专利名称：囊性纤维化跨膜传导调节因子的调节剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及囊性纤维化跨膜传导调节因子(“CFTR”)的制备方法。
背景技术：
囊性纤维化(CF)在美国是一种影响约30，000儿童和成年人并且在欧洲影响约 30，000儿童和成年人的隐性遗传疾病。尽管在治疗CF方面已经取得了进展，但是无法治愈。CF因编码负责有助于调节各种组织中盐和水吸收和分泌的上皮氯离子通道的囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)基因中的突变导致。称作增加CFTR通道开放可能性的增强剂的小分子药物代表治疗CF的一种潜在治疗策略。特别地，CFTR是在多种细胞类型(包括吸收和分泌上皮细胞)中表达的cAMP/ ATP-介导的阴离子通道，其中它调节跨膜的阴离子流通，并调节其它离子通道和蛋白质的活性。在上皮细胞中，CFTR的正常功能对于维持包括呼吸和消化组织在内的整个身体的电解质转运是非常关键的。CFTR是由约1480个氨基酸构成的，这些氨基酸编码由跨膜区的串联重复体构成的蛋白质，每个重复体包含6个跨膜螺旋和1个核苷酸结合域。2个跨膜区通过一个具有多个磷酸化位点的大的、极性的、调节性(R)-域相连，所述磷酸化位点调节通道活性和细胞运输。已经鉴定出了编码CFTR的基因并测定了其序列(参见Gregory，R.J.等人， (1990)Nature 347 :382-386 ；Rich, D. P.等人，(1990)Nature 347:358-362)，(Riordan, J.R.等人，(1989) Science 245:1066-1073)。这个基因的缺陷引起CFTR突变，导致囊性纤维化(“CF”)，是人体最常致命的遗传性疾病。在美国，囊性纤维化影响约2，500分之一的婴儿。在一般的美国人口中，高达1千万的人携带单独1个这样的缺陷基因，但没有明显的不良效果。与此不同的是，携带2个与CF有关的基因的个体会发生CF的致虚弱和致命作用，包括慢性肺病。在患囊性纤维化的患者中，在呼吸上皮中内源性表达的CFTR突变导致顶膜的阴离子分泌减少，使离子和液体转运失衡。所导致的阴离子转运的减少使得CF患者的肺粘液蓄积增加并伴随最终导致死亡的微生物感染。除了呼吸性疾病，CF患者典型地具有胃肠方面的问题和胰功能不全，如果不治疗的话，会导致死亡。此外，大部分患有囊性纤维化的男性都不能生育，而患囊性纤维化的女性则生育力降低。与2个和CF有关的基因所带来的严重后果不同的是，携带有1个与CF有关的基因的个体显示出对霍乱和腹泻导致的脱水的抵抗力增强一可能解释了 CF基因在这个人群中的相对高频率出现。CF染色体的CFTR基因的序列分析显示了很多导致疾病的突变。(Cutting,G. R.等人，(1990)Nature 346 :366-369 ；Dean, Μ.等人，(1990)Cell 61:863:870;和 Kerem，B-S.等人，(1989)Science245 :1073-1080 ；Kerem，B-S 等人，(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA87 :8447-8451)。迄今为止，已经鉴定出了 1000种以上的引起疾病的CF基因突变 (http //www. genet, sickkids. on. ca/cftr/app)。最常见的突变是在 CFTR 氨基酸序列的 508位上苯丙氨酸的缺失，一般称作Δ F508-CFTR。这种突变在约70%的囊性纤维化病例中都会发生，与严重的疾病有关。AF508_CFTR中第508位残基的缺失妨碍了初生蛋白的正确折叠。这导致该突变蛋白不能退出ER，和通过质膜。结果，膜中存在的通道数量远小于表达野生型CFTR的细胞中所观察到的数量。除了运输受损，该突变导致通道门控缺陷。这样加起来，膜中通道数量减少和门控缺陷导致通过上皮的阴离子转运减少，导致离子和液体转运出现缺陷。 (Quinton，P.M. (1990),FASEB J. 4 :2709-2727)。但是，研究已经显示出，尽管比野生型CFTR 少，膜中 AF508-CFTR 的数量减少是有用的。(Dalemans 等人，(1991)，Nature Lond. 354 526-528 ；Denning ^ 人，出处同前；Pasyk 和 Foskett (1995)，J. Cell. Biochem. 270 12347-50)。除了 AF508-CFTR，导致运输、合成和/或通道门控缺陷的其它的引起疾病的 CFTR突变可以被向上或向下调节，以改变阴离子分泌并改变疾病进程和/或严重性。尽管除了阴离子外CFTR还转运多种分子，但是显然，这种作用(转运阴离子)代表了跨上皮细胞转运离子和水的重要机制中的一个要素。其它要素包括上皮Na+通道、 ENaC,Na+/2Cl7K+共转运体、Na+-K+-ATP酶泵和基底外侧膜K+通道，它们负责将氯离子吸收到细胞中。这些要素一起运作，以通过它们在细胞中的选择性表达和定位实现跨上皮细胞的定向转运。通过存在于顶膜上的ENaC和CFTR与在细胞的基底外侧表面上表达的Na+-K+-ATP 酶泵和Cl_通道之间的协调性活性，发生了氯离子的吸收。氯离子从腔侧的继发性主动转运导致细胞内的氯离子蓄积，接着被动地通过Cl—通道离开细胞，导致矢量转运。基底外侧表面上的Na72Cl7K+共转运体、Na+-K+-ATP酶泵和基底外侧膜K+通道和腔侧上的CFTR的排列，通过腔侧上的CFTR来协调氯离子的分泌。由于水可能从不自己主动转运，因此它依靠钠和氯离子的总体流量产生的微小的跨上皮渗透梯度流过上皮。如上讨论，据认为，AF508_CFTR中508残基的缺失会妨碍初生蛋白正确折叠，导致该突变蛋白不能退出ER，并通过质膜。结果，质膜中存在的成熟蛋白量不足，上皮组织内的氯离子转运显著减少。事实上，经由ER机制加工ABC转运体的ER缺陷的这种细胞现象已经显示出，其不仅是CF疾病的潜在基础，也是范围广泛的其它独立和遗传疾病的潜在基石出。因此，需要CFTR活性的调节剂及其组合物，其可以用于调节哺乳动物的细胞膜中的CFTR的活性。需要使用这种CFTR活性调节剂治疗CFTR中突变导致的疾病的方法。需要在哺乳动物的离体细胞膜中调节CFTR活性的方法。还需要调节CFTR活性的化合物的制备方法。发明_既述一般而言，本发明提供了用作CFTR调节剂的化合物的制备方法。在一个方面中，本发明提供了式1化合物的制备方法，
权利要求
1.式1化合物的制备方法，
2.权利要求1的方法，其中&独立地是-OC(O)OR'、-OC(O)NHR'或_0C(0)N(R')2， 其中R'不是氢。
3.权利要求2的方法，该方法进一步包括裂解-OC(O)OR'、-OC(O)NHR'或-OC(O) N(R' )2，形成-0H。
4.权利要求3的方法，其中通过用醇溶剂在NaOH、KOH或甲醇钠的存在下处理式1化合物来进行裂解。
5.权利要求4的方法，其中醇溶剂是甲醇。
6.权利要求1的方法，其中&或&的至少一个独立地是C^6直链或支链烷基，其被-COOR'或-C0N(R' )2取代，其中R'不是氢。
7.权利要求6的方法，该方法进一步包括各自水解-COOR'或-C0N(R')2，形成-C00H。
8.权利要求7的方法，其中通过用醇溶剂在NaOH、KOH或甲醇钠的存在下处理式1化合物来进行水解。
9.权利要求8的方法，其中醇溶剂是甲醇。
10.权利要求6的方法，其中&独立地是-OC(O)OR'、-OC(O)NHR'或_0C(0)N(R')2， 其中R'不是氢。
11.权利要求10的方法，该方法进一步包括裂解-OC(O)OR'、-OC(O)NHR'或-OC(O) N(R' )2，形成-0H。
12.权利要求11的方法，其中通过用醇溶剂在Na0H、K0H或甲醇钠的存在下处理式1化合物来进行裂解。
13.权利要求12的方法，其中醇溶剂是甲醇。
14.权利要求1-13任一项的方法，其中在碱的存在下进行偶合。
15.权利要求14的方法，其中碱是K2C03、Et3N、NMM、吡啶或DIEA。
16.权利要求1-15任一项的方法，其中在溶剂的存在下进行偶合。
17.权利要求16的方法，其中溶剂是乙腈。
18.权利要求16的方法，其中溶剂是DMF。
19.权利要求16的方法，其中溶剂是2-甲基四氢呋喃。
20.权利要求1-19任一项的方法，其中在维持在约10°C-78°C的反应温度下进行偶合。
21.权利要求20的方法，其中在维持在约20°C_30°C的反应温度下进行偶合。
22.要求20的方法，其中在维持在约40°C _50°C的反应温度下进行偶合c
23.要求20的方法，其中在维持在约42°C _53°C的反应温度下进行偶合c
24. 要求1-23任一项的方法，其中将偶合反应搅拌至少2小时。
25. 要求M的方法，其中将偶合反应搅拌至少70小时。
26.要求M的方法，其中将偶合反应搅拌至少3天。
27. 要求146任一项的方法，其中y是0。
28. 要求1-27任一项的方法，其中&是叔丁基。
29.要求1- 任一项的方法，该方法进一步包括使式4化合物
30.权利要求1- 任一项的方法，其中式3化合物是式40化合物
31.权利要求30的方法，该方法进一步包括使式41化合物
32.权利要求31的方法，该方法进一步包括将式42化合物还原的步骤，得到式40化合物C
33.权利要求1-29任一项的方法，其中式3化合物是式43化合物
34.权利要求33的方法，该方法包括使式44化合物
35.权利要求34的方法，该方法进一步包括将式45化合物还原的步骤，得到式43化合物。
36.式2化合物的制备方法，
37.式40化合物的制备方法，
38.权利要求37的方法，该方法进一步包括将式42化合物还原的步骤，得到式40化合物。
39.式43化合物制备的方法，
40.权利要求39的方法，该方法进一步包括将式45化合物还原的步骤，得到式43化合物。
41.化合物34的制备方法，化合物34 包括
42.权利要求41的方法，其中使反应进行至少6小时。
43.权利要求41的方法，该方法进一步包括在乙腈和水的混合物中形成化合物34的淤浆。
44.权利要求43的方法，其中乙腈与水之比为约9 1。
45.权利要求43的方法，其中将淤浆加热至约73°C_83°C的温度。
46.权利要求43的方法，其中化合物34在淤浆中至少约3小时。
47.权利要求43的方法，该方法进一步包括在乙酸异丙酯中形成化合物34的淤浆。
48.权利要求46或47任一项的方法，其中将淤浆加热至回流温度。
49.权利要求41的方法，该方法进一步包括将化合物34溶于2-甲基四氢呋喃和0.IN HCl的双相溶液；搅拌该双相溶液；从所述双相溶液中分离有机相；过滤并且从所述有机相中除去固体物质；使用蒸馏将所述有机相的体积减少约50% ；进行三次如下操作将 MeOAc、KOAc、IPAc、t-BuOAc、四氢呋喃(THF) Jt2O或甲基-叔丁基醚(MTBE)加入到有机相中，直到所述有机相的体积增加100%并且使用蒸馏将有机相的体积减少50% ；将MeOAc、 KOAc、IPAc、t-BuOAc、四氢呋喃(THF) Jt2O或甲基-叔丁基醚(MTBE)加入到有机相中，直到所述有机相的体积增加100%;将有机相加热至回流温度并且将该回流温度维持至少约5 小时时间；并且在约4. 5小时-5. 5小时时间期限内将有机相冷却至约_5°C至5°C的温度。
50.权利要求41的方法，该方法进一步包括用1.2N HCl使反应混合物猝灭；由此生成双相混合物；搅拌该双相混合物；从所述双相混合物中分离有机相；将0. IN HCl加入到有机层中，由此生成双相混合物；搅拌该双相混合物；分离有机相；过滤并且从所述有机相中除去固体物质；使用蒸馏将有机相的体积减少约50% ；进行三次如下步骤将乙腈加入到有机相中，直到所述有机相的体积增加100%并且将有机相的体积减少约50% ；通过加入乙腈、然后加入水将有机相的体积增加约100%，形成淤菜，其中最终溶剂比为9 1乙腈/ 水；将该淤浆加热至约73°C _83°C的温度；将该淤浆搅拌至少5小时；并且将所述淤浆冷却至约20°C _25°C的温度；过滤并且从该淤浆中除去固体物质；用具有约20°C _25°C的温度的乙腈将该固体物质洗涤4次；并且在约45 °C -约55 °C的温度在真空下干燥该固体物质。
51.通过权利要求1-50任一项的方法生产的化合物。
52.药物组合物，该组合物包含通过权利要求1-50任一项的方法生产的化合物。
53.调节生物样品中CFTR活性的方法，该方法包括使所述生物样品与通过权利要求 1-50任一项的方法生产的化合物接触的步骤。
54.治疗患者疾病或减轻其严重性的方法，该方法包括对该患者给予有效量的通过权利要求1-50任一项的方法生产的化合物，其中所述疾病选自囊性纤维化、哮喘、吸烟诱发的C0PD、慢性支气管炎、鼻窦炎、便秘、胰腺炎、胰功能不全、先天性双侧输精管缺失 (CBAVD)导致的男性不育症、轻度肺病、特发性胰腺炎、变应性支气管肺曲菌病(ΑΒΡΑ)、肝病、遗传性肺气肿、遗传性血色病、凝血-纤溶缺陷，例如蛋白质C缺乏症、1型遗传性血管性水肿、脂质加工缺陷，例如家族性高胆固醇血症、1型乳糜微粒血症、无β脂蛋白血症、溶酶体贮积症，例如I-细胞病/假性胡尔勒综合征、粘多糖症、桑德霍夫/泰-萨克斯病、克-纳综合征II型、多内分泌腺病/高胰岛素血症、糖尿病、拉伦侏儒症、髓过氧化物酶缺乏症、原发性甲状旁腺功能减退、黑素瘤、聚糖病CDG 1型、先天性甲状腺功能亢进症、成骨不全、遗传性低纤维蛋白原血症、ACT缺乏症、尿崩症(DI)、神经生长性DI、肾性DI、夏-马-图综合征、佩-梅病、神经变性疾病，例如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化、进行性核上性麻痹、匹克病、若干聚谷氨酰胺神经性障碍，例如亨廷顿病、I型脊髓小脑性共济失调、 脊髓延髓肌肉萎缩症、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩和肌强直性营养不良、以及海绵状脑病，例如遗传性克-雅病(由朊病毒蛋白加工缺陷导致)、法布里病、格-斯-施综合征、C0PD、干眼病或斯耶格伦病。
55.权利要求M的方法，其中所述疾病是囊性纤维化。
56.用于在体外或体内测定生物样品中CFTR或其片段的活性的试剂盒，包括i.包含通过权利要求1-50任一项的方法生产的化合物的组合物；和 .用于下列内容的说明书a.将该组合物与生物样品接触；和b.测定所述CFTR或其片段的活性。
57.权利要求56的试剂盒，进一步包括用于下列内容的说明书i.将另外的化合物与该生物样品接触； .在所述另外的化合物存在下测定所述CFTR或其片段的活性；和iii.将在另外的化合物存在下的CFTR或其片段的活性与在式I的组合物存在下的 CFTR或其片段的活性进行比较。
58.权利要求57的试剂盒，其中将所述CFTR或其片段的活性进行比较的步骤提供所述 CFTR或其片段的密度的测量。
全文摘要
本发明提供了式1化合物的制备方法，所述方法包括使式2的羧酸与式3的苯胺在偶合剂的存在下偶合。
文档编号C07D215/233GK102361855SQ201080012602
公开日2012年2月22日 申请日期2010年3月19日 优先权日2009年3月20日
发明者A·R·鲁克, B·R·克鲁格, B·纽伯特-兰吉尔, D·M·L·亚普, F·F·范格尔, G·佐罗卡尔尼克, J·德马瑅, M·C·伯特菲尔德, M·P·瑞恩, M·特鲁多, P·D·J·格鲁滕休斯, S·罗伊珀 申请人:沃泰克斯药物股份有限公司