验室研究等）。
【附图说明】
[0045] 图1本发明的设计流程图。首先提取DNA模板，然后进行杂交、连接反应，并对产物 进行纯化，之后进行PCR扩增并采用高通量测序技术对文库进行测序，最后分析测序数据。
[0046] 图2目标检测区域的详细亚区划分。Y染色体AZF区可详细划分为AZFa、AZFbc区 的y、b、g、r、t、grey等不同的亚区，有的亚区可能存在顺式重复或回文重复区域，例如gl、 g2、g3三个重复区。
[0047] 图3实施例1的拷贝数变化信息。
[0048] 图4实施例2的拷贝数变化信息。
[0049] 图5实施例3的拷贝数变化信息。
[0050] 图6实施例4的拷贝数变化信息。
【具体实施方式】
[0051] 下面将对本发明实施例中的方案进行清楚完整的描述，但本发明并不受其限制， 所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，基于本发明的实施例，本领域技术人员所 获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围；同样地，实施例的附图仅仅是本发明一 部分实施例的附图，本领域技术人员根据这些附图所获得的其他附图，也都属于本发明的 保护范围。
[0052] 下列实施例中使用的杂交引物为表1所示的引物组合物（其中，上游引物序列分 别为SEQ ID NO: 1-148,中游引物序列分别为SEQ ID NO: 149-296,下游引物序列分别为SEQ ID NO: 297-444)，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议 的条件。
[0053] 表1杂交引物序列
[0054] CN 105176992 A 说明书 5/21 页
CN 105176992 A 说明书 7/21 页
CN 105176992 A 说明书 8/21 页
[0058] 实施例1毛囊样本检测AZF区微缺失
[0059] 一、材料：
[0060] 1.标本：样本来源为合作医院接诊的一位男性少精症患者的毛囊样本，经医院采 用多重PCR技术检测为Y染色体AZFc区缺失。
[0061] 2.试剂：微量基因组DNA提取试剂盒、末端补平试剂盒、Qubit? dsDNA HS分析 试剂盒、生物素、标记酶、标记酶反应液、超纯水、杂交缓冲液、杂交引物、DNA溶解液（Low TE)、连接酶、连接酶反应液、PCR反应液、标签接头、洗涤液、XP磁珠、异丙醇、无水乙醇、 DynabeadsB' MyOneTM Streptavidin Cl beads (Myone Cl 磁珠 ）、IM NaOH、Nuclease_free ffater(not DEPC-treated) >Ion PGMTM Template 0T2 200Kit〇
[0062] 3.器材：高速冷冻离心机、水浴锅、超声打断仪Covaris M220、磁力架、PCR仪、Ion OneTouch? 2Instrument、Ion OneTouch? ES、Ion torrentPGM测序仪、Ion 316? Chip v2、 四维旋转混合仪、迷你离心机、漩涡振荡器、Qubit2. 0、移液器（1000/200/100/10/2. 5 μ L)。
[0063] 二、操作步骤：
[0064] 1.提取毛囊样本中的基因组DNA。超声打断成150bp大小片段，按照下表配制体 系，室温静置20分钟补平末端。
[0066] 将完成补平的体系加入360 μ L XP磁珠，混匀后室温放置5分钟，磁吸待液体澄清 后弃上清，不取下离心管，加入75%乙醇500 μ L，来回倾斜磁力架冲洗磁珠表面5~10次， 吸弃液体后再重复清洗一遍。取下离心管瞬时离心，重新放置在磁力架上至液体澄清后弃 掉上清液，晾干磁珠，加入DNA溶解液，混匀后磁吸收集上清。
[0067] 2. DNA 标记
[0068] 按照下表制备反应体系，混匀后37°C温浴1小时。
[0070] 3.标记产物的纯化
[0071] 加等体积异丙醇（预冷_20°C )，_70°C放置1小时以上或_20°C放置过夜， 4°C 13000rpm离心40min。用300 μ L新配制的75%乙醇洗涤沉淀，4°C 13000rpm离心8min， 弃上清。共洗两次。室温晾干沉淀后用13 μ L DNA溶解液溶解DNA。
[0072] 4.杂交
[0073] 准备Myone Cl磁珠：（提前30min取出Myone Cl磁珠室温孵育）漩祸振荡大于 30s彻底混匀，取10 μ L磁珠移到一个新的PCR管中，磁吸3min，弃上清5 μ L，备用。按照下 表混合反应体系，轻轻混匀（避免产生气泡），PCR仪上95°C反应5min，反应结束后迅速冰 置 IOmin0
[0075] 冰置结束后，瞬时离心，将反应液加入准备好的Myone Cl磁珠中，漩涡振荡30s混 匀，避免有气泡，室温22~25°C (室温不能低于20°C，最高不能超过27°C )轻轻旋转混合 2h〇
[0076] 5.杂交产物的纯化
[0077] 将PCR管置于磁力架上磁吸3min，待液体澄清后弃上清，取下PCR管（切勿使磁珠 干燥）。加50 yL洗涤液，吹吸混匀，磁吸后弃上清，取下离心管（切勿使磁珠干燥）。共洗 涤3次。加入45 μ L DNA溶解液重悬磁珠。
[0078] 6·连接
[0079] 将下表的连接体系置于PCR仪上，37°C反应1小时。
[0081] 7.连接产物的纯化
[0082] 将完成连接反应的PCR管置于磁力架上磁吸3min，液体澄清后弃上清，取下PCR管 (切勿使磁珠干燥）。加50 μ L洗涤液，吹吸混匀，磁吸后弃上清，取下离心管。共洗涤2次。 加入23 μ L DNA溶解液重悬磁珠，PCR仪上95°C变性3min，立即放到磁力架上磁吸，吸取上 清液体至新的PCR管中。
[0083] 8. PCR
[0084] 按照下表加反应体系：
CN 105176992 A 说明书 11/21 页
[0087] 按照下述程序进行反应:
[0089] 9. PCR产物的纯化
[0090] 将XP磁珠提前30min取出平衡至室温，漩涡振荡30s以上，各取20 μ L、97 μ L放入 新的EP管中并做好标记。取45 μ L PCR产物加入20 μ L XP磁珠中，混匀后室温放置5min。 磁吸3~5min，待液体彻底澄清后取上清62 μ L到97 μ LXP磁珠中，混匀后室温放置5min。 磁吸待液体澄清后弃上清，不取下离心管，加入75 %乙醇150 μ L，来回倾斜磁力架，使液体 冲洗XP磁珠的表面5~10次，并在Imin内吸弃液体。共洗两次。取下离心管瞬时离心， 再重新放置在磁力架上，至液体澄清时弃掉上清。晾干磁珠，加入15 μ L DNA溶解液，混匀 后室温放置3~5min，磁吸后将上清（即文库）转移至新的EP管中。
[0091] 10.文库测序
[0092] 取2以1^文库用如1^丨2.0进行浓度测定。将文库稀释至18?111〇1/^1^经用1〇11?61? Template 0T2 200Kit制备成乳液PCR样本，Ion OneTouchTM ES上进行产物富集后在Ion Torrent PGM (life technology)上测序。
[0093] 11.数据分析
[0094] 首先过滤低质量测序序列，去掉小于70bp的测序片段，将过滤后的序列比对到 148个用来设计引物的参考基因组序列片段，计算这148个目标区域的总测序序列条数N和 各自的测序序列条数Ni。
[0095] 利用10个内部参考区域的引物序列条数的均值N0,将138个AZF区域的引物序列 条数进行均一化，公式为：Ci = Ni/N0。
[0096] 根据每个引物的Ci值，计算AZF区划分的每个小区的均值，即得到待检测样本AZF 区各小区的真实拷贝数信息，例如g区有10个引物位点，对应的Ci值分别为gl、g2、g3… gl〇,则g区拷贝数
[0097] 通过待检测样本AZF区各小区的真实拷贝数信息与理论值的变化比较，发现AZFc 区内g、r区拷贝数变为0, b区拷贝数减少一半，而AZFa和AZFb区拷贝数不变（如图3所 示）。检测结论为该样本Y染色体AZF区发生b2/b4缺失。
[0098] 实施例2外周血样本检测AZF区微缺失
[0099] -、材料：
[0100] 1.标本：样本来源为合作医院接诊的一位男性少精症患者的外周血样本，经医院 采用多重PCR技术检测为Y染色体AZFc区部分缺失。
[0101] 2.试剂：血浆DNA提取试剂盒、Qubit? dsDNA HS分析试剂盒、生物素、标记 酶、标记酶反应液、超纯水、杂交缓冲液、杂交引物、DNA溶解液（Low TE)、连接酶、连 接酶反应液、PCR反应液、标签接头、洗涤液、XP磁珠、异丙醇、无水乙醇、Dynabeads? MyOneTM Streptavidin Cl beads (Myone Cl 磁珠 ）、IM NaOH、Nuclease-free Water (not DEPC-treated)、Ion PGMTM Template 0T2 200Kit〇
[0102] 3.器材：高速冷冻离心机、水浴锅、磁力架、PCR仪、Ion OneTouch? 2Instrument、 Ion OneTouch? ES、Ion torrentPGM 测序仪、Ion 316? Chip v2、四维旋转混合仪、迷你离 心机、漩涡振荡器、Qubit2. 0、移液器（1000/200/100/10/2. 5 μ L)。
[0103] 二、操作步骤：
[0104] 1.用血浆DNA提取试剂盒提取血浆DNA。
[0105] 2. DNA 标记
[0106] 按照下表制备反应体系，混匀后37°C温浴1小时。
[0108] 3.标记产物的纯化
[0109] 加等体积异丙醇（预冷_20°C )，-70°C放置1小时以上或-20°C放置过夜， 4°〇13000印111离心40111；[11。用300 4 1^新鲜配制的75%乙醇洗涤沉淀，4°0