CTCTAGGAATCATCATTCGATT(下划线部分为 Bgl II 酶切位点）。扩增产物经Bgl II酶切纯化后，回收目的DNA片段（1380bp左右）；用Bgl II 酶切表达载体pCUbi01301 (含有Ubiquitinl启动子），用T4连接酶连接目的DNA片段和 Bgl II酶切的表达载体pCUbi01301，得到目的质粒，然后鉴定插入正反向后，将正向插入的 阳性克隆质粒进行PCR和测序验证。pCUbi01301载体（如图9所示）是在pCAMBIA1301载 体的基础上接了一个玉米泛素启动子（组成型高表达启动子，Ubi promoter)。由此将组蛋 白脱乙酰化酶基因0sHDA705 (如SEQ ID NO. 1的第73位到1449位碱基所示）接在玉米泛 素启动子后面，构建成组蛋白脱乙酰化酶基因0sHDA705超表达载体，将此重组载体命名为 pCUbi01301-0sHDA705〇
[0039] 2.重组质粒 pCUbiO 1301-0sHDA705 转化到农杆菌 EHA105
[0040] 取1 μ 1重组质粒表达载体pCUbi01301-0sHDA705与农杆菌EHA105感受态细胞混 匀，冰上放置30min。然后液氮速冻Imin后，迅速转到37 °C放置5min。加800 μ 1无抗生素 的YM培养基，在28°C中，100RPM转速中培养2-4h。将培养物涂到25mL YM平板，YM培养基 中含卡那霉素和硫酸链霉素，浓度都为50mg/L。将平板倒置放在28°C的培养箱中培养，直 至菌落长出（约2天）。挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，菌落鉴定的PCR引物为HDA7050X-F 和HDA7050X-R。选取转入了超表达载体pCUbiO 1301-0sHDA705的农杆菌EHA105克隆作为 阳性克隆。
[0041] 3.农杆菌介导的水稻遗传转化
[0042] (1)水稻成熟胚的诱导
[0043] 水稻成熟种子去壳后，用70%乙醇浸泡lmin，0. 1%升采浸泡15min，再用无菌水 清洗4次，每次4min，种子转到无菌滤纸上晾干后，接种在诱导培养基上，26°C暗培养。约 10-15天后，切去胚根和胚乳，转接到继代培养基上，26°C暗培养。两周后继代培养一次，挑 选适合大小、紧密和色泽淡黄的愈伤组织预培养3天。
[0044] (2)EHA105农杆菌的培养
[0045] 将含有超表达载体pCUbiO 1301-0sHDA705的农杆菌EHA105在含有50mg/L Kan 和50mg/L Str的YM平板上划线，28°C黑暗培养3天，挑取单克隆于加有同样抗生素的5ml 液体YM中培养12~24h，然后以I :30的比例于同样的液体YM(30ml)中进行扩大培养4~ 5h，5500rpm离心10min后收集菌液，用液体AAM培养基（内含乙酰丁香酮（As)，浓度为100 微摩尔每升）重新悬浮（0D600约为0. 5)，置于28°C摇床轻微振荡培养15min，该农杆菌悬 浮液即可用于转化水稻愈伤。
[0046] (3)水稻愈伤组织与农杆菌的共培养
[0047] 挑选状态较好（预培养3天、色泽淡黄）的颗粒状愈伤组织放入50ml无菌三角 瓶中，加入准备好的步骤（2)的农杆菌悬浮液，静置培养20min，每隔5min轻轻摇一下三角 瓶。倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的 固体共培养基上，22°C黑暗培养3天。
[0048] (4)抗性愈伤组织的筛选
[0049] 将共培养3天后的愈伤组织转到含有500mg/L的头孢霉素（Cef)的灭菌水中清 洗，每次4-5min，共4-5次。然后将愈伤组织置于灭菌过的滤纸上吸干水分。将干燥后的愈 伤组织放在含有50mg/L潮霉素（Hyg)和500mg/L的头孢霉素（Cef)的筛选培养基上，26°C 暗培养2周，转到新配制的筛选培养基上继续筛选2周（大部分愈伤组织在筛选后10天左 右褐化，然后在褐化组织的边缘重新生长出乳白色的抗性愈伤组织）。
[0050] (5)抗性愈伤组织的分化
[0051] 从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选一定大小、乳黄色致密的抗性愈伤 组织转至含有50mg/L Hyg和500mg/L Cef的预分化培养基上暗培养7天，然后转至分化培 养基上在16h光/8h黑暗的光周期条件下培养，温度为26°C，光照强度为lOOOOlux，一般经 过6-10天就会有绿点出现，20-30天后进一步分化出小苗。
[0052] (6)生根、壮苗和移栽
[0053] 当抗性愈伤组织分化的芽长至约8cm左右时，将小苗移到生根培养基上，培养两 周左右。选择高约10cm、根系发达的小苗，洗去培养基，在温室内移栽入土。
[0054] (7)⑶S染色检测转基因阳性植株
[0055] 将转化得到的幼苗取叶片进行⑶S染色。染色后为蓝色的为转基因阳性植株，反 之为阴性植株。
[0056] 4.转基因植株的分子鉴定
[0057] (1)转基因阳性植株的初步分子鉴定：DNA的提取采用CTAB的方法，以转基因植株 的基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增引物为HDA7050X-F和HDA7050X-R，用1 %琼脂糖 凝胶电泳进行检测。如图3所示：其中M为Marker 2000;所检测的1到9泳道的转基因植 株都为阳性植株。结果表明，PCUbi0130 l-0sHDA705重组质粒已经插入到水稻基因组中，得 到转组蛋白脱乙酰化酶基因0sHDA705水稻，即为0sHDA705基因超表达转基因植株。
[0058] (2)0sHDA705基因超表达转基因植株目的基因0sHDA705的表达量鉴定：选取7 个（0X3、0X7、0X18、0X21、0X33、0X35和0X44) 0sHDA705基因超表达转基因植株和野生型 植株CK，取叶片为材料提取RNA，逆转录成cDNA后用引物qHDA705_F和qHDA705_R扩增 0sHDA705基因。结果如图4所示，在0sHDA705基因超表达转基因植株中组蛋白脱乙酰化酶 基因0sHDA705的表达水平都有不同程度的提高，表明组蛋白脱乙酰化酶基因0sHDA705超 表达转基因体系成功，转化所得的0sHDA705基因超表达转基因植株可用于后续的实验。
[0059] 实施例4 :转基因植株抗旱性鉴定
[0060] 1.组蛋白脱乙酰化酶基因0sHDA705超表达转基因株系幼苗干旱胁迫表型鉴定 [0061 ] 用标准营养液水培水稻野生型植株CK和0sHDA705基因超表达转基因植株 0Χ3-8-4、0Χ7-6-1和0X33-2植株至两周，每个株系取30棵，设置3个生物学重复。将在标 准营养液中生长两周的幼苗（表型如图5所不）在含15% PEG6000的标准营养液中模拟 干旱处理4天（表型如图6所示），然后移到标准营养液中恢复培养7天（表型如图7所 示）。实验表明，组蛋白脱乙酰化酶基因0sHDA705超表达转基因株系的耐旱性明显比野生 型高。因此，与野生型植株相比，超表达组蛋白脱乙酰化酶基因0sHDA705后能够显著提高 水稻抵御干旱胁迫的能力。
[0062] 2.组蛋白脱乙酰化酶基因0sHDA705超表达转基因株系幼苗抗旱性测定
[0063] 用标准营养液水培水稻野生型植株CK和0sHDA705基因超表达转基因植株 0Χ3-8-4、0Χ7-6-1和0X33-2植株至两周，每个株系取30棵，设置3个生物学重复。将在标 准营养液中生长两周的幼苗用含15% PEG标准营养液处理4天后，在标准营养液中恢复7 天。以植株叶片全部发生卷曲为标准，统计野生型植株CK和0sHDA705基因超表达转基因 植株干旱胁迫处理后的存活率。结果显示，组蛋白脱乙酰化酶基因0sHDA705超表达转基因 株系的存活率明显高于野生型植株，结果如图8所示，说明0sHDA705基因超表达转基因植 株保水能力较好，抗旱能力比野生型强。
【主权项】
1. 一种组蛋白脱乙酰化酶0sHDA705,其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. -种编码权利要求1所述的组蛋白脱乙酰化酶0sHDA705的组蛋白脱乙酰化酶基因 0sHDA705,其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第73位到1449位碱基序列所示。
3. -种重组表达载体，其特征在于，含有权利要求2所述的组蛋白脱乙酰化酶基因 0sHDA705〇
4. 根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述的表达载体为任意一种可 用于农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹攻击的载体。
5. 根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述的表达载体为pCAMBIA系列 载体、pBI系列载体、pBin系列载体或Gateway?系列载体。
6. 权利要求2所述的组蛋白脱乙酰化酶基因0sHDA705在增强植物抗旱中的应用。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的应用为在培育抗旱植物品种中的 应用。
8. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的应用是将所述的组蛋白脱乙酰化 酶基因0sHDA705导入植物细胞、组织或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成 植株，使组蛋白脱乙酰化酶基因0sHDA705在植物中表达，得到抗旱的转基因植物。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的组蛋白脱乙酰化酶基因0sHDA705 是通过植物表达载体导入植物细胞、组织或器官的。
10. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的植物为水稻。
【专利摘要】本发明公开了一种水稻组蛋白脱乙酰化酶及其编码基因和应用，属于基因工程技术领域。本发明从水稻(Oryza Sativa L.)中克隆得到了组蛋白脱乙酰化酶基因OsHDA705，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示第73位到1449位碱基；编码组蛋白脱乙酰化酶OsHDA705，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该基因属于水稻组蛋白脱乙酰化酶家族RPD3/HDA1亚家族，其作为正调控因子参与了水稻对干旱胁迫的应答过程。通过转基因及功能鉴定证实超量表达OsHDA705能提高水稻对干旱的抗性，OsHDA705基因在培育抗旱植物尤其是水稻新品种方面具有非常重要的理论及应用价值。
【IPC分类】C12N15-55, C12N15-82, C12N9-80, A01H5-00
【公开号】CN104805065
【申请号】CN201510224205
【发明人】段俊, 赵金会, 张建霞, 吴坤林, 曾宋君, 张新华
【申请人】中国科学院华南植物园
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年5月5日