专利名称：香菇L03、Cr02或沪农1号的分子特异性标记引物及检测方法
技术领域：
本发明涉及香菇L03、 Cr02或沪农1号菌种的分子特异性标记引物， 以及利用该引物对香菇L03、 Cr02或沪农1号菌种进行鉴别和冲全测的方 法。
(二)
背景技术：
香蒜丄ew""w/a ^fo^fes因其美p未和具有重要的食、药用^介值而倍受国 内外消费者的喜爱，是我国商业化生产规模最大和世界上产量仅次于双孢 蘑菇的食用菌。但长期以来，由于我国食用菌菌种鉴定与检测技术研究的 落后和菌种行政管理机构与法规的不健全，无法适应近十几年来代料香蒜 生产的迅猛发展，香菇主产地菌种生产、销售极为混乱，"异种同名、同 种异名"现象普遍存在，假种、劣种充斥市场，已极大地损害了香菇育种 者和生产者的利益。我国是世界人工栽培香菇的发源地和香菇产量最大的 国家，有着丰富的香菇种质资源，随着日本《种苗修正案》的出台，建立 起一套香菇菌种的快速鉴定检测技术势在必行,这不仅有利于我国香菇种 质资源的发掘与利用，更好地为选育具有我国自主知识产权的优良香菇品 种服务，而且也是规范现阶段混乱的香菇菌种市场的迫切需要。
传统的香菇菌种鉴别以子实体形态、生长特性以及生理生化反应特征 为依据，但由于易受环境因素和生理状况的影响，对形态差异较小的种间 及种内菌抹难以鉴别，而且很难在短时间内对处于菌丝体状态的菌种进行 鉴定和检测。分子生物学技术的快速发展，特别是分子标记技术的建立与 成熟，为发展简便、快速、准确的菌种鉴定技术提供了有效手段。SCAR
(Sequence CharacterizedAmplified Region,特4正性片#爻扩增区;或)标i己是 1993年由Paran和Michelmore在RAPD基础上l是出的，它基于对特异 RAPD片段的测序，根据两端序列设计一对18-24碱基的引物，在较高的 退火温度下进行特异扩增实现的，其专一性引物的釆用排除了随机引物结 合位点之间的竟争，因而它是一种十分稳定的分子标记，在应用上具有迅 速、简便、低成本的特点。
发明内容
本发明目的提供香菇L03、 Cr02或沪农1号菌种的分子特异性标记 引物，以及一种能对香菇L03、 Cr02或沪农1号菌种进行快速鉴定的方 法。
本发明采用的技术方案是
香菇L03、 Cr02或沪农1号菌种的分子特异性标记引物，所述引物 序列为
上游引物5'-ATCCGAAGCTCTTCAGTAAAC國3'; 下游引物5'-TGCCGAAGTATATCAAG-3'。
该引物对是采用PCR技术，经过大量筛选试验，采用RAPD标记为 引物获得香菇L03、 Cr02和沪农l号菌种的特异性DNA片段，将该片段 克隆测序，以得到DNA序列为基础，所设计的特异性扩增引物，以该引 物对香菇L03、 Cr02或沪农1号菌种进行PCR扩增，均可获得493bp大 小的特异性片段。
本发明还涉及对香菇L03、 Cr02或沪农1号菌种进行鉴定和;险测的 方法，所述方法为提取待测香菇菌种基因组DNA作为模板，以所述分 子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳 检测，若电泳结果出现493bp的DNA条带，则待测菌种为香菇L03、 Cr02或沪农1号菌种中的一种；所述分子特异性标记引物序列为 上游引物5'-ATCCGAAGCTCTTCAGTAAAC陽3' 下游引物5'-TGCCGAAGTATATCAAG-3'。
所述方法关键在于扩增引物的选择，DNA提取、PCR反应体系及反 应条件确定，以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。 优选的，本发明所述PCR反应体系组成如下 PCR Buffer 终浓度为1 x
lmmol/L 2.5mmol/L
2.5U 各1.25 jaM 60ng
dNTPs MgCl2 Taq DNA酶 上、下游引物 模板DNA 余量为ddH20; PCR反应条件如下
94。C预变性6min后；92。C变性40s， 52。C退火40s, 72。C延伸2min，
共30个循环；最后于72。C补平7min,终止温度为4°C。
PCR Buffer终浓度为1 x ，是指PCR Buffer中各组分在反应体系中的浓
度与lxpCR Buffer相同，通常选用体积为反应体系体积1/10的10 x PCR
Buffer。 10xPCR Buffer成分为100 mM Tris-HCl (pH8.5 ) 、 500 mM KC1、
25 mM MgCl2和1.0% Triton-X-lOO，溶剂为ddH20。
具体的，本发明所述方法如下
(1)取待测香菇菌种，接种至PDA斜面，25。C培养14d,转接至PD 液体培养基中，25。C下振荡培养14d，收集菌丝，以SDS-CTAB
法提取待测香菇菌种基因组DNA;
(2) 以步骤(1 )提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标 记引物作为扩增引物，进行PCR扩增
PCR反应体系每20 ju L组成如下 10 xPCR Buffer 2jaL 10mmol/LdNTPs 2juL 25mmol/L MgCl2 2 |a L
5U/ ju L Taq DNA酶 0.5 ju L 25 juM上、下游引物 各1 uL 20ng/ ju L模板DNA 3 ju L
ddH20补足至20 |u L; PCR反应条件如下
94。C预变性6min后；92。C变性40s, 52。C退火40s, 72。C延伸2min, 共30个循环；最后于72。C补平7min,终止温度为4°C;
(3) 取步骤(2)扩增产物5juL,与1 laL0.25。/。溴酚兰緩冲液混匀， 点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于1 x TAB緩冲液中、5V/cm电 压下电泳，电泳结束后EB染色，通常在含0.5|xg/ml EB的水溶 液中染色30分钟，再于自动凝胶图像分析仪上照相，若电泳结 果出现493bp的DNA条带，则待测菌种为香菇L03、 Cr02或沪 农1号菌种中的一种。
本发明有益效果主要体现在本发明检测方法与常规形态学检测、拮 抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高的优点，为进一步的 检测作好了准备；本发明方法检测所需时间只要1~3天，而常规的拮抗 试验所需要的时间至少两周时间，出菇试验则需要至少3个月的时间。
(四)
图l为对香菇菌种进行PCR扩增的结果；M为DNA分子量标准；C为 阴性对照；箭头所指为从编号为12、 17、 20的香菇L03、 Cr02和沪农1 号菌种扩增出的分子量为493bp的特殊DNA条带；其余编号为其它常用 的香菇生产菌种。
(五)
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此
实施例1:
(1 )菌丝培养和基因组DNA的提取将低温保藏的香菇菌种转接 到PDA斜面(PDA斜面培养基取去皮马铃薯200克，切成小块，加水 1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液加水补足至1000毫升， 加葡萄糖20克，琼脂15克，溶化后分装，12rC灭菌30分钟，冷却得斜 面)上，25。C下培养。14d后接到100mlPD液体培养基(PD液体培养基 取去皮马铃薯200克，切成小块，加水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃 薯块，将滤液加水补足至1000毫升，加葡萄糖20克，121。C灭菌30分钟， 冷却即得PD液体培养基)中，25。C下100r/min振荡培养14d,收集菌丝， 放入-20。C冰箱保藏备用。基因组DNA的提取采用SDS-CTAB法，并使 用DNA纯化试剂盒(杭州博日科技有限公司)对提取的DNA进行纯化。 纯化的基因组DNA先用1.5%的琼脂糖凝胶电泳定性;险测，再用 DNA/RNA紫外分光光度计定量检测。DNA提取物于-20。C冰箱贮藏备用。
(2)设计特异PCR扩增引物，引物对的序列为5'-ATCCG AAGCTCTTCAGTAAAC-3'和5'-TGCCGAAGTATATCAAG画3',由上海生
物工程技术有限公司合成。
(3 ) SCAR分子标记的PCR扩增10xPCRBuffer2pl， 10mmol/L dNTPs2pl， 25mmol/LMgCl22pl, 5U/(il Taq DNA酶0.5jJ, 25mM特异引 物对各lpl， 20ng/)il模板DNA3(al， ddH20补足至20jal。扩增反应在TC-XP 型扩增仪上进行。94。C预变性6min后；92""C变性40s， 54.5。C退火40s, 72°C 延伸2min,共30个循环；最后于72。C补平7min,终止温度为4。C。
(4)电泳才企测取步骤(3) PCR扩增产物5ul，与lul 0.25%溴酚 兰緩冲液混匀，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于lxTAB緩冲液中，5V/cm 电压下电泳，电泳结束后，在含0.5吗/ml EB的水溶液中染色30分钟， 然后在培清JS-380A自动凝胶图像分析仪上照相。
按照上述方法，分别对多种香菇菌种(编号1 23代表香菇菌种依次 为1:申香2号；2:申香4号3:申香6号；4:申香9号；5:申香7 号；6:申香8号；7:申香10号；8:申香12; 9:苏香；10:武香；11: L26; 12: L03; 13: L66; 14: 241; 15: 241-4; 16:庆牙牛20; 17: Cr02; 18: Cr04; 19:闽丰1号；20:沪农1号；21:浙香939-9; 22:浙香939-6; 23:香九)进行检测，以无菌水为阴性对照，电泳结果见图1。其中编号 为12、 17、 20分别为香菇L03、 Cr02和沪农l号菌种，均扩增出分子量 为394bp的特殊DNA条带，其余编号为其他常用的香菇生产菌种，未见 有394bp的特殊DNA条带产生。 序列表—ST25
SEQUENCE LISTING <110>浙江省林业科学研究院
<120〉香菇L03、 Cr02或沪农l号的分子特异性标记引物及检测方法
<130>
<160〉 2
〈170> Patentln version 3.4
<210〉 1
<211> 21
〈212> 腿
<213〉 Unknown
<220〉
<223>人工序列 <400> 1
atccgaagct cttcagtaaa c 21
<210〉 2
<211〉 17
〈212〉 醒
〈213> Unknown
<220〉
<223〉人工序列
<400> 2
tgccgaagta tatcaag 1权利要求
1.香菇L03、Cr02或沪农1号菌种的分子特异性标记引物，所述引物序列为上游引物5′-ATCCGAAGCTCTTCAGTAAAC-3′；下游引物5′-TGCCGAAGTATATCAAG-3′。
2. —种用权利要求1所述的分子特异性标记引物对香菇L03、 Cr02或沪 农1号菌种进行鉴定和检测的方法，所述方法为提取待测香菇菌种 基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进 行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现493bp的DNA 条带，则待测菌种为香菇L03、 Cr02或沪农1号菌种中的一种；所述 分子特异性标记引物序列为上游引物5'-ATCCGAAGCTCTTCAGTAAAC-3' 上游引物5'-TGCCGAAGTATATCAAG-3'。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR反应体系组成如下 PCR Buffer 终浓度为1 xdNTPs lmmol/L MgCl2 2.5mmol/L TaqDNA酶 2.5U 上、下游引物 各1.25iuM 模板DNA 60ng 余量为ddH20; PCR反应条件如下94。C预变性6min后；92。C变性40s， 52。C退火40s， 72。C延伸2min,共30个循环；最后于72。C补平7min,终止温度为4°C。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法如下(1) 取待测香菇菌种，接种至PDA斜面，25。C培养14d,转接至PD 液体培养基中，25。C下振荡培养14d，收集菌丝，以SDS-CTAB 法提取待测香菇菌种基因组DNA;(2) 以步骤(1 )提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记 引物作为扩增引物，进行PCR扩增PCR反应体系每20 ju L组成如下 10 xPCR Buffer 2jiL 10mmol/LdNTPs 2|iiL 25mmol/L MgCl2 2 |u L5U/ Ji L Taq DNA酶 0.5 n L 25juM上、下游引物 各liaL 20ng/ ja L模板DNA 3 ja LddH20补足至20 |u L; PCR反应条件如下94。C预变性6min后；92。C变性40s, 52。C退火40s， 72。C延伸2min， 共30个循环；最后于72。C补平7min,终止温度为4°C;(3)取步骤(2)扩增产物5juL,与1 jLiL0.25。/o溴酚兰緩沖液混勻， 点样于1.5。/。的琼脂糖^y交上，于1 x TAB缓沖液中、5V/cm电压下电泳， 电泳结束后用EB染色，于自动凝胶图像分析仪上照相，若电泳结果出现 493bp的DNA条带，则待测菌种为香菇L03、 Cr02或沪农1号菌种中的 一种。
5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于所述EB染色为在含0.5pg/ml EB 的水溶液中染色30分钟。
全文摘要
本发明提供了一种香菇L03、Cr02或沪农1号菌种的分子特异性标记引物，以及利用该引物对香菇L03、Cr02和沪农1号菌种进行鉴别和检测的方法。所述引物序列为上游引物5′-ATCCGAAGCTCTTCAGTAAAC-3′，下游引物5′-TGCCGAAGTATATCAAG-3′。本发明有益效果主要体现在本发明检测方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高的优点；本发明方法检测所需时间只要1～3天，而常规的拮抗试验所需要的时间至少两周时间，出菇试验则需要至少3个月的时间。
文档编号C12N15/11GK101358240SQ20081012057
公开日2009年2月4日 申请日期2008年8月25日 优先权日2008年8月25日
发明者付立忠, 吴学谦, 吴庆其, 李海波, 程俊文, 亮 贺, 魏海龙 申请人:浙江省林业科学研究院