一种抗白细胞介素-8抗体的制作方法

专利名称：一种抗白细胞介素-8抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗白细胞介素_ 8抗体。
背景技术：
抗体(antibody)是机体在抗原物质刺激下，由B细胞分化成的浆细胞所 产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。
如图1所示，抗体结构根据功能可分解成几种形式全抗体(IgG)、 抗原结合片段(antigen-binding fragment, Fab )和单链抗体(scFv),每种 抗体均包括重链(H链)和轻链(L链)。
重链和轻链上有可变区，可变区由相互交替的4个框架区(FRs)和 3个高变区(CDRs)组成。框架区的氨基酸序列相对保守，高变区的氨基 酸组成和排列顺序更易发生变化，决定了抗体结合抗原的特异性。IgG和 Fab上还有恒定区，在给定的物种中，不同抗体分子的恒定区都具有相同 的或几乎相同的氨基酸序列。
抗体-抗原反应是一种独特的蛋白质-蛋白质相互作用。研究蛋白质-蛋白质相互作用最常用的方法之一是由Fields及其同事发明的酵母双杂交 技术(Marks JD, Hoogenboom HR， Bonnert TP, McCafferty J， Griffiths AD, Winter G. (1991) J Mol Biol. 222:581-597.) (Fields, S and Song, O. (1989) Nature 340:245-247.)，这项技术只需要DNA序列而非蛋白质就能确定结 合的部分(Bartel PL, Fields S (ed.) (1997) "The Yeast Two-Hybrid System (Advances in Molecular Biology)" Oxford University Press.) ( Zhu L and Hannon (ed.) (2000) "Yeast Hybrid Technologies" Eaton Publishing, Natick, MA.) (Fields S, Sternglanz R. (1994) Trends Genet. 10:286-292.)。酵母双杂 交技术的原理是利用相互作用的二个蛋白质组分使与该二组分融合的转 录因子结合并激活核报告基因的转录，使该技术广泛应用于研究蛋白质-蛋白质相互作用(De Jaeger G et al (1997) FEBS Lett. 403:116-122.) (Tavladoraki P, Benvenuto E, Trinca S, De Martinis D， Cattaneo A, Galeffi P.
(2000) Nature. 366:469-472.)，或胞内抗体(intrabodies )的研究(Visintin M, Tse E, Axelson H， Rabbitts TH, Cattaneo A. (1999) Proc Natl Acad Sci USA. 96:11723-11728.) (De Jaeger G Fiers E， Eeckhout D, Depicker A. (2000) FEBS Lett. 467:316-320. ) ( Portner-Taliana A, Russell M, Froning KJ， Budworth PR， Comiskey JD, Hoeffler JR (2000) J Immunol Methods. 238:161-172.)。
白细胞介素-8( Interleukin-8，或称IL-8 )是CXC趋化因子(Chemokine) 家族中一员。已知IL-8是一种嗜中性粒细胞(Neutrophil)的强烈趋化及激 活因子(Schroder JM, Mrowietz U， Morita E, Christophers E. (1987) J Immunol. 139:3474-3483.) ( Peveri P, Walz A， Dewald B， Baggiolini M. (1988) J Exp Med. 167:1547-1559.)。目前认为IL-8能强力地汇集并激活嗜 中性粒细胞，在许多生理和病理过程中都有广泛的生物活性(Schall TJ, Bacon KB. (1994) Curr Opin Immunol. 6:865-873.)。过量的IL-8能造成炎症 等自身免疫疾病(Baggiolini M， Clark-Lewis I. (1992) FEBS Lett. 307:97-101 )。 IL-8可由多种参与炎症反应的细胞分泌而产生，如巨噬细胞、 嗜中性粒细胞、淋巴细胞、内皮细胞、角质化细胞等等，继而作用于内皮 细胞、嗜中性粒细胞和T淋巴细胞等多种炎症相关的细胞，从而形成炎症 反应。很多人类疾病与体内IL-8表达和分泌的异常或过量、失衡有关。
中国专利200410089202.4公开了 一种具有中和白细胞介素-8(IL-8)生 物活性的单克隆抗体以及该单克隆抗体的可变区序列。该专利以IL-8为免 疫源，以小鼠为免疫对象，通过免疫注射小鼠，取免疫小鼠脾脏制备悬液， 并使之与骨髓瘤细胞进行细胞融合获得可表达抗IL-8单克隆抗体的杂交 瘤细胞林以制备抗IL-8单克隆抗体。
中国专利申请01813639.7公开了一种在酵母中生产抗体文库以及筛 选抗体的方法，在酵母细胞中表达试验蛋白质文库，该试验融合蛋白质包 含在文库内序列变异的第一多肽亚基，在文库内其序列独立于第一多肽亚 基变异的第二多肽亚基，和一个连接第一和第二多肽亚基的接头肽；在表 达试验蛋白质的酵母细胞中表达一种或多种靶融合蛋白质，每种靶融合蛋 白质包含一个靶肽或蛋白质；和筛选那些表达报道基因的酵母细胞，该报 道基因的表达被试验融合蛋白质结合到靶融合蛋白质上所激活。

发明内容
本发明提供了 一种特异性高的抗白细胞介素-8抗体。 一种抗白细胞介素-8抗体，其重链可变区中的3个高变区CDRH1 、 CDRH2 、 CDRH3 的氨基酸序列分另'J为 GDSISPNYWT 、 YIFYTGTTNYNPSLKS、 SGFCGRSRCQPLYYYYFGMDV;其轻链可变区 中3个高变区CDRL1 、 CDRL2 、 CDRL3的氨基酸序列分别为 TGSGGSIASNHVH、 ENDRRPS、 QSSDGLSRW。
一种抗白细胞介素-8抗体，其重链可变区具有SEQ NO.3所述的氨 基酸序列；所述的轻链可变区具有SEQNO.4所述的氨基酸序列。 上述抗体可以是全抗体、抗体片段或单链抗体。 本发明还提供了 一种编码上述人白细胞介素-8抗体的基因。 上述抗体可应用于制备用于治疗与人白细胞介素-8表达和分泌异 常、过量或失控相关的疾病的药物。
本发明抗白细胞介素-8抗体特异性高，制备过程相对简单，成本低廉。


图1为抗体3种类型的结构示意图； 图2为本发明单链抗体的结构示意图3为本发明#化-8-51抗体特异性测试抗体浓度与0045()关系曲线图； 图4为本发明#化-8-41抗体特异性测试抗体浓度与0045()关系曲线图； 图5为本发明射L-8-51抗体浓度与IL8趋向抑制率的关系曲线图； 图6为本发明釘L-8-41抗体浓度与IL8趋向抑制率的关系曲线图。
具体实施例方式
本发明釆用专利申请01813639.7公开的方法构建人单链抗体文库，并 在人单链抗体文库中筛选IL-8抗体，具体实施过程如下 实施例1逆转录和扩增得到人抗体重链和轻链DNA
以来自人骨髓、人胎肝、人脾和人外周血白细胞的poly A+ RNA (购 自Clontech )为模板，并使用从Clontech购得的逆向转录酶试剂盒，以oligo (dT)和随机引物(mndom primers)为引物，根据Clontech试剂盒所提供的
方法指南，将polyA+RNA逆向转录成cDNA。以上述cDNA为模板，使 用一系列识别人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因的引物， 应用PCR法扩增人抗体中所有的重链和轻链的可变区。 一系列识别人抗 体重链和轻链可变区基因的引物序列如下
第1组人抗体重链可变区(VH)基因的5，-端引物
VHlb: 5，- CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG GTG CAG CTG CAGGAG TC(C/G)G
VH2b: 5，- CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG GTA CAG CTG CAG CAG TCA
VH3b: 5，- CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG GTG CAG CTA CAG CAG TGG G
VH4b: 5，-CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GAG GTG CAG CTG (G/T)TG GAG (A/T)C(C/T)
VH5b: 5，- CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG GTC CAG CT(G/T) GT(A/G) CAG TCT GG
VH6b: 5，- CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG (A/G) TC ACC TTGAAGGAG TCTG
VH7b: 5，- CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG GTG CAG CTG GTG (C/G)A(A/G) TCTGG
第2组人抗体重链可变区(VH)基因的3，-端引物
GT GAC CAG GGT G
VH2f: 5，画GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT T
VH3f: 5,隱GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC TGA AGA GAC GGT GACCATTGT
VH4f: 5，- GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC TGA GGA GAC GGT GAC CGTGGT CC
VH5f: 5，- GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC GGT TGG GGC GGA TGC ACT CC
VH6f: 5，國GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC (C/G)GA TGG GCC CTT GGT GGA (A/G) GC
第3组人抗体入-轻链可变区(V入)基因的5，-端引物
VLlb: 5，- GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG TCT GT(C/G) (C/G/T)TG ACG CAG CCG CC
VL2b: 5，- GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT TCC TAT G(A/T)G CTG AC(A/T) CAG CC A C
VL3b: 5，- GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT TCC TAT GAG CTG A(C/T)(A/G) CAG C(C/T)A CC
VL4b: 5，- GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG CCT GTG CTG ACT CA(A/G) (C/T)C
GTG AC(C/T) CAG GAG CC
VL6b: 5，誦GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG CC(A/T) G(G/T)G CTG ACT CAG CC(A/C) CC
VL7b: 5 ，- GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT TCC TCT GAG CTG A(C/G)T CAG GA(C/G) CC
CTGA(C/T)T CAG CCT
VL9b: 5,- GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT AAT TTT ATG CTG ACT CAG CCCC
第4組人抗体入-轻链可变区(V入)基因的3，-端引物
VLlf: 5，國GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TAG GAC GGT
(C/G)A(C/G) CTT GGT CC
VL2f: 5，- GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA GAG GAC GGT CAG
CTG GGT GC
第5组人抗体K-轻链可变区(VK)基因的5，-端引物
(A/G/T)TG ACC CAG TCT CC
VK2b: 5，- GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT GAA ATT GT(A/G) (A/T)TG AC(A/G) CAG TCT CC
VK3b: 5，- GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT GAT ATT GTG (A/C)TG AC(C/G/T) CAG (A/T)CT CC
VK4b: 5,- GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT GAA ACG ACA CTC ACGCAGTCTC
第6组人抗体k-轻链可变区(vk)基因的3，-端引物 VKlf: 5'國GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TTT GAT TTC CAC CTT GGT CC
VK2f: 5,- GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TTT GAT CTC CA(C/G) CTT GGT CC
VK3f: 5，- GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TTT GAT ATC CAC TTT GGT CC
VK4f: 5，- GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TTT AAT CTC CAG TCGTGTCC
PCR法扩增人抗体中的重链可变区(VH)时应用上述第1组引物与第2 组引物的组合，即有42个PCR反应；类似地，扩增人抗体中的入轻链可 变区(V入)时应用上述第3组引物与第4組引物的组合，即有18个PCR 反应；扩增人抗体中的k轻链可变区(vk)时应用上述第5组引物与第6 组引物的组合，即有16个PCR反应。
第1组引物中包含有酵母双杂交载体pACT2 ( Hua SB， Luo Y, Qiu M, Chan E, Zhou H， Zhu L. (1998) Gene. 215:143-152.) ( Hua SB, Qiu M, Chan E, Zhu L， Luo Y. (1997) Plasmid. 38:91-96.)多克隆位点上游的同源序列(下 划线部分)；第4组和第6组引物中包含有与酵母双杂交载体pACT2多克 隆位点下游的同源序列(下划线部分)；而第2组、第3组和第5组引物 中包含有连接肽(linker)的序列(下划线部分)。连接肽用于连接抗体的重 链和轻链的可变区。
PCR法扩增人抗体中所有的重链和轻链可变区的反应条件如下
5.0 pi PCR緩冲液(10x)
1.0 pl 3'-端引物(10(iM) 1.0 ^ 5，-端引物(10|iM) 5.0 pl cDNA底物 l年 dNTP(10mM) 36 pl 水
1.0单位Taq聚合酶(Clontech生产)
将上述各组分混合均匀后置于PCR仪(Applied BioSystems公司)中 进行反应。PCR反应的参数为解链94 。C, l分钟、退火50 °C， l分钟、 延伸72 。C, 2.5分钟、循环30次。
实施例2连接载体多克隆位点的同源序列和连接肽序列
以实施例1中所述PCR所得的人抗体重链可变区DNA为才莫板，以引 物7和引物8分别为上游引物和下游引物，采用PCR法进行扩增，反应 条件同上。引物7序列为载体pACT2多克隆位点的上游同源序列，引物8 序列为连接肽反链序列。 引物7(pACT2多克隆位点上游同源序列)
5'-ACC CCA CCA AAC CCA AAA AAA GAG ATC TGT ATG GCT TAC CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC 引物8 (连接肽反链序列)
5，-ACT GCC TCC ACC ACC GCT GCC ACC TCC GCC AGA TCC TCC GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC
以实施例1中所述PCR所得的人抗体轻链可变区DNA为模板，以引 物9和引物IO分别为下游引物和上游引物，采用PCR法进行扩增，反应 条件同上。引物9为载体pACT2多克隆位点的下游同源序列，引物10为 连接肽顺链序列。
引物9 (pACT2多克隆位点下游同源序列)
5'-GAG ATG GTG CAC GAT GCA CAG TTG AAG TGA ACT TGC GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA 引物IO (连接肽顺链序列)
5,-GGC GGT GGT GGA TCA GGC GGC GGA GGA TCT GGC GGA GGT GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT
实施例3将人抗体重链和轻链DNA通过连接肽序列连接成单链抗体
将实施例2中PCR扩增得到的含载体pACT2多克隆位点的同源序列 和连接肽序列的人抗体重链可变区DNA和轻链可变区DNA混合。以该 混合DNA为模板，以引物7和引物9分别为上游引物和下游引物，进行 PCR扩增，得到包括人抗体重链DNA序列、轻链DNA序列、载体pACT2 多克隆位点同源序列以及连接肽DNA序列的单链抗体(scFv) DNA,反 应条件同实施例1
实施例4 构建人单链抗体(scFv)基因文库
上述实施例3所述的单链抗体(scFv) DNA两侧接有酵母双杂交载 体pACT2 ( Clontech公司生产)多克隆位点两侧的同源序列。将上述实施 例3所述的单链抗体(scFv ) DNA与经限制性内切酶(Bam HI和Eco RI) 处理后的酵母双杂交载体pACT2按照Clontech公司提供的方法(Yeast Protocol Handbook, PT3024-1 )将其共同转化进入酵母菌抹Y187 (基因型 ura3-52, his3-200, ade2-101, lys2画801， trpl陽901， leu2-3,112, gal4 △, gal80A, URA3::GALlUAS-GALlTATA-lacZ)内，经细胞内同源重组后将单 链抗体(scFv) DNA整合到pACT2载体上，从而得到酵母双杂交单链抗 体(scFv)文库。单链抗体(scFv) DNA片段与pACT2载体上的Gal4激 活区i或(Activation Domain, AD)融合在一起。
为检查这个人单链抗体(scFv)文库的质量，随机挑出了 21个克隆。 对插入片段测序分析表明所有克隆都包括与Gal4融合在一起的单链抗体 (scFv) DNA片段(数据未显示)，而且所有单链抗体(scFv) DNA序列 都是独特的。
上述经同源重组而得到酵母双杂交单链抗体(scFv)基因文库中抗体 DNA拷贝数大约有1 x 108个，可应用于酵母双杂交技术筛选特定的抗体。
实施例5 筛选抗体
将编码人IL-8的DNA克隆进入载体pGBKT7 (Clontech公司)构建出 pGBK-IL-8。 pGBK-IL國8编码Gal4 DNA结合区域(Binding Domain, BD) 并融合在人IL-8的N端。
在编码人IL-8的DNA序列得到验证后，pGBK-IL-8质粒DNA转化 进酵母菌抹AH109 (基因型M/4Ih， um3-52, his3-200, ade2-101, trpl-901， leu2-3,112， gal4A, gal80A， LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA陽HIS3， GAL2UAS-GAL2TATA國ADE2, URA3: :MEL 1UAS-MEL1 TATA-lacZ)
(Clontech公司)。带有pGBK-IL-8质粒的AH109酵母可在不含色氨酸的合 成培养基(SDAW)上生长。
将等量的含有pGBK-IL-8的M47ii型酵母细胞(AH109菌林)与包 含单链抗体(scFv)基因文库的M^ror^酵母细胞(Y187菌林)进行共 同培养时，此二型细胞即可交配结合。
载有单链抗体(scFv )文库的pACT2载体含有基因，pGBK-IL-8 包含77 尸/基因。包含上述两种质粒的酵母细胞可以生长在不含亮氨酸和 丝氨酸的酵母合成培养基(SDALW)。存在scFv/IL-8相互作用的细胞会激 活整合在菌抹基因组中的报告基因JZ)五2和i/ZS3，从而使得酵母细胞可以 生长在缺乏腺噪呤，组氨酸，亮氨酸和色氨酸的培养基(SDZ-AHLW)上， 并在该平板培养基上形成菌落。
在上述筛选培养基(SDAAHLW)上总共挑选出27个菌落。然后对这些 菌落作进一步的分析。
首先，按Clontech公司的方法使用(3半乳糖苷酶检测法检测/acZ表 达。存在scFv/IL-8相互作用的细胞也会激活整合在菌林基因组中的另一 报告基因/"cZ,从而能测得酵母细胞内表达的卩半乳糖苷酶。检测酵母细 胞卩半乳糖苷酶的方法如下
(1) 上述酵母在筛选培养基(80/-八111^)平板上生长。
(2) 将存活的酵母菌落转移到Whatman五号滤纸上。
(3) 将带有酵母细胞菌落的滤纸浸入液氮之中，使细胞破裂。
(4) 将滤纸从液氮中取出，并置于30。C的烘箱内。
(5) 重复步骤3和4二次。
(6) 将滤纸铺于适量的X-gal溶液中，并置于37。C的温箱内约15分钟。 若带有菌落处显示蓝色，表明为P半乳糖苷酶阳性。
X-gal溶液配方如下
16.1 g/L Na2HP04.7H20 5.50 g/L NaH2P04'H20
0.75 g/L KC1
0.246 g/L MgS04 '7H20
35mg/LX-gal ( 5-溴-4-氯-3-。引咮-P-D-吡喃半乳糖苷)
5mM (3画巯基乙醇
pH7.0
检测结果上述挑选出的27个菌落中有15个是p半乳糖苦酶阳性的， 表明在这些菌落的细胞内另 一报告基因/acZ也被激活了 。
其次，对上述15个p半乳糖苷酶阳性菌落的scFv进行特异性分析， 以确定scFv是否特异性地与IL-8部分结合，而不是与其它部分。将含有 scFv基因的pACT2质粒DNA从上述15个卩半乳糖苷酶阳性的酵母中提 取出来。并分别与pGBKT空载体，或与含有编码融合Gal4-DNA结合区 (BD)和人核纤层蛋白C编码序列的质粒pGBKT-Lam(Clontech公司)， 共同转化到AH109酵母细胞内。转化后的酵母细胞先铺于平板培养基 (SD/丄W)上生长，然后转移到平板培养基(SD/-AHLW)上，并进一步 使用|3半乳糖苷酶分析。
经上述方法对scFv进行特异性分析后，得到5个对人IL-8具有特异 性的单链抗体(scFv)。
最后，对上述5个对人IL-8具有特异性的单链抗体(scFv )进行测序 分析，使用ABI自动测序仪测定scFv的DNA序列。
分析这些单链抗体(scFv)克隆的DNA序列发现有二个不同的抗人 白细胞介素-8的单链抗体(scFv )。其中与克隆号弁IL-8-51相同的有3个， 而与克隆号弁IL-8-41相同的则有2个。
克隆号射L-8-51的单链抗体重链(VH)可变区的氨基酸序列如SEQ NO:l所示，单链抗体重链(VL)可变区的氨基酸序列如SEQNO:2所示； 编码克隆号#正-8-51的单链抗体重链(VH)可变区的DNA序列如SEQ NO:5所示，编码克隆号弁IL-8-51的单链抗体轻《连(VL)可变区的DNA序 列如SEQNO:6所示。
#IL-8-51的单链抗体重链(VH)的氨基酸序列(SEQNO:l)
EWIGSIYHSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNRFSLKLSSVTAADTAVYYC
ARSGDGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPS
下划线部分依次为重链可变区中的三个高变区CDRH1 、 CDRH2和 CDRH3的氨基酸序列。
#IL-8-51的单链抗体轻链(VL)可变区的氨基酸序列(SEQ NO:2 )
FGQGTKVEIK
下划线部分依次为轻链可变区中的三个高变区CDRL1 、 CDRL2和 CDRL3的氨基酸序列。
克隆号#化-8-41的单链抗体重链(VH)可变区的氨基酸序列如SEQ NO:3所示，单链抗体重链(VL)可变区的氨基酸序列如SEQ NO:4所示； 编码克隆号#化-8-41的单链抗体重链(VH)可变区的DNA序列如SEQ NO:7所示，编码单链抗体轻链(VL)可变区的DNA序列如SEQ NO:8所 示。
弁IL-8-41的单链抗体重链(VH)可变区的氨基酸序列(SEQNO:3)
ARSGFCGRSRCOPLYYYYFGMDVWGOGTTVTVSS
下划线部分依次为重链可变区中的三个高变区CDRH1 、 CDRH2和 CDRH3的氨基酸序列。
弁IL-8-41的单链抗体轻链(VL)可变区的氨基酸序列(SEQNO:4)
LSRWVFGGGRTKLTVL
下划线部分依次为轻链可变区中的三个高变区CDRL1 、 CDRL2和 CDRL3的氨基酸序列。
实施例6 抗体表达与纯化
将实施例5中筛选得到的抗人IL-8的单链抗体(scFv ) DNA克隆到 蛋白质表达载体中pET27b(+) (Novagen公司)而得到pET27b-alL-8。克 隆后的pET27b-alL-8在scFv的N端是pe旧序列(可将表达后的scFv蛋 白质分泌到表达细菌五.co//的周质腔(periplasmic space)中)，而C端含 有一段编码HSV标记物和一个6x His (组氨酸)标记物(可用于蛋白质的 纯化)的序列。将pET27b-alL-8转化入蛋白质表达细菌co//菌林BL21 DE3 (Novagen公司)。并按照该公司提供的方法用IPTG (浓度0.5mM) 诱导表达和分离抗人IL-8的单链抗体scFv蛋白质。
因为scFv蛋白质的C端含有一个6x His标记物，我们可以应用Qiagen 公司所提供的方法方便地用Ni-NTA柱(Qiagen公司)来纯化scFv蛋白质。 纯化前后蛋白质用SDS-PAGE凝胶电泳分析。
实施例7酶标免疫法(ELISA)测试抗IL - 8的scFv特性
我们测试了纯化后的抗IL-8单链抗体的特性。第 一个特性是用酶标免
疫法(ELISA)测定抗体与IL-8的免疫亲和。
重组人IL-8的蛋白质购自Pierce公司。用于酶标免疫法(ELISA)的
96-孔板(MaxiSorp板，购自Nunc公司)。方法如下 (1 )上述96-孔板首先用IL-8包被。
(2)包被后的96-孔板再用SuperBlock (购自Pierce/>司)作封闭处理。
(3 )纯化了的抗IL-8单链抗体在0.02% BSA中作系列稀释后加入已 包被有IL國8的96-孔中，与IL画8结合。
(4)将96-孔板清洗后，在96-孔中再加入稀释了 5000倍的鼠抗HSV 标记物的抗体(购自Novagen公司)用来检测结合了的单链抗体(在scFv 的C端含有一个HSV标记物)。
(5 )将96-孔板清洗后，在96-孔中再加入稀释了 10000倍的山羊抗 鼠IgG抗体并偶联有HRP (辣根过氧化物酶)的偶联物(购自Sigma公司)。
(6 )将96-孔板最终清洗后，应用购自Sigma公司的HRP底物TMB 试剂作显色处理。
(7)最后，反应用0.5M的硫酸终止，并检测450nm的吸收光谱。 结果如图3和图4所示，结果说明克隆号WL-8-51与克隆号弁IL-8-41 的二个单链抗体都能有效地结合IL-8。
实施例8测试IL-8单链抗体对IL-8的趋化性
采用微孔小室(改进型的Boyden Chamber)趋化实验测试纯化后的抗
IL-8单链抗体的对IL-8趋化性的抑制作用，实验步骤如下
(l)重组人IL-8的蛋白质(浓度为10 ng/ml)与纯化后的抗IL-8单链抗体 或鼠抗人IL-8抗体(购自Pharmingen公司)或与IL-8不相关的抗p-53单 链抗体混合在培养基中(此三种抗体的浓度为1樣t克/毫升或10《敫克/毫 升)，并置于改进型的Boyden Chamber (购自New Probe公司)的底室。
(2)分离后的嗜中性粒细胞(2x 105细胞)加于改进型的Boyden Chamber的上室。上、下室之间有孔径3.0 |im的聚碳膜相隔。
(3 )加置细胞后的Boyden Chamber在37。C的C02培养箱内保温一小时。
(4 )移动到下室的嗜中性粒细胞在显微镜下作观测。 趋化实验测试结果如图5和图6所示，结果说明克隆号射L-8-51与克 隆号弁IL-8-41的二个单链抗体都能有效地抑制IL-8对细胞的趋化性。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江大学
<120> —种抗白细胞介素-8抗体
<130>
<160> 8
< 170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 123
<212> PRT
<213> 抗体
<400> 1
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser He Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Gly Trp He Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
lie Gly Ser He Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 卯 95
Ala Arg Ser Gly Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120
<210> 2
<211> 107
<212> PRT <213>抗体
<400> 2
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Thr Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Ser Cys Arg Met Ser Gin Gly lie Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu He
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Cys Leu Gin Ser 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Tyr Ser Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105
<210> 3 <211> 129 <212> PRT <213> 抗体
<400> 3
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Asn Val Ser Gly Asp Ser lie Ser Pro Asn
20 25 30
Tyr Tip Thr T卬lie Arg Gin Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie
35 40 45
Gly Tyr lie Phe Tyr Thr Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr lie Ser Leu Asp Thr Ser Gin Asn Gin Val Ser Leu 65 70 75 80
Arg Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Gly Glu Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ser Gly Phe Cys Gly Arg Ser Arg Cys Gin Pro Leu Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Tyr Phe Gly Met Asp Val T卬Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 125
Ser
<210> 4 <211> 112 <212> PRT <213>抗体
<400> 4
Asn Phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 1 5 10 15
Thr Val Thr He Ser Cys Thr Gly Ser Gly Gly Ser He Ala Ser Asn
20 25 30
His Val His Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Thr Val
35 40 45
lie Tyr Glu Asn Asp Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser lie Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr He Ser Arg 65 70 75 80
Leu Lys Ser Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Ser Asp Gly
85 90 95
Leu Ser Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Arg Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110
<210> 5 <211> 369 <212> DNA <213>抗体
<400> 5
caggtgcagc tgcaggagtc cggccc鄉a ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtta ctccatcagc agcggttact actggggctg gatccggcag 120
ccccc鄉ga aggggctgga gtggattggg agtatctatc atagtgggag cacctactac 180
aacccgtccc tcaagagtcg agtcaccata tcagtagaca cgtccaagaa ccggttctcc 240
ctgaagctga gttctgtgac cgccgcggac acggccgtgt attactgtgc gaggtctggg 300
gatgggtttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctcagc ttccaccaag 360 ggcccatct 369<210> 6
<211> 321
<212> DNA
<213> 抗体
<400> 6
gacatccaga tgacccagtc tccatcctta ctctctgcat ctacaggaga cagagtcacc 60
atcagttgtc ggatgagtca gggcattagc agttatttag cctggtatca gcaaaaacca 120
gggaaagccc ctgagctcct gatctatgct gcatccactt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagctg cctgcagtct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tattatagtt tcccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 7
<211> 387
<212> DNA <213>抗体
<400> 7
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtcaagc cttcggaaac cctgtctctc 60 acctgcaatg tctctggtga ctccatcagt cctaattact ggacctggat ccggcaaacc 120
ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atcttttaca ctggaaccac caactacaac 180
ccctccctca agagtcgagt caccatatca ctagacacgt cccagaacca ggtgtccctg 240
aggttgacct ctgtgaccgc tgcggacacg ggcgaatact actgtgcgag atcgggattt 300
tgtggtagat ccagatgtca acccctgtac tattactact tcggtatgga cgtctggggc 360 c肌gggacca cggtcaccgt ctcctca
387
<210> 8
<211> 336
<212> DNA
<213> 抗体
<400> 8
aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60
tcctgcaccg gcagcggtgg cagcattgcc agcaaccatg tgcattggta ccaacagcgc 120
ccgggcagtg cccccaccac tgtgatctat gagaatgacc gcagaccctc tggggtccct 180
gatcgcttct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctaga 240
ctgaagagtg acgacgaggc tgactactac tgtcagtctt ctgatggcct cagtcgttgg 300 gtgttcggcg gagggaggac caagctcacc gtccta 33权利要求
1.一种抗白细胞介素-8抗体，其重链可变区中的3个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别为GDSISPNYWT、YIFYTGTTNYNPSLKS、SGFCGRSRCQPLYYYYFGMDV；其轻链可变区中3个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别为TGSGGSIASNHVH、ENDRRPS、QSSDGLSRW。
2. 根据权利要求1所述的抗白细胞介素-8抗体，其特征在于所述 的重链可变区具有SEQNO.3所述的氨基酸序列；所述的轻链可变区具有 SEQ N0.4所述的氨基酸序列。
3. 根据权利要求1或2所述的抗白细胞介素-8抗体，其特征在于 所述的抗体为单链抗体。
4. 一种编码权利要求1或2所述的抗白细胞介素-8抗体的基因。
5. 根据权利要求1或2所述的抗白细胞介素-8抗体在制备用于治疗 与人白细胞介素-8表达和分泌异常、过量或失控相关的疾病的药物中的 应用。
全文摘要
本发明公开了一种抗白细胞介素-8抗体，其重链可变区中的3个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别为GDSISPNYWT、YIFYTGTTNYNPSLKS、SGFCGRSRCQPLYYYYFGMDV；其轻链可变区中3个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别为TGSGGSIASNHVH、ENDRRPS、QSSDGLSRW。本发明抗白细胞介素-8抗体具有全人源化的特点，特异性高，制备过程相对简单，成本低廉。
文档编号C12N15/13GK101348526SQ20081012064
公开日2009年1月21日 申请日期2008年8月29日 优先权日2008年8月29日
发明者华绍炳 申请人:浙江大学