专利名称：“sars”病毒特异性转移因子及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种“SARS”病毒特异性转移因子及其制备方法，具体地讲，本发明涉及一种以灭活的“SARS”病毒为抗原制得的“SARS”病毒特异性转移因子及其制备方法。
背景技术：
SARS病毒是在今年我国乃至世界范围内肆虐的SARS病的元凶。它的传播严重影响了人们的正常生活秩序。SARS病毒是一种崭新的冠状病毒，非某种已知冠状病毒的近期变种。冠状病毒是一种RNA病毒。2003年3月以来，国内外相继报道了引起SARS冠状病毒的基因序列，该病毒含有完整的5’末端序列、编码序列和3’末端序列，全RNA基因组长度为29727核苷酸，基因编码区的组成结构与其他冠状病毒类似，包括多个开放阅读框架(ORFs)，分别编码病毒的多聚合酶蛋白(polymerase 1a，1b)和结构蛋白。
转移因子(Transfer factor)是白细胞中有免疫活性的淋巴细胞所释放的一种低分子核苷酸和多肽，其本质是少量核酸和小分子多肽的混合物。它可以将被某种抗原(病原)免疫的特异性免疫反应从某一个体转移到另一个体，非特异性地提高受者的免疫功能，促进免疫细胞因子释放。
转移因子具有可透析性，不含蛋白，粗制转移因子中含多肽、核酸，其活性不为胰蛋白酶、DNA酶和RNA酶所破坏，在-20℃条件下可长期保存，分子量小于5000。
转移因子还具有转移细胞免疫的能力。在使用很小的剂量就能使受体产生局部或全身反应，作用时间快，3-4h就可激活宿主的淋巴细胞，使受体致敏，持续时间可长达一年之久。在体外转移因子可使未致敏的淋巴细胞致敏，胸腺嘧啶渗入增加，使丧失与绵羊红细胞形成玫瑰花能力的淋巴细胞部分地恢复。转移因子不能在种间交叉转移，现已证明，动物种间、成人与动物之间均可相互转移，仅仅是转移程度有差异。
转移因子在国内生产和临床应用多年，包括非特异性转移因子和特异性转移因子。非特异性转移因子主要用于提高人体的免疫功能和抗病能力，而特异性转移因子除了具备非特异性转移因子的功能外，还可以激发针对某种抗原的免疫反应。转移因子一般从脾脏和淋巴结等免疫器官和白细胞中提取。
我国专利申请03108006.5公开了一种抗非典病毒转移因子制备方法，首先，非典病毒经Hep-2细胞、人胚肾细胞、人胚肺细胞或鸡胚培养增殖，制备非典病毒抗原以及根据非典病毒的基因序列用基因工程方法表达制备的保护性抗原。其次，以不连续梯度密度离心纯化病毒抗原或以20％蔗糖沉层浓缩抗原。然后，用所提取的病毒抗原免疫动物。最后，从免疫动物中提取抗非典病毒转移因子。
至今，人们仍未研制出一种能有效地治疗SARS的药物。明年SARS病毒有可能会卷土重来，威胁人类的健康。研究对有效治疗和预防SARS的药物的任务迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种制备“SARS”病毒特异性转移因子的方法。
在本发明的制备“SARS”病毒特异性免疫核糖核酸的方法中包括如下步骤(1)对“SARS”病毒进行灭活，制得灭活的“SARS”病毒；(2)用灭活的“SARS”病毒与免疫佐剂混合后注射到动物体内；(3)从免疫后的动物的组织中提取“SARS”病毒特异性转移因子；(4)将提取的“SARS”病毒特异性转移因子进行精制、纯化和分装。
上述的制备方法基于下面的原理灭活的“SARS”病毒中的抗原成分可以诱导和刺激动物产生免疫反应，激活体内免疫活性细胞等，而这些细胞会分泌转移因子，从而激活针对“SARS”病毒的特异性细胞免疫反应。
本发明的发明人根据这一原理，利用在广州分离获得的“SARS”病毒，经灭活后制成灭活疫苗，然后与可以加强免疫刺激效应的佐剂一起注射到猪等动物体内，诱发动物产生特异性的免疫反应。证实产生免疫反应后，提取肝、脾、淋巴结等组织中的转移因子，从特异性免疫的角度生产出一种抗“SARS”的有效治疗药物。
在步骤(1)之前，可以通过PCR扩增SARS病毒。步骤(1)中灭活可以是甲醛灭活或者是温度灭活，也可以采用其他的灭活方法。流感病毒采用市售的灭活病毒，而“SARS”病毒要经过灭活。灭活条件的控制的关键在于对灭活温度、时间或甲醛浓度的控制。采用温度灭活时温度控制在46-66℃范围，时间控制在10-100分钟内。例如可以采用56℃60分钟。甲醛浓度在0.10％-1.00％。灭活的时间为数小时至数十小时。例如，可以用0.2％的甲醛灭活SARS病毒24小时以上，或者0.4％的甲醛灭活SARS病毒2小时以上，可以使SARS病毒丧失感性，灭活率为100％；病毒灭活前后抗原不受影响。尽管0.2％的甲醛作用24小时以上可以灭活病毒，但能检测出高拷贝的核酸，因此优选采用0.4％的甲醛灭活24小时作为灭活SARS疫苗的条件。这种灭活方法能有效地灭活病毒，并且灭活前后抗原不受影响。
在步骤(2)中除了灭活的“SARS”病毒和免疫佐剂之外，还采用流感病毒的灭活疫苗一起进行混合后，来联合免疫动物。
其中，佐剂可以增强免疫效果，使用的佐剂可以是佛氏佐剂包括佛氏完全佐剂(FCA)和佛氏不完全佐剂(FIA)、氢氧化铝佐剂、CpG佐剂中的一种或几种，优选为使用佛氏佐剂完全佐剂或不完全佐剂。更优选为使用佛氏佐剂完全佐剂和不完全佐剂。
免疫的动物可以是小鼠、大鼠、兔、猪、牛、猴或马，优选为猪。
免疫的方法可以是单独用SARS灭活疫苗免疫动物，也可以是用SARS灭活疫苗与流感疫苗同时对动物进行免疫。由于用“SARS”和流感病毒抗原联合免疫动物，制造出来的转移因子对“SARS”和流感都具有特异性，是本发明的关键所在，因此优选采用此方案。
免疫(接种)可以是单次注射，也可以是多次注射。由于一般要多次注射才能达到高免疫状态，所以优选为多次注射。接种方法优选为背部多点肌肉注射。选择合适的免疫的时间间隔和长度可以达到较好的免疫效果。一般需要数天的时间。优选为0天、15天、21天、40天进行接种。
在步骤(3)中采集免疫后动物的肝、脾和/或淋巴结组织，将其细胞破碎，然后提取“SARS”病毒特异性转移因子。其中，细胞破碎的方法可以采用组织捣碎机捣碎、超声波破碎等，但是常用组织捣碎机捣碎，制成匀浆。提取“SARS”病毒特异性转移因子的方法为冻融透析法、孵育透析法或乙醇提取法。
在步骤(4)中可以按照现有技术采用微孔滤膜过滤、超滤、透析等方法进行精制和纯化。在步骤(4)之后可以根据需要进行鉴定、活性检测，例如用核酸测定法检测浓度，用生物活性法测定特异性和作用。精制和纯化后得到的“SARS”病毒特异性转移因子可以在无菌条件下进行分装。
另一方面，本发明还提供了一种由方法制备的“SARS”病毒特异性转移因子，既可以是以灭活的“SARS”病毒为抗原制得的，也可以是以灭活的“SARS”病毒和流感病毒灭活疫苗为抗原制得的。对“SARS”病毒和流感病毒都有特异性，从而能够对“SARS”和流感均起到有效的治疗效果。
经严格的检测，由这种方法制得的“SARS”病毒特异性转移因子符合国家生物制品标准，该特异性免疫的转移因子对提升人体抗“SARS”病毒感染的能力具有明显效果，对“SARS”和流感治疗都有特异治疗作用，对人体无毒副作用的优点，填补了“SARS”治疗无有效和特异药物的国内外空白，对防治“SARS”有特殊意义。
以下结合实施例，来进一步说明本发明，但本发明并不局限于这些实施例，任何依照本发明的基本精神的改进或替代，仍属于本发明权利要求书中所要求保护的范围。
具体实施例方式
下列实施例中所使用的材料为1.流感疫苗上海生物制品厂生产。
2.佐剂佛氏完全佐剂和佛氏不完全佐剂，Sigma产品。
3.HRP标记兔抗猪IgG和IgM酶标抗体，美国产品。
4.超滤器美国Millipore公司产品。
实施例1 SARS灭活疫苗的制备在底面积为275cm2细胞瓶内培养VeroE6(中国国家病毒研究所)，待细胞长成致密单层后，用无血清培养液洗细胞3次，加入100ml无血清培养液，分别接种F69和Z2-Z3SARS-Cov病毒株，细胞病变至75％-100％时，滴定病毒，TCID50为log10×107/ml。将培养瓶置-20℃冰箱冻融3次，摇匀置2-8℃冰箱过夜，用0.4％甲醛灭活24hr后，5000rpm×30min，弃去沉淀，上清作为SARS灭活疫苗。
实施例2 免疫程序(SARS灭活疫苗单独免疫)健康去势公猪17头(体重50Kg，广州市良种猪场)用实施例SARS灭活疫苗(TCID50Log107/ml)。共4次，第1次为佛氏完全佐剂+SARS灭活疫苗；第2次为佛氏不完全佐剂+SARS灭活疫苗，第3次和第4次为单纯SARS灭活疫苗免疫；剂量3×TCID50；接种方法背部多点肌肉注射。免疫的时间间隔为0d，15d，21d，40d。从耳静脉采集全血1-3ml，血清采集的时间间隔为0d，5d，7d，10d，15d，21d，28d，35d和42d。然后离心分离血清，-20℃保存备用。
实施例2.免疫程序(SARS灭活疫苗和流感疫苗联合免疫)健康去势公猪13头(体重50Kg，广州市良种猪场)。用SARS灭活疫苗(TCID50Log107/ml)+流感疫苗免疫，共4次，第1次为佛氏完全佐剂+SARS灭活疫苗+流感疫苗免疫；第2次佛氏不完全佐剂+SARS灭活疫苗+流感疫苗免疫，第3次和第4次为SARS灭活疫苗+流感疫苗免疫。剂量SARS为3×TCID50；流感病毒第1次为3人份/猪，以后3次为1人份/猪；接种方法背部多点肌肉注射。免疫的时间间隔为0d，15d，21d，40d。从耳静脉采集全血1-3ml，血清采集的时间间隔为0d，5d，7d，10d，15d，21d，28d，35d和42d。然后离心分离血清，-20℃保存备用。
实施例3.免疫效果的检验中和抗体检测将实施例1和2中的免疫猪按照灭活疫苗免疫效果评价检测的方法进行。
1.病毒稀释 将滴定后的病毒稀释成100TCID50/25ul。
2.动物血清 SARS病毒免疫接种猪不同时期的血清，将血清在无菌的96孔板上从1∶10开始，连续倍稀释至1∶10240，每一稀释度2孔，同时采集免疫接种前的各种动物作为对照用。
3.中和试验 在以上血清稀释孔内加入25ul 100TCID50/25ul的Z2-Y3病毒应用液，轻轻摇匀后置36℃ 5％CO2培养箱培养，同时设正常细胞对照与病毒滴度回滴实验。
4.结果的观察 从第4天起观察结果，第7天(细胞100％出现病变)判定结果。
结果表明实施离例2和3中的猪均在第5天检测到抗SARS病毒的中和抗体，第4次免疫接种后，其中和抗体效价达到1∶240，符合免疫核糖核酸制备的要求。
实施例4.免疫效果的检验IgG检测将实施例1和2中的免疫猪采用间接ELISA法进行IgG检测(1)用pH9.6的碳酸缓冲液将SARS灭活疫苗1∶100稀释后包被96孔板，4℃过夜；(2)以15％小牛血清PBST(1‰吐温)进行封闭；(3)样本血清用含5％小牛血清PBST稀释100倍后加样；(4)加HRP标记的单抗鼠IgG抗体；(5)加邻苯二胺底物液及H2O2，避光显色；(6)用2M的H2SO4终止反应；(7)用Bio-Rad505酶标仪测各孔490nm的吸光值。
实施例5.特异性转移因子(TF)的提取方法(冻融透析法)
Lawrence法(冻融透析法)如以脾脏或淋巴结为原料，方法是取新鲜或冰冻保存的脾，去其表面被膜，脂肪等结缔组织，剪碎，置高速组织捣碎机中捣碎(10000-12000rpm，开机3min，停5min，反复3次)，镜检组织匀浆中无完整的淋巴细胞，然后置-40℃冰冻72h，融冻后透析，以下步骤同上。
实施例6.特异性转移因子的提取方法(孵育透析法)孵育透析法取致敏动物的淋巴结或脾脏，去除被膜，脂肪等结缔组织，剪碎，制成淋巴细胞悬液，用不锈钢筛将细胞滤到Hanks液中，调pH为7.3；细胞浓度为1×109个/15ml，置37℃恒温水浴中，孵育4h，并不断搅拌，后离心(1500-2000rpm)，取其上清液，用10倍量的去离子水，在4℃条件下，透析16-18h，取其透析外液，即为粗制TF。
实施例7.特异性转移因子的提取方法(乙醇提取法)乙醇提取法取新鲜淋巴组织(包括脾、淋巴结及外周血白细胞)，切成小块，加1倍体积冷却的80％乙醇及3倍体积的40％乙醇，高速捣碎3min，调pH5.0-5.1，随后在冰浴中放置30-60min，后在0-4℃条件下离心(2500rpm)20min，取其上清液，加等体积去离子水，冷冻干燥，按每克淋巴组织抽取物加2ml去离子水溶解，进行超滤，然后除菌分装。国外的试验证明，在淋巴细胞培养液中加入相应抗原或加入微量转移因子(TF)，都可刺激淋巴细胞产生大量TF。
权利要求
1.一种制备“SARS”病毒特异性转移因子的方法，该方法包括如下步骤(1)对“SARS”病毒进行灭活，制得灭活的“SARS”病毒；(2)用灭活的“SARS”病毒与免疫佐剂混合后注射到动物体内；(3)从免疫后的动物的组织中提取“SARS”病毒特异性转移因子；(4)将提取的“SARS”病毒特异性转移因子进行精制、纯化和分装。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，采用的灭活方法是甲醛灭活或温度灭活。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，采用甲醛灭活时甲醛的浓度为0.10％-1.00％。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，采用温度灭活时温度控制在46-66℃范围，时间控制在10-100分钟内。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，除了灭活的“SARS”病毒和免疫佐剂之外，还采用灭活的流感病毒一起进行混合后，来联合免疫动物。
6.如权利要求1-5之一所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的免疫佐剂是佛氏完全佐剂和/或佛氏不完全佐剂。
7.如权利要求1-5之一所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，采集免疫后动物的肝、脾和/或淋巴结组织，将其细胞破碎，然后提取“SARS”病毒特异性转移因子。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，提取“SARS”病毒特异性转移因子的方法为冻融透析法、孵育透析法或乙醇提取法。
9.一种按前述权利要求之一所述方法制备的“SARS”病毒特异性转移因子，其特征在于，该“SARS”病毒特异性转移因子是以灭活的“SARS”病毒为抗原制得的。
10.如权利要求9所述的“SARS”病毒特异性转移因子，其特征在于，该“SARS”病毒特异性转移因子是以灭活的“SARS”病毒和灭活的流感病毒为抗原制得的。
全文摘要
本发明公开了一种“SARS”病毒特异性转移因子及其制备方法。本发明的方法主要包括以下步骤“SARS”病毒的灭活、免疫动物、提取特异性转移因子、特异性转移因子的精制、纯化。本发明的“SARS”病毒特异性转移因子可以采用灭活的“SARS”病毒为抗原进行制备，所得产物可以特异性结合“SARS”病毒；也可以联合采用灭活的“SARS”病毒和流感病毒灭活疫苗为抗原进行制备，所得产物对“SARS”病毒和流感病毒都有特异性的功效，从而能够对“SARS”和流感均起到有效的治疗效果。
文档编号A61K38/02GK1546521SQ20031011237
公开日2004年11月17日 申请日期2003年11月28日 优先权日2003年11月28日
发明者陆家海, 王一飞, 潘兴华 申请人:陆家海