一株具有石油降解功能的细菌ah07和其用途以及海底沉降石油降解菌剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株具有石油降解功能的细菌 AH07(0chrobactrum cytisi，CGMCC No. 10349)以及利用该菌株海洋环境治理领域的应用， 尤其是涉及石油污染后引起的石油污染的生物治理领域的应用。
【背景技术】
[0002] 近年来随着海洋石油的运输、开采、装卸、加工和使用，海洋石油泄漏事件时有发 生，海洋石油污染日益加剧。石油对生物多样性的破坏严重，包括人们常见的各种鱼类、 鸟类以及其它生物都受到了严重影响，石油可沾附在鱼鳃上，使鱼窒息，抑制水鸟产卵和孵 化，破坏其羽毛的不透水性，降低水产品质量；同时，泄露的石油可形成油膜，阻碍水体的复 氧作用，影响海洋浮游生物生长，破坏海洋生态平衡；此外还可破坏海滨风景，影响海滨美 学价值。
[0003] 目前，针对于石油污染，尤其是大面积石油泄漏，通常采用的应急措施除了采油人 工打捞等物理方法，还采用加入消油剂使石油乳化，迅速沉降的方法以恢复海面暂时的清 洁，虽然这一方法短时看似起到了治理的效果，但背后却隐藏着危机，其会造成二次化学污 染。
[0004] 因此，实施物理化学方法进行生态环境的重建几乎不可能实现，生物修复海洋污 染成为唯一可行的途径。但相对于陆地，海洋植物相对匮乏，污染海洋的生物修复还主要依 赖海洋微生物的降解作用，尤其依赖于已经适应海底环境的各种土著石油降解微生物。这 些石油降解微生物在海底能够利用石油作为其唯一碳源，克服海底黑暗、低温、寡养、缺氧 的极端条件，以石油为食，将石油进行分解转化，从而改变而海底荒漠化问题。
【发明内容】
[0005] 为了解决石油泄露引发的污染问题，如海面的漂浮石油的污染问题；又如化学治 理引发的二次污染，尤其是为了解决石油污染后引起的海底沉降石油污染及继而引发的海 底荒漠化问题，发明人设法获得高效的海洋土著石油微生物并进行研宄，最终得到了一株 具有石油降解功能的细菌AH07。发明人在要求保护此菌株的同时要求对其用途进行保护。
[0006] 本发明的技术方案如下：
[0007] -株具有石油降解功能的细菌AH07,该菌株的建议分类命名为Ochrobactrum cytisi。其 16S rRNA 序列如 SEQ ID No. 1 所示。
[0008] 所述的适用于石油降解的菌株AH07是发明人从自然界中分离得到的，在 细菌分类学上属于变形杆菌门（Proteobacteria phy. nov.)，阿尔法变形杆菌纲 (Alphaproteobacteria)，根瘤菌目（Rhizobiales)，市鲁氏菌科（Brucellaceae)，苍白杆 菌属（Ochrobactrum)。发明人从大连新港石油污染海域采集的海底沉积物中分离获得。取 泥样5克用无菌水稀释IO 5倍，将原油均匀涂布到ASM培养基上，15°C培养7天分离得到 菌株。菌株AH07从大连新港石油污染海域采集的海底沉积物中分离获得，采集者姓名刘长 建、采集者联系方式0411-87656046。
[0009] 所述的菌株AH07已提交保藏，具体保藏信息如下：
[0010] 保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC);
[0011] 保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所；
[0012] 保藏日期：2015年01月13日；
[0013] 保藏编号：CGMCC No. 10349 ; 分类命名:Ochrobactrum cytisi ；
[0014] 所述的适用于石油降解的菌株AH07的形态及生理生化特征为：
[0015] (1)菌落形态特征
[0016] 菌株AH07的菌落形态为：在LB培养基上培养7天后，呈乳白色，菌落较小，表面略 有光泽，光滑，菌落边缘光滑整齐。
[0017] (2)菌株形态及其生理生化特性
[0018] 在细菌分类学上属于变形杆菌门（Proteobacteria phy. nov.)，阿尔法变形杆菌 纲（Alphaproteobacteria)，根瘤菌目（Rhizobiales)，市鲁氏菌科（Brucellaceae)，苍白 杆菌属（Ochrobactrum)。革兰氏阴性好氧细菌，色氨酸酶阴性，过氧化氢酶阳性，无色素产 生，产生H2S。菌体杆状，0.8-2. 0*0. 3-0. 4 μπι。在NaCl浓度0-20%范围内均能生长，最 适NaCl浓度3%，生长的温度范围4-50°C，最适温度范围25-30°C，pH范围5-10. 5,最适 pH7. 0-8. 5,水解明胶和淀粉，不能利用葡萄糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、果糖、木糖、棉籽糖、 甘露糖、山梨糖醇、甘油。
[0019] 所述的菌株AH07的用途为以石油降解的方式进行石油污染的治理。
[0020] 优选的，该用途是以可沉降菌剂颗粒的形式实现的。
[0021] 发明人的第一个技术构思为：研发一种石油降解微生物的载体，不仅能够为菌株 AH07提供寄居的空间，同时该载体可为菌株AH07提供缓释营养并且具备沉降特性。
[0022] 本发明的此目的通过下述方案实现：
[0023] 海底沉降石油降解菌剂，是将菌种AH07的发酵料与石油降解微生物载体的制备 原料按照1:5-15的质量比，优选1:10的质量比混合后造粒烘干而得；进一步的，使最终的 菌剂浓度为l〇 1(lcfu/ml以上为佳；
[0024] 所述的石油降解微生物载体的制备原料及其配比包括：
[0025]
【主权项】
1. 一株具有石油降解功能的细菌AH07,其特征在于，其保藏编号为CGMCC No. 10349， 其16SrRNA序列如SEQ ID No. 1所示。
2. 如权利要求1所述的一株具有石油降解功能的细菌AH07,形态及生理生化特征： 在LB培养基上培养7天后，呈乳白色，菌落较小，表面略有光泽，光滑，菌落边缘光滑整齐， 革兰氏阴性好氧细菌，色氨酸酶阴性，过氧化氢酶阳性，无色素产生，产生H 2S，菌体杆状， 0. 8-2. 0*0. 3-0. 4 ym，在NaCl浓度0-20%范围内均能生长，最适NaCl浓度3%，生长的温 度范围4-50°C，最适温度范围25-30°C，pH范围5-10. 5,最适pH7. 0-8. 5,水解明胶和淀粉， 不能利用葡萄糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、果糖、木糖、棉籽糖、甘露糖、山梨糖醇、甘油。
3. 如权利要求1所述的一株具有石油降解功能的细菌AH07在以石油降解的方式进行 石油污染的治理的用途。
4. 一种海底沉降石油降解菌剂，是将权利要求1所述的一株具有石油降解功能的细菌 AH07的发酵料与石油降解微生物载体的制备原料按照1:5-15的质量比，优选1:10的质量 比混合后造粒烘干而得； 所述的石油降解微生物载体的制备原料及其配比包括：
〇
5. 如权利要求4所述的海底沉降石油降解菌剂，其特征在于：细菌AH07的发酵料是将 活化好的细菌AH07培养料与繁殖培养基按照1:5-10质量比，优选1:10的质量比混合；于 20~50 °C、优选37 °C下固体发酵3~7天，优选发酵5天而得细菌AH07发酵料； 所述的活化好细菌AH07培养料是在LB斜面挑取待活化细菌AH07的菌株接入活化液 体LB培养基中25-50°C下、优选37°C进行活化而得；从而得到活化后菌体浓度为101(lcfu/ ml的的培养料；所述活化液体LB培养基为：蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母膏5g/L，pH 7. 0 ~7. 5 ;121°C，30min 灭菌； 所述的繁殖培养基固态原料及配比：
繁殖培养基成品的湿度优选55 %。
6. 如权利要求4所述的海底沉降石油降解菌剂，其特征在于：所述的造粒烘干是将混 合料加入搅拌机中并加入粘结剂搅拌，加水充分混合使含水量低于25wt %，挤压造粒，80°C 以下顺流烘干lOmin以下；冷却后即得菌剂，保证菌剂中活菌数达到109cfu/ml。
7. 如权利要求6所述的海底沉降石油降解菌剂，其特征在于：所述的顺流烘干是将湿 颗粒通过烘干机前部的中间仓进入烘干筒内，与此同时热风以顺流方式进入烘干筒，在旋 转筒体的内抄板带动下，物料被抄起，形成分撒均匀的较密集的料幕。
8. 如权利要求4所述的海底沉降石油降解菌剂，其特征在于：所述的石油降解微生物 载体的制备原料均为20目以下的细粉。
9. 如权利要求4所述的海底沉降石油降解菌剂，其特征在于：所述繁殖培养基的制备 原料均为20目以下的细粉。
【专利摘要】一株具有石油降解功能的细菌AH07和其用途以及海底沉降石油降解菌剂，属于微生物技术领域，所述的菌株AH07的用途为以石油降解的方式进行石油污染的治理。以可沉降菌剂颗粒的形式实现的。菌剂颗粒按照以下步骤获得活化培养料、制繁殖培养基；菌种扩培制适于石油降解的菌种的发酵料；混合造粒，得菌剂颗粒；本发明首次从海洋土著微生物中筛选出适用于石油降解的菌株AH07；研发的一种海底石油降解菌剂，不仅使石油降解微生物拥有寄居的空间，同时微生物可获得缓释的营养；该降解菌剂具备沉降特性，解决了石油污染后引起的海底沉降石油污染及继而引发的海底荒漠化问题。1034920150113
【IPC分类】C12N1-20, C02F3-34, C12R1-01
【公开号】CN104805044
【申请号】CN201510222039
【发明人】刘秋, 于基成, 潘俊华, 刘长建
【申请人】大连民族学院
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年4月30日