猪Sirtl小干扰RNA表达载体的构建方法及用途的制作方法

专利名称：：猪Sirtl小干扰RNA表达载体的构建方法及用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种猪Sirtl(pSirtl)基因小干扰RNA(siRNA)表达载体的构建方法及用途，属于生物和现代农业
技术领域：
的应用技术。
背景技术：
：Sirtl是酵母染色质沉默因子Sir2的哺乳动物同源体，是一种依赖于烟碱腺嘌呤二核苷酸的组蛋白脱乙酰酶。Sirtl是一种核蛋白，它具有多种生物学功能，它不仅是一个重要的与机体长寿有关的因子，而且可能在动物脂肪沉积和肌肉发育中起着关键的调控作用。因此，开展Sirtl在动物脂肪代谢和肌肉发育中的功能研究具有重要的意义。猪Sirtl(pSirtl)全长cDNA序列4024bp，GenBank登录号EU030283，编码区2226bp,编码742个氨基酸，蛋白分子量80.9kDa，含有Sirtl蛋白家族的保守核心结构域；BLAST结果表明，pSirtl氨基酸序列与人、狗、牛、鼠同源性分别达到87%，92%，91%和82%。RNA干扰(RNAi)技术作为一种新的基因阻断技术，具有低成本、高效性、高特异性以及可传递性等特点，能特异、高效地抑制特定基因的表达，已经成为研究基因功能的一种有力工具。由于干扰载体/^7ewcw4.7-CMVneo可以方便用于目的基因siRNA表达载体的构建，从而可以特异性的使特定目的基因沉默，功能丧失，因此干扰载体/7&7e"c^4.7-CMVneo可以作为一种强有力的研究工具，用于功能基因组的研究。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种猪Sirtl小干扰RNA表达载体的构建方法，以及该小干扰RNA表达载体的用途。为了解决上述技术问题，本发明提供一种猪Sirtl小干扰RNA表达载体的构建方法，包括以下步骤1)、通过RACE技术克隆得至UpSirtl全长cDNA序列；2)、根据载体的信息和靶序列设计并合成4对含9个核苷酸的loop环的siRNA引物，该9个核苷酸为TTCAAGAGA;3)、RNAi表达载体的构建siRNA引物退火后与双酶切的RNAi载体连接转化，得到RNAi表达载体的重组质粒。作为本发明的猪Sirtl小干扰RNA表达载体的构建方法的改进，步骤2)为根据步骤1)所得的pSirrtl全长基因序列，筛选并设计4对siRNA引物；该4对siRNA引物分别为引物I:引物II:引物m:引物IV:作为本发明的猪Sirtl小干扰RNA表达载体的构建方法的进一步改进，步骤3)为将i^7e"cer4.7-CMVneo质粒进行Sam//1和历"dIII双酶切后，与siRNA弓|物退火后得到的DNA片段连接，采用热激转化大肠杆菌。作为本发明的猪Sirtl小干扰RNA表达载体的构建方法的进一步改进，步骤l)为设计并合成pSirtl的特异性引物PlP4，利用3'-RACE、5-RACE技术和pSirtl的特异性引物P1P4，克隆得到猪3'和5'端序列并对序列进行测序鉴定；将Sirtl的5'和3'序列拼接得到pSirtl全长cDNA序列，将pSirtl全长cDNA序列登录到GenBank，利用NCBI上的BLAST工具对pSirtl碱基序列和氨基酸序列进行比对；特异性引物P1P4是Pl:5'-GTTAGGAGGTGAATATGCCAAG-3';P2:5'-CACGAACACAAAAAGAGTTGGC-3';P3:5'-AACTGGCATGTGAGGCTCTATC-3';P4:5'-CAGAAGGTTATCTCGGTACCCA-3'。作为本发明的猪Sirtl小干扰RNA表达载体的构建方法的进一步改进，将步骤3)所得的RNAi表达载体进行鉴定通过抗生素筛选，将阳性克隆采用PCR和测序鉴定；PCR反应的引物为特异性上游引物和RNAi干扰载体的本身引物5'-AGGCGATTAAGTTGGGTA-3';测序引物为5'-AGGCGATTAAGTTGGGTA-3'。本发明还同时提供了按照上述方法所得的猪Sirtl小干扰RNA表达载体的用途用于研究pSirtl基因对脂肪代谢产生的影响。作为本发明的猪Sirtl小干扰RNA表达载体的用途的改进，包括以下步骤(1)、将含pSirtl的siRNA表达载体的大肠杆菌扩培后，提取高纯转染级质粒；(2)、将含pSirtl的siRNA表达载体的高纯转染级质粒转染猪脂肪细胞等细胞，37°C，5X的C02中保温46h后更换不含抗生素的培养基；(3)、转染48h后，分析siRNA表达载体对pSirtl及脂肪代谢关键功能基因ATGL、HSL、PPARy等表达的影响，研究Sirtl的功能。本发明的猪Sirtl小干扰RNA表达载体的构建方法及其用途，具有以下有益效果本发明通过RACE技术克隆得到pSirtl全长cDNA序歹U，然后根据i^7ewcwneo载体信息和靶序列设计并合成4对siRNA引物，siRNA引物经退火后与双酶切的p&7e加wneo载体连接转化大肠杆菌DH5a，构建得到RNAi表达载体的重组质粒，经筛选和条件优化后，构建好的RNAi表达载体对pSirtl具有较好的干扰效果。本发明是利用RNAi技术，开拓了目前研究猪脂肪代谢调控和基因功能研究的新思路。此法所用的RNAi表达载体p&7eMcer4.7-CMVneovector方便易得，载体构建方法简单、可行，同时构建的RNAi表达载体能够特异、高效地抑制pSirtl基因的表达，是研究pSirtl功能的一种强有力的研究技术，为开展pSirtl在猪脂肪代谢和肌肉发育中的功能研究具有重要的意义。下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。图1是siRNA弓1物退火后电泳检测图中M---DNAmarker，l-隱隱RSl，2—RS2，3---RS3，4—RS4，5—Control;图2是消化pSilencer4.1-CMV后的电泳检测图中M—-DNAmarker，1—-质粒，2—质粒，3—双酶切质粒；图3是PCR产物检电泳测图中M---DNAmarker;RS1~RS4—阳性克隆PCR产物电泳结果；图4是各干扰载体对pSirtlmRNA表达的影响(不同小写字母表示P<0.05;不同大写字母表示P〈0.01);图5是pSirtl-siRNA对pSirtlmRNA表达的影响图6是pSirtl-siRNA(RS3)对pSirtlmRNA表达的影响图；(不同字母表示P<0.01)图7是pSirtl-siRNA(RS3)对pSirtl蛋白表达的影响图8是Sirtl-siRNA(RS3)对基因表达的影响图(不同字母表示P<0.01);图9是RES和pSirtl-siRNA对pSirtl基因表达的影响图(不同小写字母表示P<0.05;不同大写字母表示P〈0.01);图10是细胞免疫荧光分析RES和pSirtl-siRNA(RS3)对pSirtl蛋白表达的影响图；图11是RES和pSirtl-siRNA对脂肪代谢关键功能基因表达的影响图(不同小写字母表示P〈0.05;不同大写字母表示P〈0.01)。具体实施例方式(一)、猪Sirtl(pSirtl)基因全长cDNA克隆及序列分析1、根据GenBank上登录的pSirtl的部分序列设计并合成Sirtl3'-RACE和5'-RACE的特异性引物PI:5'-GTTAGGAGGTGAATATGCCAAG-3'(SEQIDNO:1)P2-5'-CACGAACACAAAAAGAGTTGGC-3'(SEQIDNO:2)P3:5'-AACTGGCATGTGAGGCTCTATC國3'(SEQIDNO:3)P4:5'-CAGAAGGTTATCTCGGTACCCA-3'(SEQIDNO:4)2、基因组总RNA提取利用TrizolReagent提取猪的基因组总RNA，并采用1%琼脂糖凝胶电泳对RNA质量进行检测。3、猪Sirtl基因全长cDNA克隆及序列分析利用3'-RACE、5-RACE技术和上述pSirtl的特异性引物，克隆得到猪3'和5'端序列并对序列进行测序鉴定。将Sirtl的5'和3'序列拼接得到pSirtl全长cDNA序列，将pSirtl全长cDNA序列登录到GenBank(EU030283)，利用NCBI上的BLAST工具对pSirtl碱基序列和氨基酸序列进行比对。结果如下通过RACE技术克隆得到pSirtl全长cDNA序列4024bp，GenBank登录号EU030283，编码区2226bp，编码742个氨基酸，蛋白分子量80.9kDa，含有Sirtl蛋白家族的保守核心结构域；BLAST结果表明，pSirtl氨基酸序列序列与人、狗、牛、鼠同源性分别达到87%，92%，91%和82%。(二)、pSirtl的siRNA表达载体的构建与鉴定I、靶序列选择根据(一)得到的pSirtl全长基因序列，遵循Tuschl规则和Cenix规则设计并筛选pSirtl的siRNA靶序列RS1:5'-AAATCGTCACCAATGGTTTCC-3'RS2:5'-AATTCCTCCACCTGAATTGGA-3'RS3:5'陽AAGAGATGGCATTTATGCACG-3'RS4:5'-AATCCAGAGGATAATCCAGTG-3'选择9个核苷酸的loop环"TTCAAGAGA"，根据载体的信息和靶序列设计并合成siRNA引物。合成引物的结构顺序为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>所得的4对shRNA引物分别为引物I(SEQIDNO:9禾BSEQIDNO:10)AS:引物II(SEQIDNO:ll和SEQIDNO:12)AS:引物III(SEQIDNO:13和SEQIDNO:14)AS:引物IV(SEQIDNO:15和SEQIDNO:16)AS:2、引物退火将合成好的引物稀释至100pmol/pL，取正反义链引物各4pL、10X退火缓冲液4^L和无酶水28pL，进行退火，退火条件为100°C水浴20min，自然冷却至室温。然后琼脂糖凝胶电泳检测退火反应结果。引物退火结果如图l所示，表明退火成功。3、将含有/&7e"cer4.7-CMV质粒的大肠杆菌接种到LB培养基中，培养过夜，然后利用小批量提取上述质粒，再将质粒进行BamHI和HindIII双酶切，反应条件为37°C水浴16h或酶切过夜，然后琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，并割胶回收线性化的载体。质粒提取及双酶切结果如图2所示，表明双酶切成功。4、插入片段(步骤2所得的退火产物)和载体片段(步骤3双酶切后的载体)用T4DNA连接酶4'C连接过夜，连接产物转化DH5oi感受态细胞，37'C培养过夜。得到RNAi表达载体的重组质粒。5、经抗性初步筛选后，挑取白色单菌落接种于3ml液体LB培养基中(含Amp100ng/ml)，37'C振荡培养12h，进行PCR和克隆测序鉴定。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>PCR反应条件为(1)94。C预变性4min;(2)94。C变性45sec，58°C45sec，72°C55sec，共35个循环；(3)72°C7min，4。C保存。阳性克隆菌液PCR鉴定结果表明，用鉴定引物CMV-F和特异性pSirtl引物PCR扩增的片段大小为187bp，与本实验预期结果相符，确定为阳性克隆(图3)。CMV-F是RNA千扰载体pSilencer4.1-CMV中的鉴定引物，是根据载体序列设计合成的。阳性克隆测序及序列比对鉴定结果表明，与插入的序列完全一致，证明pSirtl的siRNA表达质粒构建成功。这为进一步研究pSirtl基因的功能及调控脂肪代谢的作用途径打下基础，也为通过RNAi技术研究动物脂肪沉积奠定基础。(三)、有效siRNA筛选1、利用Lipofectamine2000介导将第(二)步构建筛选得到的猪Sirtl的重组干扰载体及无关序列(阴性对照)和空白对照分别转染猪脂肪细胞。转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为70%~90%，培养基中含10%胎牛血清，不含抗生素；对于每孔细胞，使用50^无血清培养基(OPTI-MEMI培养基)稀释3昭DNA;对于每孔细胞，使用50nlOPTI-MEMI培养基稀释10piLipofectamine2000试剂。Lipofectamine2000稀释后，在30min内同稀释的DNA混合(保温时间过长会降低活性)；混合稀释的DNA和稀释的Lipofectamine2000，在室温保温20min(复合物可以在室温保持6h稳定);直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀，每处理重复三次。如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板，在加入复合物前移去生长培养基，替换无血清培养基；在37"，5X的C02中保温46h后更换不含抗生素的完全培养基；在细胞中加入复合物1848h后，分析检测干扰效果。2、干扰效果检测转染48h后，用TrizolReagent提取细胞中总RNA，采用Real-time定量PCR方法检测猪Sirtl基因表达水平。结果为pSirtl干扰载体(pSirtl-siRNA)筛选转染pSirtl-siRNA(RS1，RS2，RS3，RS4)48h后，荧光定量PCR检测结果显示，与对照相比，阴性对照组pSirtl基因的表达没有明显的变化；RS2转染组、RS3转染组和RS4转染组的pSirtl基因mRNA水平分别降低19.16%(PO.Ol)、30.00%(PO.01)和19.66%(P〈0.01);其中，RS3抑制效果最好，与RS2转染组相比pSirtl基因mRNA水平降低了10.84%(P<0.05)，与RS4转染组相比pSirtl基因mRNA水平降低了10.35%(PO.05)(图4)。(四)、干扰条件优化对筛选出的抑制效果最好的siRNA的质粒DNA和脂质体Lipofectamine2000的量进行优化，对六孔板细胞量，本实验中设定的质粒DNA(吗)和Lipofectamine2000(pL)的量为2:4，2:6，2:8，2:10;3:4，3:6，3:8，3:10;4:8，4:10，4:12;以上单位均指pg/^iL。不同质粒DNA和脂质体浓度及比例对pSirtl表达的影响。将筛选出的有效的pSirtl-siRNA表达载体RS3的质粒和脂质体Lipofectamine2000按照不同的浓度和不同的比例进行干扰条件优化，结果表明，DNA3pg和Liposome10pL时转染RS3对pSirtl基因表达的抑制效果最好，抑制率可以达到70%左右(图5)。本研究筛选出了能够有效干扰猪Sirtl基因表达的siRNA干扰载体，并对干扰条件进行了优化，这将为进一步探讨猪Sirtl基因在猪脂肪代谢和脂肪沉积中的功能奠定实验基础。(五)、pSirtl-siRNA(RS3)对目的基因mRNA表达的影响选取第(三)步筛选得到抑制效果最好的RS3的siRNA表达载体，按照第(四)步的优化的反应体系，检测其对目的基因mRNA表达的抑制作用。将猪脂肪细胞传代培养24h后，使其在转染日密度达70-95%进行处理。转染条件按优化时抑制效果最佳的比例的进行转染，实验分成三个组对照组(Control),转染空载体，pSirtl-siRNA组，转染有效重组干扰载体RS3;阴性对照组(Neg.-control)转染/&7ewc"4J-CMVneoNegativeControl,每个处理三个重复。转染48h后收集脂肪细胞，Real-time定量PCR检测pSirtl基因mRNA表达水平。结果如图6所示转染pSirtl-siRNA(RS3)48h后，猪脂肪细胞中pSirtl基因表达显著低于对照组和阴性对照组，与对照组相比，pSirtl-siRNA组pSirtl基因mRNA水平下降49.70%(PO.01);阴性对照组与对照组之间差异不显著。(六)、pSirtl-siRNA(RS3)对目的基因蛋白表达的影响选取第(三)步筛选得到抑制效果最好的RS3的siRNA表达载体，按照第(四)步的优化的反应体系，检测其对目的基因蛋白表达的抑制作用。将猪脂肪细胞传代培养24h后，使其在转染日密度达70-95%进行处理。转染条件按优化时抑制效果最佳的比例的进行转染，实验分成三个组对照组(Control),转染空载体，pSirtl-siRNA组，转染有效重组干扰载体RS3;阴性对照组(Neg,control)转染；Si/e"cerneoNegativeControl,每个处理三个重复。转染48h后共聚焦免疫荧光检测pSirtl基因蛋白表达情况。结果如图7所示转染pSirtl-siRNA(RS3)48h后猪脂肪细胞中pSirtl基因的蛋白表达水平免疫荧光检测结果见图7。结果表明，pSirtl主要表达在脂肪细胞的核和或浆内，阳性呈明显的黄绿色；与对照组相比，pSirtl-siRNA组降低了pSirtl的蛋白水平。(七)、pSirtl-siRNA(RS3)对脂肪代谢关键功能基因表达的影响选取第(三)步筛选得到抑制效果最好的RS3的siRNA表达载体，按照第(四)步的优化的反应体系，检测其对目的基因蛋白表达的抑制作用。将猪脂肪细胞传代培养24h后，使其在转染日密度达70-95%进行处理。转染条件按优化时抑制效果最佳的比例的进行转染，实验分成三个组对照组(Control),转染空载体，pSirtl-siRNA组，转染有效重组干扰载体RS3;阴性对照组(Neg,control)转染；5V/e"cw￥J-CMVneoNegativeControl,每个处理三个重复。Real-time定量PCR检测脂肪代谢关键功能基因PPARy、ATGL和HSL的mRNA表达情况。结果如下转染pSirtl-siRNA(RS3)48h后，猪脂肪细胞中其它各基因的mRNA表达水平见图8。结果表明，pSirtl-siRNA组猪脂肪细胞中pATGL和HSL基因表达显著低于对照组和阴性对照组(PO.Ol)，PPARY的mRNA水平显著高于对照组和阴性对照组(P<0.01)。与对照组相比，pSirtl-si画A组pATGL和HSLmRNA水平分别降低了29.54%(PO.Ol)和9.05%(P〈0.01);PPARy基因的mRNA水平分别提高了61.65%(PO.01)(图8)。(八)、Sirtl功能及其对脂肪代谢的影响将猪脂肪细胞传代培养24h后，使其在转染日密度达70-95%进行处理。试验分成4个处理组对照组(Control),转染空载体；RES(Sirtl激动剂)组，DMEM/F12培养基+50|imol/LRES;pSirtl-siRNA组，脂肪细胞转染有效的重组干扰载体RS3;RES+pSirtl-siRNA组，DMEM/F12培养基+50阿ol/LRES，并转染pSirtl-siRNA,每个处理三个重复。转染48h后收集脂肪细胞，检测对pSirtl基因mRNA水平和蛋白水平的影响，并进一步探讨对脂肪代谢关键功能基因PPARy、ATGL和HSL基因mRNA表达的影响。结果如下RES50与pSirtl-siRNA协同作用对pSirtl基因表达的影响结果表明，与对照组相比，RES处理组能显著提高pSirtl基因的表达(48.34%，P<0.01)，pSirtl-siRNA处理组显著降低pSirtl基因的表达(32.13%，P<0.05)，RES+pSirtl-siRNA处理组对pSirtl基因的表达影响不显著(P>0.05);与RES处理组相比，RES+pSirtl-siRNA处理组降低pSirtl基因的表达(28.48%,PO.01);与pSirtl-siRNA处理组相比，RES+pSirtl-siRNA处理组提高了pSirtl基因的表达(56.31%，PO.05)(图9)。免疫荧光检测结果表明，RES处理组能提高pSirtl蛋白水平，pSirtl-siRNA组能降低pSirtl蛋白水平，RES+pSirtl-siRNA处理组pSirtl蛋白水平也较对照组和RES组低(图10)。RES50与pSirtl-siRNA协同作用对脂肪代谢关键功能基因表达的影响与对照组相比，RES处理组能显著提高ATGL(17.41%，P<0.01)禾BHSL(93.40%，PO.01)基因的表达，pSirtl-siRNA处理组显著降低ATGL(35.04%，P<0.01)和HSL(28.20%，P>0.05)基因的表达；与RES处理组相比，RES+pSirtl-siRNA处理组降低pATGL(9.00%,P>0.05)和HSL28.07%，P<0.05)基因的表达；与pSirtl-siRNA处理组相比，RES+pSirtl-siRNA处理组提高了ATGL(64.51%，PO.01)和HSL(93.75%,PO.01)基因的表达(图11)。与对照组相比，pSirtl-siRNA组和RES+pSirtl-siRNA组使PPARy基因表达显著提高了304.85%(PO.01)和127.19%(PO.01);与RES处理组相比，RES+pSirtl-siRNA处理组的PPARY基因表达提高了211.52%(P<0.01);与pSirtl-siRNA处理组相比，RES+pSirtl-siRNA处理组PPARy基因表达降低了43.85%(PO.01)(图11)。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。序列表SEQIDNO:1gttaggaggtgaatatgccaag22SEQIDNO:2cacgaacacaaaaagagttggc22SEQIDNO:3aactggcatgtgaggctctatc22SEQIDNO:4cagaaggttatetcggtaccca22SEQIDNO:5aaatcgtcaccaatggtttcc21SEQIDNO:6aattcctccacctgaattgga21SEQIDNO:7aagagatggcatttatgcacg21SEQIDNO:8aatccagaggataatccagtg21SEQIDNO:9gatccatcgtcaccaatggtttccttcaagagaggaaaccattggtgacgattta55SEQIDNO:10agcttaaatcgtcaccaatggtttcctctcttgaaggaaaccattggtgacgatg55SEQIDNO:11gatccttcctccacctgaattggattcaagagatccaattcaggtggaggaatta55SEQIDNO:12agcttaattcctccacctgaattggatctcttgaatccaattcaggtggaggaag55SEQIDNO:13gatccgagatggcatttatgcacgttcaagagacgtgcataaatgccatctcttaSEqiDNO:14agcttaagagatggcatttatgcacgtctcttgaacgtgcataaatgccatctcgSEQIDNO:15gatcctccagaggataatccagtgttcaagagacactggattatcctctggattaSEQIDNO:16agcttaatccagaggataatccagtgtctcttgaacactggattatcctctggag权利要求1、一种猪Sirt1小干扰RNA表达载体的构建方法，其特征是包括以下步骤1)、通过RACE技术克隆得到pSirt1全长cDNA序列；2)、根据载体的信息和靶序列设计并合成4对含9个核苷酸的loop环的siRNA引物，所述9个核苷酸为TTCAAGAGA；3)、RNAi表达载体的构建siRNA引物退火后与双酶切的RNAi载体连接转化，得到RNAi表达载体的重组质粒。2、根据权利要求l所述的猪Sirtl小干扰RNA表达载体的构建方法，其特征是所述步骤2)为根据步骤1)所得的pSirrtl全长基因序列，筛选并设计4对siRNA引物；所述4对siRNA引物分别为引物I:引物n:引物III:引物IV-3、根据权利要求2所述的猪Sirtl小干扰RNA表达载体的构建方法，其特征是所述步骤3)为将；Sz7e"cer4.J-CMVneo质粒进行5aw//1和历wdIII双酶切后，与siRNA弓|物退火后得到的DNA片段连接，采用热激转化大肠杆菌。4、根据权利要求3所述的猪Sirtl小干扰RNA表达载体的构建方法，其特征是所述步骤l)为设计并合成pSirtl的特异性引物PlP4，利用3'-RACE、5-RACE技术和pSirtl的特异性引物P1P4，克隆得到猪3'和5'端序列并对序列进行测序鉴定；将Sirtl的5'和3'序列拼接得到pSirtl全长cDNA序列，将pSirtl全长cDNA序列登录到GenBank，利用NCBI上的BLAST工具对pSirtl碱基序列和氨基酸序列进行比对；所述特异性引物P1P4是Pl:5'-GTTAGGAGGTGAATATGCCAAG-3';P2:5'-CACGAACACAAAAAGAGTTGGC-3';P3:5'隱AACTGGCATGTGAGGCTCTATC-3';P4:5'-CAGAAGGTTATCTCGGTACCCA-3'。5、根据权利要求14中任意一种猪Sirtl小干扰RNA表达载体的构建方法，其特征是将步骤3)所得的RNAi表达载体进行鉴定通过抗生素筛选，将阳性克隆采用PCR和测序鉴定；PCR反应的引物为特异性上游引物和RNAi干扰载体的本身引物5'-AGGCGATTAAGTTGGGTA-3';测序引物为5'-AGGCGATTAAGTTGGGTA-3'。6、如权利要求l5中任意一种方法所得的猪Sirtl小干扰RNA表达载体的用途，其特征是用于研究pSirtl基因对脂肪代谢产生的影响。7、根据权利要求6所述的猪Sirtl小干扰RNA表达载体的用途，其特征是包括以下步骤(1)、将含pSirtl的siRNA表达载体的大肠杆菌扩培后，提取高纯转染级质粒；(2)、将含pSirtl的siRNA表达载体的高纯转染级质粒转染猪脂肪细胞等细胞，37°C，5%的C02中保温4~6h后更换不含抗生素的培养基；(3)、转染48h后，分析siRNA表达载体对pSirtl及脂肪代谢关键功能基因ATGL、HSL、PPARY等表达的影响，研究Sirtl的功能。全文摘要本发明公开了一种猪Sirt1小干扰RNA表达载体的构建方法，包括以下步骤1)通过RACE技术克隆得到pSirt1全长cDNA序列；2)根据载体的信息和靶序列设计并合成4对含9个核苷酸的loop环的siRNA引物，所述9个核苷酸为TTCAAGAGA；3)RNAi表达载体的构建siRNA引物退火后与双酶切的RNAi载体连接转化，得到RNAi表达载体的重组质粒。本发明还公开了上述猪Sirt1小干扰RNA表达载体的用途用于研究pSirt1基因对脂肪代谢产生的影响。文档编号C12N15/63GK101353657SQ20081012073公开日2009年1月28日申请日期2008年9月2日优先权日2008年9月2日发明者婷伍,单体中,汪以真,佳郭,韩菲菲申请人:浙江大学