一种peg-长链脂肪烷定点修饰的人生长激素及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及一种将PEG-长链脂肪烷定点修饰在人生长激素的N-末端，以及其制备方法。
【背景技术】
[0002]人生长激素(human growth hormone, hGH)是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种单一肽链的蛋白质激素，有191个氨基酸残基，分子量为22kDa，分子中无糖基，且具有4个α-螺旋和两个链内二硫键。hGH通过与分布于组织细胞表面的生长激素受体结合而发挥其生理功能。hGH的主要生理功能包括间接的促细胞生长作用、直接的代谢调理作用和免疫调节作用。hGH可用于治疗生长激素缺乏儿童矮小症、Turner氏综合症、艾滋病消瘦、大面积创伤等疾病。由于hGH的分子量小、在体内易被肾小球过滤和酶降解，采取静脉和皮下注射给药会导致其在体内的血浆半衰期短。在临床使用时需要频繁给药才能保持有效的血药浓度和治疗效果，这不仅在生理、心理和经济上对患者造成了极大的负担，且易产生耐受性及免疫排斥等不良反应。因此，开发耐受性好、省钱、且易为患者接受的hGH长效剂型已成为人们关注的焦点之一。
[0003]目前，用于延长蛋白质药物血浆半衰期的方法主要基于化学修饰或者基因工程融合表达。其中，聚乙二醇(PEG)修饰和结合人血清白蛋白(HSA)是两种常用的方法，可有效延长hGH的血浆半衰期，达到长效治疗的目的。PEG是中性、无毒，且具有良好生物相容性的高分子聚合物。PEG修饰可有效降低蛋白质的免疫原性和肾小球的过滤作用，从而延长蛋白质在体内的血浆半衰期。然而，PEG对蛋白质药物的空间屏蔽作用会减弱蛋白质药物与其受体的相互作用，从而导致其生物活性的降低，甚至完全丧失。人血清白蛋白(HSA)是人血浆中含量最丰富的蛋白质，分子量约为66.5kDa，在人体内的血浆半衰期约为19天，具有安全无毒、生物相容性好、无免疫原性等特点。通过HSA与蛋白质药物化学偶联或者基因融合表达，可以显著延长蛋白质药物的血浆半衰期，同时降低其免疫原性和抗原性。然而，HSA的空间屏蔽作用极大地降低了蛋白质的生物活性。因此，临床试验结果开始质疑传统蛋白质药物长效剂型的研发策略，即通过增加血浆半衰期来提高药效。
[0004]HSA由三个柔性的球形结构域(1、II和III)组成，并拥有5个长链脂肪酸(Myrl-5)结合位点，且解离常数在10_8_10_7M的范围内。最近，人们研发了长链脂肪酸酰基化修饰的多肽药物。其研发策略是通过长链脂肪酸与HSA的结合，延长多肽药物的血浆半衰期；通过长链脂肪酸与HSA的缓慢释放，逐步恢复多肽药物的生物活性。例如，丹麦NovoNordisk公司通过十四烷酸(肉豆蔻酸)结合胰岛素，开发了一种新型的长效胰岛素(商品名:Levemir)，用于治疗I型和2型糖尿病，并于2004年被美国FDA批准上市。随后，该公司通过十六烷酸(棕榈酸)结合胰高血糖素样肽l(GLP-l)，开发了一种新型的长效GLP-1(商品名:Liraglutide)，其中GLP-1的血楽半衰期从2分钟延长到13小时。Liraglutide主要用于治疗2型糖尿病，已于2010年被美国FDA批准上市。
[0005]在PEG修饰和长链脂肪酸酰基化修饰的基础上，Kim等使用分子量为20kDa的分支型PEG，在其4个臂上分别连接了 2个Exendin-4 (Ex4)多肽分子和2个16碳的长链脂肪烷，用于治疗2型糖尿病。其研宄策略是通过修饰的PEG链和结合的HSA来延长Ex4的血浆半衰期。与未修饰的Ex4相比，修饰产物(Ex4-PEG-C16)的血浆半衰期和曲线下面积(AUC)增加了 6倍。然而，该研宄策略存在以下缺陷:(I)PEG的琥珀酰亚胺(NHS)基团会随机修饰到Ex4赖氨酸残基的ε -氨基和N-末端氨基酸残基的α -氨基，而有些氨基酸残基靠近Εχ4的活性中心，修饰这些位点会显著降低Εχ4的生物活性；(2)高分子量的PEG(20kDa)由于能高效地结合水分子，会极大地降低HSA与十六烷的结合能力，不利于增加Ex4的血浆半衰期；(3)不能用于蛋白质药物的化学修饰。将蛋白质直接加入混有有机溶剂的PEG化十六烷，有机溶剂会引起蛋白质沉淀，导致其生物活性的丧失；PEG链上的NHS基团在有机溶剂中稳定，而在水溶液中极易水解，在去除有机溶剂的过程中因NHS基团的水解而无法修饰蛋白质。因此，我们迫切需要研发针对蛋白质药物的PEG-长链脂肪烷修饰技术，优化PEG连接桥的分子量，并将PEG-长链脂肪烷定点修饰到远离蛋白质药物活性中心的位点。
【发明内容】
[0006]针对上述问题，本发明提出了一种将PEG-十六烷定点修饰到hGH的N-末端的方法。最终修饰产物的成分单一，易于修饰产物的分离纯化和质量控制，并能减少hGH生物活性的损失。
[0007]本发明以PEG-十六烷定点单修饰人生长激素的N末端，包括以下步骤:
[0008](I)制备PEG-十六烷修饰的人生长激素。分别采用分子量为3.5kDa和1kDa的马来酰亚胺-PEG-琥珀酰亚胺酯(mal-PEG-NHS)与十六胺反应，引入十六烷；修饰产物(mal-PEG-HD)的马来酰亚胺基团与1_硫代甘油反应，引入邻位羟基，采用高碘酸钠(Na14)氧化邻位羟基生成醛基。而后根据醛化学反应原理将带醛基的PEG-十六烷定点修饰在hGH的N-末端的α -氨基，即每个hGH分子的N-末端结合I个PEG-十六烷分子。其中，分子量为3.5kDa的PEG-十六烷(mal_P3.5-HD)修饰产物由hGH_P3.5-HD代表；分子量为1kDa的PEG-十六烷(mal-P10_HD)修饰产物由hGH-P10_HD代表。
[0009](2)制备PEG修饰的人生长激素。按照一定的反应条件，将分子量为1kDa的PEG-醛定点修饰在hGH的N-末端的α -氨基，即每个hGH分子的I个PEG分子。PEG修饰产物由hGH-ΡΙΟ代表，作为hGH-P10-HD的对照。
[0010](3)修饰产物的分离纯化与鉴定。hGH-P3.5-HD和hGH-P10-HD由mono Q阴离子交换柱(0.5cmX5cm,美国 GE Healthcare 公司)进纯化。hGH-ΡΙΟ 由 Q SepharoseHighPerformance阴离子交换柱(1.6cmX2.5cm,美国GE Healthcare公司)进行纯化。洗脱物均采用280nm的紫外波长进行检测，进行收集。浓缩后纯化产物采用SDS-PAGE和凝胶过滤色谱鉴定。
[0011](4)hGH-P3.5-HD 和 hGH-P10-HD 修饰位点的鉴定。将 hGH、hGH_P3.5-HD 和hGH-P10-HD置换到含2.0M脲的0.05M的NH4HCO3 (pH 8.2)的缓冲液中，将蛋白浓度调整为1.0毫克/毫升。将胰蛋白酶和蛋白以质量比为1:50的比例，于37°C下孵育14小时，酶解产物由C4反相色谱柱进行分离和鉴定。
[0012](5)修饰产物的免疫原性分析:将24只6-8周的BALB/c雌鼠随机分为4组，每组6只，A组为hGH组，B组为hGH-P3.5-HD组，C组为hGH-P10-HD组，D组为hGH-P1组。于0、7、14天行皮下注射，21天处死后，收集血清。血清中hGH特异的IgG抗体采用酶联免疫吸附法(ELISA)进行测定。
[0013](6)修饰产物的体外活性分析:采用表面等离子共振技术测定hGH及其修饰产物与生长激素结合蛋白(GHBP)的体外结合活性。将GHBP固定在CM5芯片上，结合过程采用不用的样品浓度进行测定，使用1:1朗缪尔结合模型进行分析。测定样品的结合速率CO、解离速率(kd)以及解离常数(Kd)。
[0014](7)修饰产物的药代动力学分析:选取250?300克雄性SD大鼠24只，随机分为4组。其中，A组为hGH、B组为hGH-P3.5_HD、C组为hGH-P10_HD、D组为hGH-P1组，经皮下注射，注射剂量为I毫克hGH/公斤大鼠，体积为500微升。经皮下注射后，在不同的时间范围内进行眼眶采血，离心收集血浆。用ELISA试剂盒测定血浆中hGH及其修饰样品的含量。
[0015](8)修饰产物的药效动力学分析:选取250?300克雄性SD大鼠30只，随机分为5组。其中，A组为对照组，皮下注射500微升0.15mol/L的磷酸缓冲液组为hGH、C组为hGH-P3.5-HD、D组为hGH-P10k_HD、E组为hGH-P1组，经皮下注射，注射剂量为I毫克hGH/公斤大鼠，体积为500微升。经皮下注射后，在不同的时间范围内进行眼眶采血，离心收集血浆。用ELISA试剂盒测定血浆中IGF-1的含量。
[0016]与传统的修饰策略相比，本发明的优势在于提供了一种以低分子量的双功能PEG为连接桥，PEG的一端