一种组装tale/talen模块的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种组装TALE/TALEN模块的方法，属于基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 对复杂的基因组进行定点修饰，探讨基因功能，在基因工程中越来越重要。人工 核酸内切酶（ENN)是能将特定的DNA结合蛋白跟特定的核酸内切酶相互融合构建而成的一 种人造蛋白，它目前主要包括3种类型：锌指核酸酶（Zinc-finger nuclease, ZFN)、类转 录激活因子效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease, TALEN)， 以及人工的大范围核酸酶（Meganuclease)。
[0003]转录激活因子效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALEN)是基因工程的新工具。类转录激活因子效应物TALE来自一类特殊的植 物病原体-黄单胞杆菌（Xanthomonas spp)。由于FokI核酸内切酶一二聚体形式发挥功 能，TALENs都是成对的绑定和切割DNA序列。TALENs能与DNA序列特异性结合主要由TAL 效应物上的多肽氨基酸的可变序列。类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN)是将一种能够 产生基因敲除的核酸酶融合到TALE的DNA连接部位。它被认为是一种新的、核酸靶序列与 蛋白质的锌指基序(motif)之间对应性更强、便于预测的DNA结合结构域。
[0004]目前，构建识别特定DNA序列的TALE/TALEN就成为这一技术中的一个关键步骤 和应用中的主要瓶颈。除了可以选择全序列人工合成这一昂贵的方法之外，通过分子克 隆的途径人工构建TALE的方法主要包括四大类：（1)基于Golden Gate (GG)克隆的方 法：根据单体的不同来源可分为基于PCR的GG法（GG-PCR)和传统的基于质粒载体的GG 法（GG-Vector)。（2)基于连续克隆组装的方法：包括限制性酶切一连接法（Restriction enzyme and ligation, REAL)、单兀组装法（Unit assembly, UA)和 idTALE -步酶切 次序连接法。（3)基于固相合成的高通量方法：包括FLASH和ICA (Iterative capped assembly)。（4)基于长粘末端的 LIC (Ligation-independent cloning)组装方法等。 Golden Gate法把IIS类限制性内切酶的识别位点分别反向放置在一段DNA片段的5'和 3'端，酶切反应后，识别位点被切除，并在5'和3'留下粘性末端。如果两段DNA序列具有 互补的粘性末端，就可以通过连接反应连接在一起。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种方便快捷的方法组装TALE模块，在基础理论研究、临 床治疗等领域建立广阔的应用前景。
[0006] 本发明采用一次PCR来获得组装TALE模块，本发明使用来自IncRNA-RoR启动子 P53结合区域（TGACTTGCATGTACATGCCC)来证明这一方法的准确性。具体实施步骤如下： (1)首先设计 4 gBlock DNA 寡核苷酸，如 SEQ ID N0. 1、SEQ ID N0. 2、 SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4所示；所述4 gBlock DNA寡核苷酸序列在在相邻2个寡核 苷酸之间有30bp的重叠。
[0007] (2)通过一次PCR将它们连接在一起，形成TALE模块，然后克隆到 pTALl-pCDH 载体上； A. 制备pTALl-pCDH载体，所述pTALl-pCDH载体包含BsmBl酶切位点，序列如SEQ ID NO. 5所示； B. PCR -步法组装TALE模块，也就是将步骤（1)中所述的4 gBlock DNA寡核苷酸，克 隆到带有BsmBl酶切位点的pTALl-p⑶H表达载体上。
[0008] 所述组装TALE/TALEN模块的验证方法如下： (1) 设计一个携带P53结合位点和mCherry荧光蛋白的TALE报告基因，序列如SEQ ID NO. 6所示； (2) PCR 扩增 4 gBlocks 中 IncRNA-RoR 启动子 p53 结合区域（RoR-p53RE)部分 (TGACTTGCATGTACATGCCC)； (3) TALE报告基因与未组装TALE模块的pTALl-p⑶H载体即空载体，或者与携带 gBlock-RoR-p53 RE 的 pTALl-pCDH 共转染至 293T cells，验证结果。
[0009] 其中步骤（3)中所述的共转染方法为： (1) 将293T细胞种到12孔板，每孔铺满40% ; (2) 第二天，每孔通过标准方法转染1呢质粒； (3) 第三天，使用荧光显微镜观察情况。
[0010] 本发明的创新之处在于，采用一次gBlock-PCR和克隆法来组装TALE模块，将会具 有以下有益效果： (1)准确性高，更加方便快捷。Golden Gate方法通过II型限制性核酸内 切酶，剪切识别位点部位，建立独立的4bp悬突(粘性末端)。直接合成法最大的缺陷在 于价格昂贵，并且合成大于l〇〇〇bp的DNA的成功率和准确率很低。基于Golden Gate的 方法在最初需要比较复杂的PCR引物和DNA片段设计，以便得到合适的粘性末端序列，从 而将重复序列依次顺序连接。在实验过程中需要构建大量的载体或使用很多引物，有时还 需要PCR扩增。而且，Golden Gate的方法是一步法进行酶切和连接，条件控制严格而复 杂，需要较长的摸索和调整，效率和成功率有待更多的实践和时间检验。
[0011] (2)省时，经济，大大节约成本。Golden Gate法费时又费力，具有技术挑 战性，需要包括植入细菌、连接转化等步骤来完成总实验时间长达十余天。而本发明通 过一次PCR组装仅需4天，节约大量时间和成本。为了检测本发明合成物的作用，我们设计 一个荧光蛋白的报告基因。通过实验来检测，结果也是准确的。
[0012] (3)在实际的应用中，gBlock-PCR克隆法能够更好地替代传统的Golden-gate 法。不需要大量的引物构建基本重复单元，无需复杂的实验方法和特殊的连接酶，所有 使用的酶均为常规的限制性内切酶，实验操作也很简便，无需特殊的条件。每一个有条件从 事基本分子生物学实验的实验室均可以操作。因此，这将在基因工程(如基因活化、基因敲 除及敲入）发展中具有巨大潜力。
【附图说明】
[0013]图 1 为 Golden-gate 对 RoR_p53RE 连接方法。
[0014] 图2为本发明中gBlock-PCR克隆法。
[0015] 图3为传统Golden-gate与本发明中克隆方法的比较。
[0016]图 4 为将 RoR-p53RE 克隆到 pTALl-pCDH 的 BasmBl 部分。
[0017] 图5为PCR组装的TALE模块克隆到BsmBl酶切位点的pTALl-p⑶H表达载体上， 并连接携带mCherry信号的TALE报告基因。
[0018] 图6为验证RoR-p53RE TALE结果图。
[0019] 具体实例方式 以下结合实施例对本发明做进一步说明，实施例是用于说明本发明而不是用于限制本 发明的范围。
[0020] 实施例1: 1.试验方法： (1)从IDT公司获得4 gBlock DNA片段序列，通过一次PCR将它们连接 在一起，然后克隆到pTALl-p⑶H载体上。每一个模块，例如NG，NN，NI和HD，由34个 氨基酸(或者l〇2bp)组成，分别特异性绑定在T，G，A和C碱基上。
[0021] (2) PCR组装的TALE模块克隆到pTALl-pCDH表达载体的BsmBl区域 上，用抑制降解和DNA序列测序来证实。
[0022] A. PCR扩增4 gBlocks中RoR_p53RE部分，反应条件为：
【主权项】
1. 一种组装TALE/TALEN模块的方法，其特征在于，按照以下步骤操作： (1) 首先设计 4 gBlock DNA 寡核苷酸，如 SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、 SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4 所示； (2) 通过一次PCR将它们连接在一起，形成TALE模块，然后克隆到 pTALl-pCDH 载体上； A. 制备pTALl-pCDH载体，序列如SEQ ID NO. 5所示； B. PCR -步法组装TALE模块，也就是将步骤（1)中所述的4 gBlock DNA寡核苷酸，克 隆到带有BsmBl酶切位点的pTALl-p⑶H表达载体上。
2. 根据权利要求1所述的一种组装TALE/TALEN模块的方法，其特征在于，所述组装 TALE/TALEN模块的验证方法如下： (1) 设计一个携带P53结合位点和mCherry荧光蛋白的TALE报告基因，序列如SEQ ID NO. 6所示； (2) PCR 扩增 4 gBlocks 中 IncRNA-RoR 启动子 p53 结合区域（RoR-p53RE)部分 (TGACTTGCATGTACATGCCC)； (3) TALE报告基因与未组装TALE模块的pTALl-p⑶H载体即空载体，或者与携带 gBlock-RoR-p53 RE 的 pTALl-pCDH 共转染至 293T cells，验证结果。
3. 根据权利要求1所述的一种组装TALE/TALEN模块的方法，其特征在于，所述4 gBlock DNA寡核苷酸序列在在相邻2个寡核苷酸之间有30bp的重叠。
4. 根据权利要求1所述的一种组装TALE/TALEN模块的方法，其特征在于，所述 pTALl-pCDH载体包含BsmBl酶切位点。
5. 根据权利要求2所述的一种组装TALE/TALEN模块的方法，其特征在于，其中步骤 (3)中所述的共转染方法为： (1) 将293T细胞种到12孔板，每孔铺满40% ; (2) 第二天，每孔通过标准方法转染1呢质粒； (3) 第三天，使用荧光显微镜观察情况。
【专利摘要】本发明涉及一种组装TALE/TALEN模块的方法，属于基因工程技术领域。本发明采用一次PCR来获得组装TALE模块，具体技术方案包括：首先设计4 gBlock DNA寡核苷酸，在相邻2个寡核苷酸之间有30bp的重叠；然后通过PCR将它们连接起来，再克隆为一个表达载体；为了检测这一合成物的作用，我们设计一个携带p53结合位点和mCherry荧光蛋白的报告基因，检测p53特异性TALE是否能活化报告载体及内源性lncRNA-RoR启动子，证明了实验的准确性；本发明与传统组装DNA连接模块的方法相比，更为方便、简单，省时省力，经济高效。
【IPC分类】C12N15-65, C12N15-85, C12N15-31
【公开号】CN104673832
【申请号】CN201510063215
【发明人】徐岷, 龚爱华, 蔡菁, 张尤历, 莫寅元
【申请人】江苏大学附属医院
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年2月9日