专利名称：Tip60的pSer86单克隆抗体与制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的细胞株和单克隆抗体，尤其是涉及一种能产生Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体细胞株和抗Tip60第86位丝氨酸磷酸化(pSer86)的单克隆抗体的制备方法和应用。
背景技术：
Tip60(Tat Interactive Protein, 60KDa)是目前研究最为透彻的 MYST 家族中的一种组蛋白乙酰基转移酶(Histone Acetyltrsferease, HAT)，主要存在于由至少18亚基组成的稳定核蛋白稳定复合物中。Tip60除了乙酰化组蛋白H2A，H3，H4之外，还能修饰一系列非组蛋白，例如髓细胞组织增生癌基因c (c-Myc)、激酶ATM、E2F转录因子等。然而在某些情况下，Tip60也会抑制转录活性。现已证明Tip60蛋白参与了细胞信号、基因表达调控、染色质重建、DNA损伤修复、细胞凋亡和肿瘤发生等活动。已有的研究证实了 Tip60在Ser86和 Ser90发生磷酸化时，其HAT活性也随之增强。因HAT活性是DNA损伤应答、β -淀粉样前体切割等过程所必需的，表明磷酸化的Tip60在这些过程中发挥重要作用，因此Tip60及其磷酸化形式已成为当前分子细胞生物学研究的热点之一。但是目前国内外市场上缺乏可用于研究内源性磷酸化的Tip60抗体，而无法开展相关的研究。有关参考文献见[1]C. Charvet et al. , Phosphorylation of TIP60 by GSK—3 Determines the Induction of PUMA and Apoptosis by p53. Mol. Cell 42,584-596(2011) ；[2]C. Lemercier et al. , TIP60 acetyltransferase activity is controlled by phosphorylation. J. Biol. Chem. 278, 4713-4718(2003) ； [3]Kamine J, Elangovan B, Subramanian T, Coleman D, Chinnadurai G.Identification of a cellular protein that specifically interacts with the essential cysteine region of the HIV-ITat transactivator. Virology. 1996Feb 15 ； 216(2) :357-66。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能产生Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体细胞株及其制备方法。本发明的另一目的在于提供一种效价高、特异性强、应用范围广的Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体及其制备方法和应用。所述Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体细胞株pSer86-13MAb已于2011年 06月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏中心登记入册编号为CGMCC No. 4940。所述Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体是由Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体细胞株pSer86-13MAb产生的抗体。所述Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体细胞株的制备方法包括以下步骤
1)设计1条Tip60第86位丝氨酸磷酸化的多肽序列，将所述多肽序列与血蓝蛋白 (keyhole limpet hemocyamin，简称KLH)进行偶联形成一个多肽偶联蛋白，作为人工免疫原；所述Tip60第86位丝氨酸磷酸化的多肽序列为KTPTKNGLPGSRPG，其中Ser磷酸化修饰；2)利用步骤1)所得人工免疫原对Bal b/C小鼠进行3 6次动物免疫后用酶联免疫吸附测定法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)检测小鼠血清免疫效价；3)从血清免疫效价最好的小鼠身上获得脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP 2/0进行细胞融合，用酶联免疫吸附测定法经过2 6轮反复筛选杂交瘤细胞，最终获得能稳定分泌的 Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体细胞株，所述Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体细胞株也是Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。所述Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体的制备方法包括以下步骤1)利用Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体细胞株，生产小鼠腹水并从其中获得抗Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体；2)通过Protein G亲和层析柱分离纯化腹水后，获得纯化的Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体。所述Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体可用于酶联免疫吸附测定。所述Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体可用于免疫印迹检测。所述Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体可用于免疫共沉淀检测。所述Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体可用于免疫荧光染色检测。所述Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体不仅可用于检测细胞外源过表达磷酸化的Tip60，而且可用于检测细胞内源表达磷酸化的Tip60。以下给出所制备的Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体细胞株和Tip60第 86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体的鉴定方法 1)利用合成的一个无磷酸化的Tip60第86位丝氨酸磷酸化的多肽序列 KTPTKNGLPGSRPG为对照物以及如前所述的一个在Tip60第86位丝氨酸有磷酸化的多肽序列进行酶联免疫吸附测定(ELISA)，结果表明，Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体只识别带有磷酸化的多肽序列，并不识别无磷酸化的Tip60多肽序列。2)用构建的Tip60第86位丝氨酸突变成丙氨酸的突变体真核细胞表达载体 pCMV-HA-Tip60S86A(厦门大学生科院林圣彩实验室提供)来验证Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体能特异性地识别第86位丝氨酸磷酸化的Tip60，结果表明，所制备的 Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体，可在免疫印迹中(Western Blot)检测出外源过表达的第86位丝氨酸磷酸化的Tip60。3)采用Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体通过应用免疫共沉淀和免疫印迹的方法对HCT116细胞进行检测，结果表明，Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体还能特异性地识别细胞内源表达的第86位丝氨酸磷酸化的Tip60。4)利用细胞转染过表达技术获得外源过表达的Tip60蛋白，用Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体进行免疫共沉淀，最后用免疫印迹的方法进行检测，结果表明， Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体可以用于免疫共沉淀(Immunoprecipitation)。
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5)利用细胞转染过表达技术和免疫荧光染色方法对外源过表达的Tip60蛋白进行免疫荧光染色，结果表明，Tipeo第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体可以用于免疫荧光检测(Immunofluorescence Staining)。本发明的突出优点和技术效果如下至今，未见任何有关能产生Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体细胞株及 Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体和应用的报道，鉴于Tip60及磷酸化Tip60功能分析研究的重要性，本发明提供的能稳定分泌Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体的细胞株(杂交瘤细胞株)是一株全新的细胞株，所述细胞株所分泌的抗体可用于酶联免疫吸附测定法(ELISA)，免疫印迹(Western Blot)，免疫共沉淀(Immunoprecipitation)和免疫荧光染色(Immunofluorescence Staining)等检测。这个抗体除了能够识别外源过表达的磷酸化的Tip60，还能识别细胞内源性磷酸化的Tip60，本发明对磷酸化的Tip60开展研发并成功地研发了世界上第一个Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体。
图1用ELISA方法测定Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体的效价图。在图 1中，横坐标为抗体稀释倍数(X100)，纵坐标为阳性对阴性效价的比值；标记■为pSer86 多肽， 为pSer90多肽， 为pSer86 & pSer90多肽， 为非磷酸化多肽。图2为用免疫印迹的方法(Western Blot)检测细胞外源表达的野生型Tip60和第 86位点突变型的Tip60。在免疫印迹实验中Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体可以特异识别第86位丝氨酸磷酸化的Tip60。在图2中，左边泳道是转染空载体的对照组，中间泳道是过表达的野生型Tip60，右边泳道转染的是第86位丝氨酸点突变成丙氨酸的Tip60 ； 上、中、下都为Western Blot检测结果，分别用了 Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体检测第86位磷酸化丝氨酸的Tip60、HA单克隆抗体检测细胞转染过表达效率和Actin单克隆抗体作为上样对照检测。图3为用免疫共沉淀(Immunoprecipitation)和免疫印迹(Western Blot)的方法检测细胞内源所表达的Tip60 pSer86。采用Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体通过应用免疫共沉淀和免疫印迹的方法对HCT116细胞进行检测。用抗兔IgG抗体作为对照(如左边泳道)，用Tip60兔多抗进行免疫共沉淀(如右边泳道)，然后再用Tip60第86 位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体进行免疫印迹检测，结果表明，Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体还能特异性地识别细胞内源表达的第86位丝氨酸磷酸化的Tip60。图4为用免疫共沉淀(Immunoprecipitation)和免疫印迹(Western Blot)的方法检测外源瞬时转染细胞所表达的Tip60 pSer86。Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体可用于在293T细胞中过表达的外源Tip60 pSer86的免疫共沉淀(Immunoprecipitation)。 用Tip60表达载体单独转染293T细胞(如泳道1、2和4)和用带有Myc标签的Tip60表达载体与带有激酶GSK3i3的表达载体共转(如泳道3)，让其过表达Tip60蛋白或共表达 Tip60和激酶GSK3i3。另外在泳道4的细胞样品中加入GSK3 β激酶的抑制物SB216763。 然后分别用抗标签蛋白Myc抗体(如A所示)或抗p-Ser86抗体(如B所示)进行免疫共沉淀(Immimoprecipitation)，用抗IgG抗体作为对照(如泳道1)，之后用抗标签蛋白Myc 抗体做蛋白免疫印迹(Western Blot)实验分析，结果表明，Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体可以用于免疫共沉淀(Immunoprecipitation)。图5为用免疫荧光染色方法检测外源瞬时转染细胞过表达的Tip60 pSer86。用 Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体进行细胞免疫荧光染色；图中亮点表示磷酸化的 Tip60可被该单克隆抗体识别。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例1 能产生Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体细胞株和Tip60第86 位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体的制备1.人工合成多肽设计1条Tip60第86位丝氨酸磷酸化的多肽序列，将所述多肽序列与血蓝蛋白 (keyhole limpet hemocyamin，简称KLH)进行偶联形成一个多肽偶联蛋白，作为人工免疫原。同时设计一个没有磷酸化的相同多肽为对照物。2.小鼠免疫取多肽偶联蛋白和等体积的弗氏佐剂，反复吸推使两者混合均勻，形成滴水不化的油包水乳剂后对Balb/c健康雌性小鼠进行免疫。免疫3-6次之后，采集小鼠血清，用 ELISA方法进行抗血清效价检测。若P/N彡2. 1 (P指免疫血清样品OD45tl值减去空白对照 0D450值，N指阴性对照OD450减去空白对照OD45tl值)，则判断为阳性。3.细胞融合采用化合物PEG介导的细胞融合方法，对免疫效价最好的小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合，将融合后的细胞悬液铺板至96孔细胞培养板，置CO2培养箱中培养。用ELISA 方法经过多轮反复筛选，并进行单克隆化培养，最终获得高效价的阳性单克隆细胞株。4.利用所获得的杂交瘤细胞株生产包含大量的Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体的小鼠腹水，通过用亲和层析柱纯化腹水后，获得纯化好的Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体用于后续的鉴定工作。实施例2 :Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体的鉴定和应用1.应用ELISA方法进行鉴定利用一条合成的无磷酸化的Tip60多肽序列，一条在Tip60第86位丝氨酸有磷酸化的多肽序列，一条Tip60第90位氨基酸磷酸化的多肽序列，以及一条Tip60第86位与第 90位两位点氨基酸磷酸化的多肽序列为对照物，进行酶联免疫吸附测定(ELISA)。结果表明，Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体可识别Tip60第86位丝氨酸磷酸化的多肽序列，还可识别Tip60第86与第90位两位点氨基酸磷酸化的多肽序列，但不识别无磷酸化的Tip60多肽序列、Tip60第90位氨基酸磷酸化的多肽序列(参见图1)。2.应用免疫印迹方法(Western Blot)进行检测将293T细胞培养于含10 %胎牛血清的DMEM培养基中，在5 %的CO2培养箱中生长。取Tip60的表达载体pCMV-Myc-Tip60WT、突变型Tip60的表达载体 pCMV-Myc-Tip60-S86A和pCMV5空载体(这些载体均由厦门大学生科院林圣彩实验室提供)按常规PEI转染法分别转染293T细胞，36小时后按照常规方法收集细胞，用免疫印迹方法检测。结果表明，该抗体能特异性地识别细胞外源表达的第86位磷酸化丝氨酸的Tip60(参见图2)。3.应用免疫共沉淀(Immunoprecipitation)和免疫印迹(Western Blot)的方法检测细胞内源所表达的Tip60pSer86。先采用兔多克隆抗Tip60抗体和兔多克隆抗IgG抗体对HCTl 16细胞裂解液分别进行免疫共沉淀，用抗兔IgG抗体作为对照(如左边泳道)，用 Tipeo兔多抗进行免疫共沉淀(如右边泳道)，然后再用Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体进行免疫印迹检测，结果表明，Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体还能特异性地识别细胞内源表达的第86位丝氨酸磷酸化的Tip60(参见图3)。4.应用免疫共沉淀(Immunoprecipitation)和免疫印迹(Western Blot)的方法进行检测在293T细胞中过表达带有Myc标签的Tip60表达载体并同时表达带有激酶 GSK3i3的表达载体(载体均由厦门大学生科院林圣彩实验室提供)(如图4中泳道3)或单独表达Tip60载体(如图4中泳道1、2和4) 293T细胞，让其同时过表达Tip60蛋白和GSK3 β 激酶(如图4中泳道3)或单独过表达Tip60蛋白(如图4中泳道1、2和4)。Tip60蛋白是 GSK3i3激酶的底物，该激酶能磷酸化Tip60。另外在泳道4的细胞样品中加入GSK3 β激酶的抑制物SB216763去抑制GSK3 β激酶的活性。分别用抗标签蛋白Myc抗体(如图4Α所示)或抗p_Ser86抗体(如图4B所示)进行免疫共沉淀(Immunoprecipitation)，用抗鼠 IgG抗体作为对照，之后用抗标签蛋白Myc抗体做蛋白免疫印迹实验分析，结果表明，Tip60 第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体可以用于免疫共沉淀(Immimoprecipitation)。5.应用免疫荧光染色技术进行检测在过表达HA-Tip60的293T细胞中，用纯化了的抗Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体进行常规细胞免疫荧光染色(参见图5)。图5中的亮点部分是被该单克隆抗体识别的磷酸化的Tip60，结果表明，Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体可用于细胞的免疫荧光染色。
权利要求
1.Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体细胞株pSer86-13MAb，已于2011年06月 15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为 CGMCC No. 4940。
2.如权利要求1所述的Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体细胞株的制备方法， 其特征在于包括以下步骤1)设计1条Tip60第86位丝氨酸磷酸化的多肽序列，将所述多肽序列与血蓝蛋白进行偶联形成一个多肽偶联蛋白，作为人工免疫原；所述Tip60第86位丝氨酸磷酸化的多肽序列为KTPTKNGLPGSRPG，其中Ser磷酸化修饰；2)利用步骤1)所得人工免疫原对Balb/C小鼠进行3 6次动物免疫后用酶联免疫吸附测定法检测小鼠血清免疫效价；3)从血清免疫效价最好的小鼠身上获得脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，用酶联免疫吸附测定法经过2 6轮反复筛选杂交瘤细胞，最终获得能稳定分泌的 Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体细胞株，所述Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体细胞株也是Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
3.Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体，由Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体细胞株pSer86-13MAb产生的抗体。
4.如权利要求3所述的Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)利用Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体细胞株，生产小鼠腹水并从其中获得抗Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体；2)通过ProteinG亲和层析柱分离纯化腹水后，获得纯化的Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体。
5.如权利要求3所述Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体用于酶联免疫吸附测定。
6.如权利要求3所述Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体用于免疫印迹检测。
7.如权利要求3所述Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体用于免疫共沉淀检测。
8.如权利要求3所述Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体用于免疫荧光染色检测。
9.如权利要求3所述Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体用于检测细胞外源过表达磷酸化的Tip60 ；用于检测细胞内源表达磷酸化的Tip60。
10.Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体细胞株和Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体的鉴定方法1)利用合成的一个无磷酸化的Tip60第86位丝氨酸磷酸化的多肽序列 KTPTKNGLPGSRPG为对照物以及如前所述的一个在Tip60第86位丝氨酸有磷酸化的多肽序列进行酶联免疫吸附测定，结果表明，Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体只识别带有磷酸化的多肽序列，并不识别无磷酸化的Tip60多肽序列；2)用构建的Tip60第86位丝氨酸突变成丙氨酸的突变体真核细胞表达载体 pCMV-HA-Tip60 S86A来验证Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体能特异性地识别第 86位丝氨酸磷酸化的Tip60，结果表明，所制备的Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体，在免疫印迹中检测出外源过表达的第86位丝氨酸磷酸化的Tip60 ；3)采用Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体通过应用免疫共沉淀和免疫印迹的方法对HCT116细胞进行检测，结果表明，Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体还能特异性地识别细胞内源表达的第86位丝氨酸磷酸化的Tip60 ；4)利用细胞转染过表达技术获得外源过表达的Tip60蛋白，用Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体进行免疫共沉淀，最后用免疫印迹的方法进行检测，结果表明，Tip60第 86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体可以用于免疫共沉淀；5)利用细胞转染过表达技术和免疫荧光染色方法对外源过表达的Tip60蛋白进行免疫荧光染色，结果表明，Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体可以用于免疫荧光检测。
全文摘要
Tip60的pSer86单克隆抗体与制备方法和应用，涉及一种新的细胞株和单克隆抗体。所述细胞株为Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体细胞株pSer86-13MAb；所述Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体是由Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体细胞株pSer86-13MAb产生的抗体。所述细胞株所分泌的抗体可用于酶联免疫吸附测定法，免疫印迹，免疫共沉淀和免疫荧光染色等检测。这个抗体除了能够识别外源过表达的磷酸化的Tip60，还能识别细胞内源性磷酸化的Tip60，对磷酸化的Tip60开展研发并成功地研发了世界上第一个Tip60第86位丝氨酸磷酸化的单克隆抗体。
文档编号G01N33/577GK102492658SQ201110423160
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月15日 优先权日2011年12月15日
发明者叶志云, 李晓彤, 李阳, 苏勇, 陈艳 申请人:厦门大学