心血管疾病或血管再生木)的參与者中随机选择，并且匹配年龄(I年内)、性别、检查和抽血的年份(I年 内)以及HMG-CoA还原酶抑制剂使用(使用或不使用)。收集MI 的诊断信息(World Health Organization; InternationalClassification of Diseases, 8th edition: codes 410; 10th edition: codes 121-122),并通过回顾输入丹麦国家患者登记(national Danish Patient Registry)中的所有住院和诊断来证实；使用医院和全科医师的医疗记录来证实需要至少两种下述标准的存在的MI诊断表示MI的特征性胸痛、心肌酶升高以及心电图变化。5个病例仅能匹配一个对照而不是两个。因此，总计252个病例和499个对照可用于分析。这些研究获得海莱乌医院(Herlev Hospital)和丹麦伦理委员会的许可。參与者给出了书面知情同意。津立的风险因子測量新鲜血浆的非空腹总胆固醇、高密度脂蛋白(HDL)胆固醇以及甘油三酯(Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany)。如果甘油三酯小于 4mmol/L,则根据Friedewald计算低密度脂蛋白(LDL)胆固醇，但是如果甘油三酯的水平较高，则直接測量。抽烟状况被限定为从来不抽烟、过去是烟民或目前是烟民。糖尿病是自我报道疾病，使用胰岛素或ロ服降血糖药和/或非空腹血浆葡萄糖大于llmmol/L。身体不活动是业余时间活动每周小于4小时，且主要从事久坐的工作。身体质量指数是体重除以身高的平方(m2)。在休息5分钟且个体采用坐姿后，測量血压。早期MI家族史被定义为MI存在于55岁前的一级男性亲属中或者MI存在于65岁前的ー级女性亲属中。推断的牛物标志物由非空腹新鮮血液样品，利用比色测定和浊度测定(Konelab, Helsinki, Finland, Dade Behring, Deerfield, Illinois, USA, ILS LaooratoriesScandinavia, Allcrod, Denmark or Dako, Glostrup, Denmark)或流式细胞术(Bayer, Germany),测量14种生物标志物，即高敏感性C反应蛋白(CRP)、纤维蛋白原、a I抗胰蛋白酶、补体成分3 (补体C3)、载脂蛋白Al、载脂蛋白B、载脂蛋白E、铁、转铁蛋白(转铁蛋白饱和度)、肌酸酐、碱性磷酸酶、Y -谷氨酰转肽酶、淋巴细胞计数和嗜中性粒细胞计数。通过用血清铁水平(umol/L)除以两倍的转铁蛋白水平(umol/L)，计算转铁蛋白饱和度(%)。除非另有理解，如本文所用，“高敏感性C反应蛋白”和“ C反应蛋白”(和“ CRP”)交換使用，并表示相同的蛋白。冷冻751名个体的血液样品，用于随后的分析。随后解冻这些冷冻的血液样品，用于按如下测量其他蛋白和其他生物化学度量。利用Rules Based Medicine, Inc.(Austin, TX)的HumanMAP I. 6版本的Luminex多元免疫测定技术，测量751份血浆样品中每ー份的下列蛋白甲胎蛋白、￠2微球蛋白、癌胚抗原以及血管内皮生长因子A。利用Searchlight SearchLight化学发光免疫测定测量技术(ThermoScientific, Rockford, IL),测量751份血衆样品中姆ー份的蛋白N末端钠尿肽前体(NT-proBNP)。除非另有理解，本文所用的“N末端B型钠尿肽前体”和“B型钠尿蛋白”(和"NT-proBNP")交換使用，并表示相同的蛋白。
·
统计分析对于连续测量，利用斯氏不配对t检验，对于比例，利用Fisher精确检验，比较病例和对照个体之间基线时的变量。基线被定义为为每个个体抽血的日期。利用斯皮尔曼相关性，计算变量之间的相关性。基于它们在对照个体中的分布，将连续变量的水平分为五分值。用条件逻辑回归检查基线变量水平与MI发生率之间的相关性。评估17种基线生物标志物变量a I抗胰蛋白酶、碱性磷酸酶、载脂蛋白Al、载脂蛋白B、载脂蛋白E、补体C3、肌酸酐、纤维蛋白原、Y-谷氨酰转肽酶、铁、转铁蛋白、转铁蛋白饱和度、C反应蛋白、淋巴细胞计数、嗜中性粒细胞计数、嗜中性粒细胞计数与淋巴细胞计数的比以及载脂蛋白B与载脂蛋白Al的比。构建2个统计模型。ー个模型考虑了在没有调整其他风险因子的情况下进行评估时的变量。另ー个模型是多变量的，并且对如下9种建立的基线风险因子进行调整总胆固醇(以基于对照个体的五分值)、HDL胆固醇(以基于对照个体的五分值)、甘油三酯(以基于对照个体的五分值)、5种血压类别(收缩压/舒张压小于120/80mmHg、^ 120/80和<130/85mmHg、彡 130/85 和 <140/90mmHg、彡 140/90 和 <160/100mmHg、或彡 160/100mmHg 或使用抗高血压治疗)、抽烟状况(从来不抽烟、目前是烟民、以前是烟民)、糖尿病(有/无)、早期MI的家族史(有/无)、身体质量指数(作为连续变量治疗)和身体活动(对分，每周活动少于4小时且从事久坐的工作，或每周的活动大于4小时和/或不从事久坐的工作)。还评估了不同的统计模型，其未考虑任何生物标志物并仅包括如上文所述分类的9种建立的基线风险因子。用似然比检验确定包括目的变量的逻辑回归模型是否比无变量的逻辑回归模型提供更好的拟合(fit)。为了检验类别间的线性趋势，用五分值内的中值水平作为连续测量。在単独的二次分析中，评估了包括上文所列举的9种建立的基线风险因子和17种生物标志物中的13种的条件逻辑回归模型，以发生MI作为結果。4种生物标志物并未包括于该分析中，这是因为与其他生物标志物的高相关性除去了血清铁和转铁蛋白以转铁蛋白饱和度来替代，除去了嗜中性粒细胞计数与淋巴细胞计数的比，并且单独保留了嗜中性粒细胞计数和淋巴细胞计数，除去了载脂蛋白B与载脂蛋白Al的比，并单独保留了载脂蛋白B和载脂蛋白Al。按照以前，对建立的风险因子进行分类，并且对这种分析的生物标志物水平进行对数转换，并视为连续变量。用条件逻辑回归模型和为每ー个体计算的MI的相关概率构建接受者工作特征(ROC)曲线，和MI发生的ニ元結果。作为评价风险模型性能改善的ROC曲线下面积的补充，计算综合区别改善(integrated discriminationimprovement)或 IDI、统计数值或相对 IDI 统计数值(AHA Scientific Statement,criteria for evaluation oi novel markers oi cardiovascular risk. Circulation119:2408-2416(2009);Pencina MJ, D’Agostino RB Sr,D'Agostino RB Jr, VasanRS. Evaluating the added predictive ability of a new marker:from area under theROC curve to reclassfication and beyond Stat Med Jan 30;27 (2):157-72 (2008))。IDI检验测量风险预测模型的性能，并且与ROC曲线下面积互补。相对IDI等同于发展了事件的个体的平均预测风险与未发展事件的个体的平均预测风险之间差异的改善。另外，按照如下构建包括13种生物标志物的对数转换水平的“多标志物评分”:多标志物评分=(P i X生物标志物i) + ( P 2 X生物标志物2) + ( P i X生物标志物i)等，其中表示与条件逻辑回归模型中第i个生物标志物相关的0系数的估计，所述条件逻辑回归模型也包括9种建立的风险因子。不包括在17个基于血液的目的生物标志物变量中的任意变量或9种建立的基线 风险因子中的任何因子中測量结果缺失的个体。因此统计分析的最終数据集由699个个体构成，包括236个病例和463个匹配的对照。所有的P值都是双尾的。概率值小于0.05，视为显著。在95%的水平，计算所有置信区间。使用9. I版的SAS软件(SAS Institute)和2. 6版的R软件进行统计分析。结果利用弗雷明汉心脏研究(WilsonPff, D' Agostino RB, Levy D, BelangerAM, Silbershatz H，Kannel #B. Prediction oi coronary heart disease using riskfactor cateRories. Circulation 97:1837-47 (1998))公开的性别特异性风险方程式，计算基线时全部研究群体的10年绝对风险。所有近期MI事件中只有36%发生于分类为高风险的个体中(表I)。换而言之，64%实际上经历了近期MI事件的个体未被鉴定为处于高风险中。风险因子表I显示了研究群体的基线特征，包括在较长期研究中鉴定的ー些主要的心血管风险因子。在包含这些建立的风险因子中的9种因子的模型中，HDL胆固醇、抽烟状况(目前抽烟)以及糖尿病的存在与近期发生MI显著相关(表2)。在本研究中病例和対照的年龄和性别匹配，因此年龄和性别并未包括于该模型中。表I.病例和対照的基线特征
权利要求
1.诊断个体的心肌梗死风险的方法，所述方法包括 测量个体的样品中ー组生物标志物的水平，其中所述ー组生物标志物包括 (i)癌胚抗原和￠2微球蛋白；以及 (ii)N末端B型钠尿肽前体、aI抗胰蛋白酶和C反应蛋白中的至少ー种 通过使所述生物标志物的測量水平加权，计算所述个体的风险评分；以及 利用所述风险评分确定所述个体会经历心肌梗死的可能性。
2.如权利要求I所述的方法，其中所述ー组生物标志物包括N末端B型钠尿肽前体。
3.如权利要求I所述的方法，其中所述ー组生物标志物包括aI抗胰蛋白酶。
4.如权利要求I所述的方法，其中所述ー组生物标志物包括C反应蛋白。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述ー组生物标志物包括N末端B型钠尿肽前体。
6.如权利要求3所述的方法，其中所述ー组生物标志物还包括载脂蛋白Al和载脂蛋白B0
7.如权利要求4所述的方法，其中所述ー组生物标志物还包括N末端B型钠尿肽前体、载脂蛋白Al以及载脂蛋白B。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述ー组生物标志物还包括甲胎蛋白和转铁蛋白饱和度。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述ー组生物标志物还包括血管内皮生长因子。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述计算风险评分的步骤包括 对所述生物标志物的測量水平进行对数转换，以便产生每ー种测量的生物标志物的转换值； 将所述每ー种生物标志物的转换值乘以生物标志物常数，以便产生每ー种生物标志物的相乘值；以及 将所述每ー种生物标志物的相乘值求和，以便产生所述风险评分。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，包括将与所述个体的心肌梗死的可能性有关的信息传输、显示、存储或打印或输出于用户界面装置、计算机可读存储介质、本地计算机系统或远端计算机系统的步骤。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述信息是所述风险评分或其等同项。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，包括如果所述个体被鉴定为心肌梗死的可能性増加，推荐、授权或实施治疗。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，包括如果所述风险评分大于參照风险评分，将所述个体鉴定为患有心肌梗死事件的可能性増加，并且如果所述风险评分小于所述參照风险评分，将所述个体鉴定为患有心肌梗死事件的可能性降低。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述參照风险评分是标准或阈值。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述计算利用合适的程控计算机进行。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中通过免疫測定、比色測定、浊度测定以及流式细胞术中的至少ー种，測定所述测量的生物标志物水平。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述样品包括血液。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述个体是人。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述心肌梗死风险是近期风险。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述风险评分包括所述个体年龄的加权度量。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述风险评分包括所述个体的ー种或多种临床风险因子的加权度量，其中所ー种或多种临床风险因子选自抽烟状况、糖尿病、早期心肌梗死家族史、身体质量指数、身体活动、非空腹总胆固醇、HDL胆固醇、LDL胆固醇以及甘油三酷。
23.诊断个体的心肌梗死风险的方法，所述方法包括 测量个体的样品中ー组生物标志物的水平，其中所述ー组生物标志物包括a I抗胰蛋白酶、C反应蛋白、载脂蛋白Al、载脂蛋白B、肌酸酐、碱性磷酸酶以及转铁蛋白饱和度；通过使所述生物标志物的測量水平加权，计算所述个体的风险评分；以及利用所述风险评分确定所述个体会经历心肌梗死的可能性。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述ー组生物标志物还包括载脂蛋白E、纤维蛋白原、Y谷氨酰转肽酶、补体C3、嗜中性粒细胞计数以及淋巴细胞计数。
25.如权利要求23或24所述的方法，其中通过用血清铁水平除以两倍的转铁蛋白水平，计算所述转铁蛋白饱和度。
26.诊断个体的心肌梗死风险的试剂盒，所述试剂盒包含 一套特异性测量个体的样品中ー组生物标志物的水平的试剂，其中所述ー组生物标志物包括 a)癌胚抗原和￠2微球蛋白；以及 (ii)N末端B型钠尿肽前体、a I抗胰蛋白酶和高敏感性C反应蛋白中的至少ー种；以及 使用所述试剂盒诊断所个体的心肌梗死风险的说明书。
27.如权利要求26所述的试剂盒，其包含參照风险评分。
28.如权利要求27所述的试剂盒，其中所述參照风险评分是标准或阈值。
29.如权利要求26-28中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂测量蛋白水平。
全文摘要
本发明公开了通过测量个体的样品中一组生物标志物的水平，诊断个体的心肌梗死风险的生物标志物和方法。通过使生物标志物的测量水平加权，计算个体的风险评分。然后用风险评分确定个体是否可能经历心肌梗死。另外，公开了包括一套用于特异性测量个体的样品中生物标志物水平的试剂的试剂盒。
文档编号G01N33/50GK102812359SQ201080060373
公开日2012年12月5日 申请日期2010年11月15日 优先权日2009年11月13日
发明者阿拉姆·S·阿多立安, 郭昱, 李晓红, 皮尔特·曼特恩戴姆 申请人:Bg医药公司