一种核酸分子、载体及其在提高绿僵菌产孢速度、产孢量和孢子抗紫外能力的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种核酸分子、载体，可用于提高绿僵菌产孢 速度、产孢量和孢子抗紫外能力。
【背景技术】
[0002] 基因敲除是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位 点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术。它克服了随机整合的盲目 性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。这项技术的诞生可以说是分 子生物学技术上继转基因技术后的又一革命，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明 确、效果更加精确、可靠。
[0003] 真菌是昆虫的主要病原微生物，数量达1000种以上。昆虫病原真菌通过体壁侵 染昆虫，几乎所有昆虫都会受病原真菌侵染，在适宜的条件下昆虫病死后真菌会产生大量 孢子，在昆虫种群中形成流行病。因此，昆虫病原真菌在害虫防治中潜力巨大。绿僵菌、白 僵菌作为微生物杀虫剂最具发展潜力，已应用于蝗虫、玉米螟、松毛虫等重要农林害虫的防 治。然而，真菌杀虫剂生产成本高、防效不稳定，极大地制约了其应用。真菌杀虫剂的生产 成本主要受其产孢时间和产孢量的影响；防效不稳定主要是由于紫外照射、高温等逆境影 响真菌孢子的存活率，因而降低了杀虫效率。因此，选育能够产孢快、产孢量高、孢子抗抗紫 外的菌株对于真菌杀虫剂都具有重要的理论意义和应用价值。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种核酸分子，可用于制备苏氨酸/丝氨酸蛋白磷酸酶基因 缺失菌株，提高绿僵菌产孢速度、产孢量和孢子抗紫外能力。
[0005] 本发明的目的是通过以下措施实现的：
[0006] -种核酸分子，含有绿僵菌苏氨酸/丝氨酸蛋白磷酸酶基因（Ser/Thr Phosphatase 5，PP5)的Y端延伸片段和Y端延伸片段。所述Y端延伸片段为苏氨酸/ 丝氨酸蛋白磷酸酶基因上游的Ser/Thr右臂（Ser/Thr right arm)，3^端延伸片段为苏氨 酸/丝氨酸蛋白磷酸酶基因下游的Ser/Thr左臂（Ser/Thr left arm)。优选地，所述5' 端延伸片段如SEQ ID NO. 2所示；3'端延伸片段如SEQ ID NO. 3所示。
[0007] 本发明可用于制备苏氨酸/丝氨酸蛋白磷酸酶基因缺失菌。优选为绿僵菌，能够 提高绿僵菌产孢速度、产孢量和抗紫外能力。
[0008] -种载体，含有上述核酸分子。上述载体含有Bar基因，Ser/Thr右臂和Ser/Thr 左臂分别位于Bar基因 Y端和:V端。
[0009] 上述载体的结构如图4所示。所述载体的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0010] 上述核酸分子、载体在敲除绿僵菌的苏氨酸/丝氨酸蛋白磷酸酶基因中的应用。
[0011] 上述核酸分子、载体在培育产孢快、产孢量高和抗紫外的绿僵菌菌株A PP5中的 应用。具体地，将含有上述核酸分子的载体电击转入农杆菌，然后将农杆菌和绿僵菌共培 养，经过抗性培养基的筛选而获得具有产孢快、产孢量高和抗紫外的绿僵菌菌株A PP5。
[0012] 上述绿僵菌菌株ΔΡΡ5及其孢子在防治有害昆虫中的应用。优选地，将ΔΡΡ5孢 子配制成石蜡油悬浮液，菌悬液制剂用于防治有害昆虫。优选地，上述悬浮液是将A PP5成 熟的孢子用石蜡油配制成I X IO7个/mL。
[0013] 上述昆虫优选为蝗虫。
[0014] 有益效果
[0015] 1.本发明根据基因重组的原理敲除昆虫病原真菌绿僵菌（Metarhizium acridum) 的苏氨酸/丝氨酸蛋白磷酸酶基因（PP5)，获得了敲除菌株APP5(ASer/Thr Phosphatase 5)，是一种快速、准确、定向选育昆虫病原真菌工程菌株的技术方法，获得的敲除菌株（工 程菌株）ΔΡΡ5具有广泛的应用前景和商业价值。敲除昆虫病原真菌绿僵菌PP5后的工程 菌株ΔΡΡ5在害虫的防治上具有以下优势：1)产孢快；2)产孢量高；3)孢子抗紫外能力增 强；4)孢子的杀虫毒力和耐热性无显著变化。因此，可极大地降低真菌杀虫剂生产成本、提 尚其防效的稳定性。
[0016] 2.本发明获得了产孢快、产孢量高的农业害虫防治工程菌株ΔΡΡ5达到最大产孢 量的时间比野生型菌株缩短3天；产孢量比野生型菌株高，在第9天时的最大产孢量是野生 菌株的2. 2倍。因此，在工业生产时相同的生产时间和原料会获得比野生型菌株高2. 0倍 以上的经济效益。
[0017] 3.本发明获得的菌株对紫外照射具有较强的抗性，获得的工程菌株APP5UVLD5。 =6. 64h，野生型菌株的UVLD5q= 4. 52h。工程菌株Δ PP5抗紫外能力强，能够更好地适应 有紫外辐射的田间环境，延长其孢子的存活时间，提高防效的稳定性。
[0018] 4.本发明获得的工程菌株ΔΡΡ5与野生型菌株相比，其毒力和耐热性无显著变 化，故本发明所获得的工程菌株A PP5更适合工业生产和田间害虫防治。
【附图说明】
[0019] 图1与野生型菌株和回复菌株相比，工程菌株ΔΡΡ5产孢时间和数量的情况。WT 代表野生型菌株，ΔΡΡ5代表本发明的工程菌株ΔΡΡ5, CP是回复菌株。
[0020] 图2与野生型菌株和回复菌株相比，工程菌株ΔΡΡ5抗紫外能力的比较。WT代表 野生型菌株，ΔΡΡ5代表本发明的工程菌株ΔΡΡ5, CP是回复菌株。
[0021] 图3与野生型菌株和回复菌株相比，工程菌株Δ PP5抗湿热和毒力的情况分析。WT 代表野生型菌株，ΔΡΡ5代表本发明的工程菌株ΔΡΡ5, CP是回复菌株。
[0022] 图4载体的结构示意图。
[0023] 图5菌株Δ PP5丝氨酸/苏氨酸蛋白酶基因被彻底敲除的PCR电泳验证图。WT代 表野生型菌株，ΔΡΡ5代表本发明的工程菌株ΔΡΡ5, CP是回复菌株。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。以下实施例仅限于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。
[0025] 实施例1敲除丝氨酸/苏氨酸蛋白酶基因载体和工程菌株Δ PP5的获得
[0026] I、绿僵菌丝氨酸/苏氨酸蛋白酶基因的获得
[0027] 1)绿僵菌丝氨酸/苏氨酸蛋白酶基因如SEQ ID NO. 1所示。
[0028] 2)设计丝氨酸/苏氨酸蛋白酶基因的3'端延伸片段为Ser/Thr左臂（序列如 SEQ ID NO. 3)和Y端延伸片段为Ser/Thr右臂（序列如SEQ ID NO. 2)。
[0029] 3)基于获得的左右臂序列设计引物。
[0030] 左臂引物F :
[0031] CGACGGCCAGTGCCAAGCTTGTGCTGGT