Y染色体azf区微缺失检测引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种采用gDNA或外周血游离DNA检测男性Y 染色体AZF区微缺失的引物系统及其应用。
【背景技术】
[0002] 有研究报告指出，不育夫妇占已婚育龄夫妇的15%，其中男性因素约占一半，而男 性不育症35%是由于遗传因素造成。Y染色体微缺失是除克式综合征外男性不育的最主要 遗传因素。Y染色体大量的重复序列和回文结构在维持Y染色体进化稳定性的同时，也使Y 染色体更容易发生结构重排，导致染色体部分缺失或重复。Y染色体微缺失主要发生在Y染 色体上的AZF(azoospermia factor)区。AZF区包括AZFa、AZFb、AZFc三个亚区，这些位置 包括许多与精子形成有关的基因，这些区域的完全缺失或部分缺失可引起男性精子发生障 碍、少精、弱精甚至无精症状。
[0003] 检测Y染色体AZF区微缺失现在已经成为男性不育专科的常规检查，可以为男性 不育患者找出病因，为遗传咨询提供依据；也为临床医生的诊断与后续治疗提供指导。所以 一种简单快速、准确度高且低成本的检测方法对临床具有重大意义。
[0004] 目前检测Y染色体AZF区微缺失的方法有很多，例如多重PCR、实时荧光PCR、 芯片杂交、MLPA等技术，最常用的是使用多重PCR扩增序列标签位点（Sequence Tagged Site, STS)。该方法选择AZFa、AZFb、AZFc区的STS序列进行PCR扩增，对扩增产物进行 电泳，根据条带的有无判断AZF各区是否发生缺失。欧洲男科协会（European Academy of Andrology，EAA)和欧洲分子遗传质控网（European Molecular Genetics Quality Network，EMQN)联合发布的《Y染色体微缺失分子诊断实践指南》推荐了多重PCR检测Y染 色体厶2卩区微缺失的6个5了5仏2卩3:8￥84,8丫86 42卩13:8￥127,8￥134 42卩。：8￥254,8￥255)。 在此基础上，各个检测实验室可选择性地增加 STS的数量进行更精确的检测。这种方法简 单易行，目前使用最广泛。但是这种方法扩增的STS位点较少（6个或以上），而且电泳只能 定性检测目的产物是否存在，不能检测拷贝数的变化，这对于Y染色体AZF区部分缺失的情 况可能检测不精确，所以这种方法在检测准确度和灵敏度上还有待提高。其中一个方法是 增加检测的STS数量，但这需要进行多次多重PCR反应，从而大大增加实验工作量和检测成 本。
[0005] 检测Y染色体AZF区微缺失还可以使用多重实时荧光PCR，这种方法简便快速更准 确，但是探针设计繁琐并且需要报告基团修饰，价格昂贵，不适合临床推广使用。
[0006] 有文献报导采用芯片杂交技术检测Y染色体AZF区微缺失，相比于多重PCR技术， 可以极大地提高检测的准确度和灵敏度。但缺点是该方法需要设计大量的探针，成本较高， 另外检测信号分析也较为复杂，不适合临床医生判读。
[0007] MRC-Holland 公司推出一款 SALSA MLPA probe-mix kit Ρ360-Α1 试剂盒，用于 Y 染色体AZF区微缺失的检测，通过杂交、连接手段获取探针相对拷贝数信号，并根据产物长 度识别对应探针，最终通过探针信号给出检测结论。该技术手段与芯片杂交技术一样，面临 着检测信号分析复杂的缺陷，另外由于需要根据产物长度识别探针，在探针设计和识别上 有着一定的局限性。
[0008] 综上所述，目前Y染色体AZF区微缺失的检测方法存在的缺陷主要有准确度和灵 敏度低、成本高、检测结果判读复杂等。因此亟需开发一种Y染色体AZF区微缺失检测的新 方法，来解决现有技术存在的上述不足。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种采用gDNA或外周血游离DNA检测Y染色体AZF区微缺 失的引物系统、检测试剂、试剂盒和检测方法，以克服上述现有技术方法所存在的不足。
[0010] 本发明的第一方面提供了一种检测Y染色体AZF区微缺失的引物组合物，其引物 位点包括至少6个Y染色体AZF区位点，以及至少一个Y染色体其他特异性区域的内参位 点。其中，根据每个引物位点的序列设计上、中、下游三条引物，每条引物长10~50bp，优选 为20bp ;每个引物位点的所述上、中、下游三条引物在参考基因组序列上自5'到3'方向是 连续的。所述参考基因组序列为hgl8或hgl9版本。
[0011] 优选地，所述引物的GC含量均为30 %~70%，更优选50 %。
[0012] 优选地，每个引物位点的所述中游和下游引物的5'端分别进行磷酸化修饰。
[0013] 优选地，每个引物位点的所述上游引物的5'端延伸15~30bp的保护序列，更优 选为20bp。
[0014] 优选地，每个引物位点的所述上游引物的5'端和下游引物的3'端分别延伸通用 扩增引物序列。
[0015] 本发明的引物系统的引物位点按照AZF区可划分到AZFa、AZFb及AZFc区的bl、 匕2、匕3、匕4、81、82、83、1'1、12、13、14、71、5^2等不同的亚区（如图2所示）。其中13、8、1'等 亚区是本发明用来判定AZFc区详细缺失信息的重要参考区域。
[0016] 在一个特定的实施方案中，针对Y染色体AZF区域和其他作为内部参考的特异性 区域（包括SRY基因、ZFY基因和TBLlY基因等）选定的148个引物位点，共设计了 148组 引物序列。这些引物序列的特点为：（1)每组引物均是以基因组上一段序列为模板来设计 三条连续的引物，这三条引物连接后形成PCR模板；（2)在正常人染色体目标区域，引物位 点序列存在已知且不变的拷贝数，且在目标区域之外的其他染色体区域不存在该序列；（3) 这些序列引物具有接近的退火温度，波动范围<5°C ; (4)与通用扩增引物序列不存在互补 性；（5)内参位点仅在目标区域唯一出现，在基因组其他区域不存在该位点。
[0017] 所述引物位点的上、中、下游三条引物的序列分别选自SEQ ID N0:n、SEQ ID NO: (n+148)、SEQ ID NO: (n+296)，其中 η 为 1 ~148 的自然数。
[0018] 最优实施方式中，所述引物组合物包括序列分别为SEQ ID N0:l-444的全部引物。
[0019] 本发明的第二方面提供了上述引物组合物组合物的用途。
[0020] 上述引物组合物可用于制备用于检测Y染色体AZF区微缺失的诊断试剂或试剂 盒。
[0021] 上述引物组合物可用于体外检测Y染色体AZF区微缺失。所述检测可以是诊断目 的（例如诊断男性不育等），也可以是非诊断目的（例如实验室研究等）。
[0022] 本发明的第三部分提供了一种检测Y染色体AZF区微缺失的检测试剂，其包括上 述引物组合物。
[0023] 本发明的第四部分提供了一种检测Y染色体AZF区微缺失的试剂盒，其包括上述 引物组合物。优选地，所述试剂盒还包括DNA提取试剂、通用PCR引物、DNA聚合酶、DNA连 接酶、末端转移酶、dNTPs、反应缓冲液、用于纯化PCR反应产物的磁珠及缓冲液；更优选地， 还包括阴性质控品和阳性质控品；最优选地，还包括用于高通量测序的试剂。所述的高通量 测序方法选自 Ion Torrent 的 PGM、Proton 或 Illumina 的 Hiseq、Miseq0
[0024] 本发明的第五方面提供了一种体外检测Y染色体AZF区微缺失的方法，其特征在 于，包括以下步骤：
[0025] (1)提取gDNA或外周血游离DNA作为模板；
[0026] (2)将本发明的引物组合物与DNA模板进行杂交反应；
[0027] (3)杂交产物进行连接反应；
[0028] (4)将连接产物进行纯化；
[0029] (5)将纯化后的产物进行PCR扩增，构建文库；
[0030] (6)将PCR扩增产物进行高通量测序；
[0031] (7)测序数据分析。
[0032] 优选地，包括以下步骤：
[0033] (1)分离、提取待检测样本的组织细胞gDNA或外周血的游离DNA片段；
[0034] (2)将样本DNA模板末端采用生物素标记，标记后的DNA模板和磁珠结合；
[0035] (3)将权利要求1-20任一项中定义的引物组合物与DNA模板进行杂交、连接反应， 反应产物进行扩增，扩增产物构成文库；
[0036] (4)将扩增产物进行高通量测序；
[0037] (5)数据分析：将测序数据进行目标区域的定位，即与用来设计引物的参考基因 组序列片段进行比对，根据比对结果计算每个目标区域的测序序列条数，根据目标区域的 测序序列条数计算AZF区各小区域的拷贝数信息，通过与正常人理论值比较分析拷贝数的 变化，从而判定AZF区微缺失检测信息。
[0038] 检测结论的判断标准如下：
[0039] (1)若AZFa区所有或部分位点拷贝数为0,其余区域位点拷贝数不变，则检测结论 为AZFa区缺失或部分缺失；
[0040] (2)若AZFb区的y3、y4、b5、b6和/或Ul亚区位点拷贝数变为0或部分拷贝数发 生变化，AZFa区及AZFc区位点拷贝数不变，则检测结论根据变化信息相应为AZFb区缺失 或部分缺失；
[0041] (3)若gl、g2、g3区位点拷贝数减少1/3~2/3，rl、r2、r3、r4区位点拷贝数减少 1/2以上，bl、b2、b3、b4区位点拷贝数减少l/4，yl、y2区位点拷贝数减少1/2,其余区域位 点拷贝数不变，则检测结论为gr/gr缺失；
[0042] (4)若 bl、b2、b3、b4 区位点拷贝数减少 1/2 左右，gl、g2、g3、rl、r2、r3、r4、yl、 y2、tl、t2区位点拷贝数为0,其余区域位点拷贝数不变，则检测结论为b2/b4缺失，亦称作 AZFc区缺失；
[0043] (5)若同时存在⑵与⑷的拷贝数变化信息，则检测结论为AZFb+c区缺失，具体 缺失的亚区区域可根据位点拷贝数变化来判定。
[0044] 所述检测可以是诊断目的（例如诊断男性不育等），也可以是非诊断目的（例如实