、AZFb、AZFc区拷贝数不变（如图5所示）。检测结论为该样本Y染色体AZF区正常， 造成患者少精症状的原因是AZF区之外的遗传因素或非遗传因素。
[0174] 实施例4外周血样本检测AZF区微缺失
[0175] -、材料：
[0176] 1.标本：样本来源为合作医院接诊的一位男性少精症患者的外周血样本，经医院 采用多重PCR技术检测为Y染色体AZFb+c区缺失。
[0177] 2.试剂：血液基因组DNA提取试剂盒、末端补平试剂盒、Qubitf) dsDNA HS分析 试剂盒、生物素、标记酶、标记酶反应液、超纯水、杂交缓冲液、杂交引物、DNA溶解液（Low TE)、连接酶、连接酶反应液、PCR反应液、标签接头、洗涤液、XP磁珠、异丙醇、无水乙醇、 Dynabcads?: MyOneTM Streptavidin Cl beads (Myone Cl 磁珠 ）、IM NaOH、Nuclease-free Water(not DEPC-treated)、Ion PGMTM Template 0T2 200Kit〇
[0178] 3.器材：高速冷冻离心机、水浴锅、超声打断仪Covaris M220、磁力架、PCR仪、Ion OneTouch? 2Instrument、Ion OneTouch? ES、Ion torrentPGM测序仪、Ion 316? Chip v2、 四维旋转混合仪、迷你离心机、漩涡振荡器、Qubit2. 0、移液器（1000/200/100/10/2. 5 μ L)。
[0179] 二、操作步骤：
[0180] 1.提取外周血样本中的基因组DNA。超声打断成150bp大小片段，按照下表配制 体系，室温静置20分钟补平末端。
[0182] 将完成补平的体系加入360 μ L XP磁珠，混匀后室温放置5分钟，磁吸待液体澄清 后弃上清，不取下离心管，加入75%乙醇500 μ L，来回倾斜磁力架冲洗磁珠表面5~10次， 吸弃液体后再重复清洗一遍。取下离心管瞬时离心，重新放置在磁力架上至液体澄清后弃 掉上清液，晾干磁珠，加入DNA溶解液，混匀后磁吸收集上清。
[0183] 2. DNA 标记
[0184] 按照下表制备反应体系，混匀后37°C温浴1小时。
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[0186] 3.标记产物的纯化
[0187] 加等体积异丙醇（预冷_20°C )，-70°C放置1小时以上或-20°C放置过夜， 4°〇13000印111离心40111；[11。用300 4 1^新鲜配制的75%乙醇洗涤沉淀，4°0 13000印1]1离心 8min，弃上清。共洗两次。室温晾干沉淀后用13 μ L DNA溶解液溶解DNA。
[0188] 4.杂交
[0189] 准备Myone Cl磁珠：（提前30min取出Myone Cl磁珠室温孵育）漩祸振荡大于 30s彻底混匀，取10 μ L磁珠移到一个新的PCR管中，磁吸3min，弃上清5 μ L，备用。按照下 表混合反应体系，轻轻混匀（避免产生气泡），PCR仪上95°C反应5min，反应结束后迅速冰 置 IOmin0
[0191] 冰置结束后，瞬时离心，将反应液加入准备好的Myone Cl磁珠中，漩涡振荡30s混 匀，避免有气泡，室温22~25°C (室温不能低于20°C，最高不能超过27°C )轻轻旋转混合 2h〇
[0192] 5.杂交产物的纯化
[0193] 将PCR管置于磁力架上磁吸3min，待液体澄清后弃上清，取下PCR管（切勿使磁珠 干燥）。加50 yL洗涤液，吹吸混匀，磁吸后弃上清，取下离心管（切勿使磁珠干燥）。共洗 涤3次。加入45 μ L DNA溶解液重悬磁珠。
[0194] 6.连接
[0195] 将下表的连接体系置于PCR仪上，37°C反应1小时。
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[0197] 7.连接产物的纯化
[0198] 将完成连接反应的PCR管置于磁力架上磁吸3min，液体澄清后弃上清，取下PCR管 (切勿使磁珠干燥）。加50 μ L洗涤液，吹吸混匀，磁吸后弃上清，取下离心管。共洗涤2次。 加入23 μ L DNA溶解液重悬磁珠，PCR仪上95°C变性3min，立即放到磁力架上磁吸，吸取上 清液移至新的PCR管中。
[0199] 8. PCR
[0200] 按照表格加反应体系。
[0204] 9. PCR产物的纯化
[0205] 将XP磁珠提前30min取出平衡至室温，漩涡振荡30s以上，各取20 μ L、97 μ L放入 新的EP管中并做好标记。取45 μ L PCR产物加入20 μ L XP磁珠中，混匀后室温放置5min。 磁吸3~5min，待液体彻底澄清后取上清62 μ L到97 μ L XP磁珠中，混匀后室温放置5min。 磁吸待液体澄清后弃上清，不取下离心管，加入75 %乙醇150 μ L，来回倾斜磁力架，使液体 冲洗XP磁珠的表面5~10次，并在Imin内吸弃液体。共洗两次。取下离心管瞬时离心， 再重新放置在磁力架上，至液体澄清时弃掉上清。晾干磁珠，加入15 μ L DNA溶解液，混匀 后室温放置3~5min，磁吸后将上清（即文库）转移至新的EP管中。
[0206] 10.文库测序
[0207] 取2以1^文库用〇1*^2.0进行浓度测定。将文库稀释至18?111〇1/^1^经用1〇11?61? Template 0T2 200Kit制备成乳液PCR样本，Ion OneTouch? ES上进行产物富集后在Ion Torrent PGM (life technology)上测序。
[0208] 11.数据分析
[0209] 首先过滤低质量测序序列，去掉小于70bp的测序片段，将过滤后的序列比对到 148个用来设计引物的参考基因组序列片段，计算这148个目标区域的总测序序列条数N和 各自的测序序列条数Ni。
[0210] 利用10个内部参考区域的引物序列条数的均值N0,将138个AZF区域的引物序列 条数进行均一化，公式为：Ci = Ni/N0。
[0211] 根据每个引物的Ci值，计算AZF区划分的每个小区的均值，即得到待检测样本AZF 区各小区的真实拷贝数信息，例如g区有10个引物位点，对应的Ci值分别为gl、g2、g3… gl〇,则g区拷贝数：
[0212] 通过待检测样本AZF区各小区的真实拷贝数信息与理论值的变化比较，发现AZFb 区内b5、b6、ul等区及AZFc区内b、g、r等区拷贝数均变为0，AZFa拷贝数不变（如图6所 示）。检测结论为该样本Y染色体AZF区发生AZFb+c区缺失。
【主权项】
1. 一种检测Y染色体AZF区微缺失的引物组合物，其特征在于，引物位点包括至少6个 Y染色体AZF区位点，以及至少一个Y染色体其他特异性区域的内参位点。2. 权利要求1的引物组合物，其中，根据每个引物位点的序列设计上、中、下游三条引 物，每条引物长l〇~50bp，优选为20bp;每个引物位点的所述上、中、下游三条引物在参考基 因组序列上自5'到3'方向是连续的。3. 权利要求2的引物组合物，其中，所述引物的GC含量均为30%~70%，优选50%。4. 权利要求2的引物组合物，其中，每个引物位点的所述中游和下游引物的5'端分别 进行磷酸化修饰。5. 权利要求2的引物组合物，其中，每个引物位点的所述上游引物的5'端延伸15~30bp 的保护序列，优选为20bp。6. 权利要求2的引物组合物，其中，每个引物位点的所述上游引物的5'端和下游引物 的3'端分别延伸通用扩增引物序列。7. 权利要求2-6任一项的引物组合物，其中，所述参考基因组序列为hgl8或hgl9版 本。8. 权利要求1的引物组合物，其中，所述引物位点的序列与通用扩增引物序列不存在 互补性。9. 权利要求1的引物组合物，其中，所述的AZF区引物位点覆盖AZFa区，以及AZFbc区 的y、b、g、r、t、g亚区。10. 权利要求I的引物组合物，其中，所述的AZF区引物位点在该区域存在已知拷贝数 且在正常人AZF区域里拷贝数固定不变，AZF区域之外的基因组其他区域不存在该位点。11. 权利要求1的引物组合物，其中，所述的内参位点选自SRY基因、ZFY基因和TBLlY 基因区域。12. 权利要求1的引物组合物，其中，所述的内参位点仅在目标区域唯一出现，在基因 组其他区域不存在该位点。13. 权利要求2-6任一项的引物组合物，所述引物位点的上、中、下游三条引物的序列 分别选自SEQIDNO:n、SEQIDNO: (n+148)、SEQIDNO: (n+296)，其中n为 1~148 的自 然数。14. 权利要求13的引物组合物，包括序列分别为SEQIDNO: 1-444的全部引物。15. 权利要求14的引物组合物，由序列分别为SEQIDNO: 1-444的引物组成。16. 权利要求1-15任一项的引物组合物在制备用于检测Y染色体AZF区微缺失的诊断 试剂中的应用。17. 权利要求1-15任一项的引物组合物在制备用于检测Y染色体AZF区微缺失的试剂 盒中的应用。18. 权利要求1-15任一项的引物组合物在体外非诊断目的检测Y染色体AZF区微缺失 中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种检测Y染色体AZF区微缺失的引物组合物。针对Y染色体AZF区域和其他作为内部参考的特异性区域选定的引物位点设计了引物序列，这些引物序列的特点为：（1）每组引物均是以基因组上一段序列为模板来设计三条连续的引物，这三条引物连接后形成PCR模板；（2）在正常人染色体目标区域，引物位点序列存在已知且不变的拷贝数，且在目标区域之外的其他染色体区域不存在该序列；（3）这些序列引物具有接近的退火温度，波动范围<5℃；（4）与通用扩增引物序列不存在互补性；（5）内参位点仅在目标区域唯一出现，在基因组其他区域不存在该位点。还提供了所述引物组合物的用途。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105176992
【申请号】
【发明人】费嘉
【申请人】北京中仪康卫医疗器械有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月19日