德氏有孢圆酵母的植酸酶基因多位点突变株及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及一种优化改良的在酸性范围内植酸酶PHY-M催化活性提高的德氏有孢圆酵母突变菌株及其多位点突变植酸酶基因和应用。
【背景技术】
[0002]植酸(Phytate, Phytic acid, IP6)又称肌醇六磷酸,含有6个磷酸基团,是饲料中磷的重要贮存形式。磷是动物机体必须矿物元素，而单胃动物体内缺乏分解植酸的植酸酶(Phytase，催化植酸及植酸盐水解的酶)，造成饲料中磷的利用率仅有1/3或更低。为了补充有效磷的不足，必须在饲料中添加无机磷酸盐，常用的为磷酸氢钙和骨粉。这样不仅大大增加了饲料的成本，而且大量的植酸磷不能被利用而直接排出体外，造成磷源的浪费及严重的环境问题。
[0003]实验证明，在饲料中添加植酸酶可以提高植物性饲料中磷和其他矿物元素的利用率，提高对淀粉、脂肪、蛋白质等营养物质的利用率，从而促进动物健康快速的增长，减少粪便中磷含量从而减轻环境的污染。一般认为，在饲料中添加植酸酶可以使磷的利用率提高20-60%。在玉米-豆柏日粮中添加微生物植酸酶，磷的利用率提高60% ;在以豆饼为基础的肉鸡饲料中添加植酸酶，大约有50%的植酸磷被释放。
[0004]要提高猪饲料中植酸酶的水解活性，主要是要提高猪用植酸酶在胃环境下的植酸水解能力，其中提高植酸酶在酸性环境下的稳定性和催化活性是重点。因此，优化酵母菌植酸酶，使其在整个酸性范围内具有高催化活性，有较大的应用潜力和产业价值。随着生物科技的发展，特别是DNA重组技术的应用，使各种微生物来源的植酸酶基因的大规模表达成为可能。目前来源于coli, AspergillusA /應igaiiAs等微生物的植酸酶已经在巴斯德毕赤酵母中得到高效表达，并成功地在饲料中应用。然而大多数植酸酶活性的最适PH4.5到5，在pH2到3时，酶活性比较低，只有最适pH条件下的30-40%，不利于植酸酶在胃环境中发挥水解植酸。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是通过对酵母菌植酸酶PHY-M的改造，使改造后的植酸酶在整个酸性范围内具有高催化活性，使其能够更好地在动物胃中发挥水解植酸的作用。
[0006]本发明的目的是提供一种优化改良的植酸酶PHY-M及其基因。
[0007]本发明的再一目的是提供包含上述的植酸酶基因的多位点突变菌株，原始菌株于2014年01月17日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所100101)，其保存号为=CGMCC N0.8742，分类命名为德氏有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)。多位点突变菌株，于2014年01月17日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所100101)，其保存号为:CGMCC N0.8738，分类命名为德氏有抱圆酵母(Torulaspora delbrueckii)。
[0008]本发明的再一目的是提供包含上述植酸酶基因多位点突变菌株的应用。
[0009]本发明的再一目的是提供上述植酸酶的应用。
[0010]本发明采用紫外线照射的方法对酵母菌来源的植酸酶活性中心进行改造，经过多次筛选得到在整个酸性范围内具有高催化活性的植酸酶。本发明的植酸酶含有1329个碱基，编码442个氨基酸(SEQ ID N0.1)。和原有酵母菌植酸酶相比，有两个氨基酸发生了突变，如图1所示，其氨基酸序列第305位的Lys突变为Gln，第373位的Val突变为He，第398位的Lys突变为Arg。
[0011]该植酸酶的pH活性范围为2.5-5.5，突变菌株在植酸钙酵母培养液中30°C培养36h后测定发酵上清液中的植酸酶活性，在pH2.5时植酸酶活性为30.46U/ml, pH5.5时植酸酶活性为9.00U/ml。而在相同条件下培养的未改良原始菌株在pH2.5时植酸酶活性为14.78U/ml，pH5.5时植酸酶活性为0.00U/ml。说明本发明的改良的植酸酶在整个酸性环境中都具有极高的植酸水解活性，达到了在胃环境中PH条件下能较好水解植酸的要求。
[0012]本发明还提供了上述优化改良的植酸酶的基因序列(SEQ ID N0.2)，其编码上述植酸酶。和原有酵母菌植酸酶基因相比，其编码的植酸酶基因序列第913位的碱基A突变为C，第936位的碱基T突变为C，第1117位的碱基G突变为A，第1193位的碱基A突变为G，如图2所示。
[0013]本发明还提供了上述植酸酶在饲料添加剂中的应用，主要涉及所述植酸酶在制备饲料添加剂中的用途，以及相应的饲料添加剂，所述饲料添加剂的有效成分可以是所述植酸酶、表达植酸酶的宿主细胞。
[0014]序列表说明
SEQ ID N0.1突变的植酸酶氨基酸序列 SEQ ID N0.2突变的植酸酶基因碱基序列【附图说明】:
图1为本发明的突变植酸酶与未突变的原始植酸酶氨基酸序列的比较。
[0015]图2为本发明的突变植酸酶基因与未突变的原始植酸酶基因序列的比较。
[0016]【具体实施方式】:
实验材料和试剂:
1、菌株
德氏有抱圆酵母(保藏编号 CGMCC N0.8742。
[0017]2、酶类及其他生化试剂
FastAp内切酶购自Thermo scientific公司，连接酶购自Invitrogen公司，植酸钠等底物购自Sigma公司，其他都为国产试剂。
[0018]3、培养基
大肠杆菌培养基为LB (1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，l%NaCl，pH7.0)。酵母培养基为YPD(1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖)。
[0019]本实验中所用到遗传学技术均为本领域中的常规技术。
[0020]实施例1、高植酸酶活性突变株的初筛
首先对酵母菌种进行紫外线诱变，把德氏有孢圆酵母涂布在植酸钙平板中置于15W紫外线灯照射30-90s后盖上皿盖，倒置于30°C恒温培养箱中避光培养2?3天，挑取平板中的水解透明圈直径较大的酵母单菌落点接于另一植酸钙平板中，培养3?4天，测水解透明圈直径(H)与菌落直径(C)，计算出水解透明圈直径和菌落直径比值(Η/C)大小，将Η/C值和对照组进行比较，筛选出Η/C值较大的突变菌株。然后将筛选出的酵母突变菌株和对照菌株点接于植酸钙平板中，每一菌株点三个平行平板，培养几天后，再测量Η/C值大小。将经过诱变处理所筛选出的Η/C值较大的酵母突变菌株和对照酵母菌株分别接种于含有50mL液体YPD培养基的250mL三角烧瓶中，30°C，160r/min振荡培养36h后，利用高速冷冻离心机离心(4°C,4000r/min,离心1min)取发酵上清液,并经适当稀释测量植酸酶活性。
[0021]实施例2、酸性环境下植酸酶高活性突变株的复筛
将经过诱变处理所筛选出的Η/C值较大的酵母突变菌株和对照酵母菌株分别接种于含有50mL液体YPD培养基的250mL三角烧瓶中，30°C，160r/min振荡培养36h后，利用高速冷冻离心机离心(4°C，4000r/min,离心I Omin)取发酵上清液，分别在pH 2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5分析在整个酸性条件下的植酸酶活性。在这些pH条件下，酵母突变株的植酸酶活性相对于对照酵母菌株有较大的提高。
[0022]实施例3、酵母菌植酸酶基因的合成
根据酵母菌植酸酶基因的序列设计PCR引物5’端含有Afoi I内切酶位点，3’端含I内切酶位点，引物序列如下:
5’ 端引物 TDphyFor:CCGGAATTCATGCTTTGGGAAAAAATTGGTACTCAGG3’ 端引物 TDphyRev:TAGCGGCCGCTTATTTTTTGATCAAACTAGCGT
以植酸酶基因为模板，用上述引物进行PCR扩增，即可合成酵母菌植酸酶基因。取阳性克隆质粒DNA进彳丁基因测序。
[0023]测序结果确定突变植酸酶基因序列第913位的碱基A突变为C，第936位的碱基T突变为C，第1117位的碱基G突变为A，第1193位的碱基A突变为G ;编码的氨基酸序列突变位点为第305位的Lys突变为Gln，第373位的Val突变为He，第398位的Lys突变为Arg0
[0024]尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由所附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合和拓展。
【主权项】
1.一株德氏有孢圆酵母植酸酶基因phy-m多位点突变株，其特征在于，该菌株可用于生产饲用、食用植酸酶，还可以用于生产微生物磷肥和(或)生物有机磷肥，保藏号为=CGMCCN0.8738。
2.如权利要求1所述的用途，一种优化改良的德氏有孢圆酵母多位点突变植酸酶PHY-M，其特征在于，其氨基酸序列第305位的Lys突变为Gln，第373位的Val突变为He，第398位的Lys突变为Arg，植酸酶活性pH范围为2.5-5.5。
3.如权利要求1、2所述的用途，一种优化改良的德氏有孢圆酵母多位点突变植酸酶PHY-M，其特征在于，其具有如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列。
4.如权利要求1-3所述的用途，一种优化改良的德氏有孢圆酵母多位点突变植酸酶基因其特征在于，其编码的植酸酶基因序列第913位的碱基A突变为C，第936位的碱基T突变为C，第1117位的碱基G突变为A，第1193位的碱基A突变为G。
5.如权利要求1-4所述的用途，一种优化改良的德氏有孢圆酵母多位点突变植酸酶基因/??广m，其特征在于，其具有如SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
6.包含权利要求1-5所述的用途，一种优化改良的德氏有孢圆酵母多位点突变植酸酶基因其特征在于，其编码的植酸酶基因序列可以被克隆到原核和(或)真核生物基因表达载体上，通过基因工程技术构建基因工程菌株和(或)转基因植物，以高效表达植酸酶基因phy~m生产植酸酶。
【专利摘要】本发明公开了一株德氏有孢圆酵母的植酸酶基因多位点突变株及其应用，涉及生物技术领域。本发明采用紫外线诱变酵母菌对植酸酶基因进行突变，得到有三个氨基酸位点发生了突变的高活性植酸酶基因突变株，在整个酸性环境中都具有极高的植酸水解活性，达到了在胃环境中pH条件下能较好水解植酸的要求。该菌株可用于生产饲用、食用植酸酶，还可以用于生产微生物磷肥和（或）生物有机磷肥，保藏号为：CGMCC No. 8738。突变后的植酸酶基因序列可以被克隆到原核和（或）真核生物基因表达载体上，通过基因工程技术构建基因工程菌株和（或）转基因植物，以高效表达植酸酶基因生产植酸酶。CGMCC No. 873820140117 CGMCC No. 874220140117
【IPC分类】C12N9-16, C12N15-82, C12N15-81, C12R1-88, C12N15-55, C12N1-19
【公开号】CN104694406
【申请号】CN201510066140
【发明人】马忠友, 邢素芝, 汪建飞, 赵建荣, 王德生, 骆云飞
【申请人】安徽科技学院
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年2月9日