13000印1]1离心 8min，弃上清。共洗两次。室温晾干沉淀后用13 μ L DNA溶解液溶解DNA。
[0110] 4.杂交
[0111] 准备Myone Cl磁珠：（提前30min取出Myone Cl磁珠室温孵育）漩祸振荡大于 30s彻底混匀，取10 μ L磁珠移到一个新的PCR管中，磁吸3min，弃上清5 μ L，备用。按照下 表混合反应体系，轻轻混匀（避免产生气泡），PCR仪上95°C反应5min，反应结束后迅速冰 置 IOmin0 CN 105176992 A 说明书 13/21 页
[0113] 冰置结束后，瞬时离心，将反应液加入准备好的Myone Cl磁珠中，漩涡振荡30s混 匀，避免有气泡，室温22~25°C (室温不能低于20°C，最高不能超过27°C )轻轻旋转混合 2h〇
[0114] 5.杂交产物的纯化
[0115] 将PCR管置于磁力架上磁吸3min，待液体澄清后弃上清，取下PCR管（切勿使磁珠 干燥）。加50 yL洗涤液，吹吸混匀，磁吸后弃上清，取下离心管（切勿使磁珠干燥）。共洗 涤3次。加入45 μ L DNA溶解液重悬磁珠。
[0116] 6.连接
[0117] 将下表的连接体系置于PCR仪上，37°C反应1小时。
[0119] 7.连接产物的纯化
[0120] 将完成连接反应的PCR管置于磁力架上磁吸3min，液体澄清后弃上清，取下PCR管 (切勿使磁珠干燥）。加50 μ L洗涤液，吹吸混匀，磁吸后弃上清，取下离心管。共洗涤2次。 加入23 μ L DNA溶解液重悬磁珠，PCR仪上95°C变性3min，立即放到磁力架上磁吸，吸取上 清液移至新的PCR管中。
[0121] 8. PCR
[0122] 按照表格加反应体系。
CN 105176992 A 说明书 14/21 页
[0125] 按照下述程序进行反应。
[0127] 9. PCR产物的纯化
[0128] 将XP磁珠提前30min取出平衡至室温，漩涡振荡30s以上，各取20 μ L、97 μ L放入 新的EP管中并做好标记。取45 μ L PCR产物加入20 μ L XP磁珠中，混匀后室温放置5min。 磁吸3~5min，待液体彻底澄清后取上清62 μ L到97 μ L XP磁珠中，混匀后室温放置5min。 磁吸待液体澄清后弃上清，不取下离心管，加入75 %乙醇150 μ L，来回倾斜磁力架，使液体 冲洗XP磁珠的表面5~10次，并在Imin内吸弃液体。共洗两次。取下离心管瞬时离心， 再重新放置在磁力架上，至液体澄清时弃掉上清。晾干磁珠，加入15 μ L DNA溶解液，混匀 后室温放置3~5min，磁吸后将上清（即文库）转移至新的EP管中。
[0129] 10.文库测序
[0130] 取2以1^文库用如1^丨2.0进行浓度测定。将文库稀释至18?111〇1/^1^经用1〇11?61? Template 0T2 200Kit制备成乳液PCR样本，Ion OneTouch? ES上进行产物富集后在Ion Torrent PGM (life technology)上测序。
[0131] IL数据分析
[0132] 首先过滤低质量测序序列，去掉小于70bp的测序片段，将过滤后的序列比对到 148个用来设计引物的参考基因组序列片段，计算这148个目标区域的总测序序列条数N和 各自的测序序列条数Ni。
[0133] 利用10个内部参考区域的引物序列条数的均值N0,将138个AZF区域的引物序列 条数进行均一化，公式为：Ci = Ni/N0。
[0134] 根据每个引物的Ci值，计算AZF区划分的每个小区的均值，即得到待检测样本AZF 区各小区的真实拷贝数信息，例如g区有10个引物位点，对应的Ci值分别为gl、g2、g3… m γτΜ rrr-H/ rrtw. /n.龄懒:續+~相癒 glO,则g区拷贝数：G=-^-。
[0135] 通过待检测样本AZF区各小区的真实拷贝数信息与理论值的变化比较，发现AZFc 区内g区拷贝数变为〇,而r区存在近1/4的拷贝数，判定b2/b3发生倒位；同时发现b区 拷贝数减少一半，AZFa和AZFb区拷贝数不变（如图4所示）检测结论为该样本Y染色体 AZF区发生b2/b3倒位后gl/b4区缺失。
[0136] 实施例3外周血样本检测AZF区微缺失
[0137] 一、材料：
[0138] 1.标本：样本来源为合作医院接诊的一位男性少精症患者的外周血样本，经医院 采用多重PCR技术检测为Y染色体AZF区正常。
[0139] 2.试剂：血浆DNA提取试剂盒、Qubi丨S. dsDNA HS分析试剂盒、生物素、标记 酶、标记酶反应液、超纯水、杂交缓冲液、杂交引物、DNA溶解液（Low TE)、连接酶、连 接酶反应液、PCR反应液、标签接头、洗涤液、XP磁珠、异丙醇、无水乙醇、Dyrmkxuis?' MyOneTM Streptavidin Cl beads (Myone Cl 磁珠 ）、IM NaOH、Nuclease-free Water (not DEPC-treated)、Ion PGMTM Template 0T2 200Kit〇
[0140] 3.器材：高速冷冻离心机、水浴锅、磁力架、PCR仪、Ion OneTouch? 2Instrument、 Ion OneTouch? ES、Ion torrentPGM 测序仪、Ion 316? Chip v2、四维旋转混合仪、迷你离 心机、漩涡振荡器、Qubit2. 0、移液器（1000/200/100/10/2. 5 μ L)。
[0141] 二、操作步骤：
[0142] 1.用血浆DNA提取试剂盒提取血浆DNA。
[0143] 2. DNA 标记
[0144] 按照下表制备反应体系，混匀后37°C温浴1小时。
[0146] 3.标记产物的纯化
[0147] 加等体积异丙醇（预冷_20°C )，-70°C放置1小时以上或-20°C放置过夜， 4°〇13000印111离心40111；[11。用300 4 1^新鲜配制的75%乙醇洗涤沉淀，4°0 13000印1]1离心 8min，弃上清。共洗两次。室温晾干沉淀后用13 μ L DNA溶解液溶解DNA。
[0148] 4.杂交
[0149] 准备Myone Cl磁珠：（提前30min取出Myone Cl磁珠室温孵育）漩祸振荡大于 30s彻底混匀，取10 μ L磁珠移到一个新的PCR管中，磁吸3min，弃上清5 μ L，备用。按照下 表混合反应体系，轻轻混匀（避免产生气泡），PCR仪上95°C反应5min，反应结束后迅速冰 置 IOmin0
[0150] CN 105176992 A 说明书 16/21 页
[0151] 冰置结束后，瞬时离心，将反应液加入准备好的Myone Cl磁珠中，漩涡振荡30s混 匀，避免有气泡，室温22~25°C (室温不能低于20°C，最高不能超过27°C )轻轻旋转混合 2h〇
[0152] 5.杂交产物的纯化
[0153] 将PCR管置于磁力架上磁吸3min，待液体澄清后弃上清，取下PCR管（切勿使磁珠 干燥）。加50 yL洗涤液，吹吸混匀，磁吸后弃上清，取下离心管（切勿使磁珠干燥）。共洗 涤3次。加入45 μ L DNA溶解液重悬磁珠。
[0154] 6.连接
[0155] 将下表的连接体系置于PCR仪上，37°C反应1小时。
[0157] 7.连接产物的纯化
[0158] 将完成连接反应的PCR管置于磁力架上磁吸3min，液体澄清后弃上清，取下PCR管 (切勿使磁珠干燥）。加50 μ L洗涤液，吹吸混匀，磁吸后弃上清，取下离心管。共洗涤2次。 加入23 μ L DNA溶解液重悬磁珠，PCR仪上95°C变性3min，立即放到磁力架上磁吸，吸取上 清液移至新的PCR管中。
[0159] 8. PCR
[0160] 按照表格加反应体系。
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[0163] 按照下述程序进行反应。
[0165] 9. PCR产物的纯化
[0166] 将XP磁珠提前30min取出平衡至室温，漩涡振荡30s以上，各取20 μ L、97 μ L放入 新的EP管中并做好标记。取45 μ L PCR产物加入20 μ L XP磁珠中，混匀后室温放置5min。 磁吸3~5min，待液体彻底澄清后取上清62 μ L到97 μ L XP磁珠中，混匀后室温放置5min。 磁吸待液体澄清后弃上清，不取下离心管，加入75 %乙醇150 μ L，来回倾斜磁力架，使液体 冲洗XP磁珠的表面5~10次，并在Imin内吸弃液体。共洗两次。取下离心管瞬时离心， 再重新放置在磁力架上，至液体澄清时弃掉上清。晾干磁珠，加入15 μ L DNA溶解液，混匀 后室温放置3~5min，磁吸后将上清（即文库）转移至新的EP管中。
[0167] 10.文库测序
[0168] 取2以1^文库用〇1*^2.0进行浓度测定。将文库稀释至18?111〇1/^1^经用1〇11?61? Template 0T2 200Kit制备成乳液PCR样本，Ion OneTouch? ES上进行产物富集后在Ion Torrent PGM (life technology)上测序。
[0169] 11.数据分析
[0170] 首先过滤低质量测序序列，去掉小于70bp的测序片段，将过滤后的序列比对到 148个用来设计引物的参考基因组序列片段，计算这148个目标区域的总测序序列条数N和 各自的测序序列条数Ni。
[0171] 利用10个内部参考区域的引物序列条数的均值N0,将138个AZF区域的引物序列 条数进行均一化，公式为：Ci = Ni/N0。
[0172] 根据每个引物的Ci值，计算AZF区划分的每个小区的均值，即得到待检测样本AZF 区各小区的真实拷贝数信息，例如g区有10个引物位点，对应的Ci值分别为gl、g2、g3… gl〇,则 g 区拷贝数：
[0173] 通过待检测样本AZF区各小区的真实拷贝数信息与理论值的变化比较，发现 AZFa