GTTGCCTTGTG
[0032] 左臂引物R :
[0033] ACCTGCAGCCCGGGGGATCCTGCGAGGCGGCGGCCGAAGGC
[0034] 右臂引物F :
[0035] CTGGCCGCCCATGGGATATCAACCACAAGATGAATAAGAT
[0036] 右臂引物R :
[0037] CTATGACATGATTACGAATTCCCACGTAGCCATCCAACCGC
[0038] 所述引物的下划线部分为接头序列
[0039] 4)用PCR扩增获得的左、右臂核苷酸分子（带有接头序列）分别为1531bp和 1240bp〇
[0040] 5)左右臂核苷酸分子连接到带有抗性筛选基因的载体（见图4)上，并且左右臂在 筛选基因的上下游，Ser/Thr右臂和Ser/Thr左臂分别位于Bar基因 Y端和:V端。获得 敲除载体（序列如SEQ ID NO. 4)。
[0041] II、工程菌株ΔΡΡ5的获得：
[0042] 1)将构建的敲除载体经过电击转入农杆菌。
[0043] 2)将农杆菌和野生型绿僵菌共培养，经过草铵膦抗性药物筛选和Southern blotting验证而获得工程菌株Δ PP5,酶切后的Southern blotting验证图5表明绿僵菌 中丝氨酸/苏氨酸蛋白酶基因被彻底敲除。
[0044] 实施例2 :工程菌株Δ PP5产孢能力
[0045] U1/4SDA培养基上产孢能力
[0046] 将工程菌株ΔΡΡ5、野生型菌株和回复菌株成熟的孢子用石蜡油配制成IX IO7个 /mL的孢悬液。取2uL的孢悬液点滴到24孔板中的1/4SDA固体培养基上，然后将24孔板 置于28°C的培养箱中培养，每三天取出工程菌株ΔΡΡ5、野生型菌株和回复菌株孔中的绿 僵菌个三个，用血球计数版计数，测得各个菌株的产孢量。产孢量的分析比较如图1所示， 敲除菌株在第9天时最大产孢量是10. 07 X IO7个/cm2，野生菌株是4. 63 X IO7个/cm2，敲除 菌株的产孢量是野生型的2. 2倍。
[0047] 实施例3 :工程菌株Δ PP5抗紫外能力
[0048] 将工程菌株ΔΡΡ5、野生型菌株和回复菌株成熟的孢子用石蜡油配制成IX IO7个 /mL的孢悬液。取IOOuL孢悬液均匀涂布到含有1/4SDA培养基的平板上，然后将平板置于 768mWm 2UV-B环境中照射3,6,9和12小时，然后将培养皿放置在28°C的培养箱中培养24 小时。紫外照射后的绿僵菌孢子培养24小时后，对其萌发率进行测定；同时对紫外照射的 孢子的细胞核用DAPI染色，在荧光显微镜下观察细胞核的损伤状况，并对DNA的破碎化进 行量化分析，抗紫外能力的分析比较结果如图2所示，野生型的半致死时间是LDm= 4. 52 小时，敲除菌株的半致死时间是LD5。= 6. 64小时；紫外照射后培养24小时，野生型的DNA 破碎化为11. 08%，而敲除菌株的为9. 28%。
[0049] 实施例4 :工程菌株Δ PP5抗湿热和毒力不受影响
[0050] 1工程菌株Δ PP5抗湿热能力分析
[0051] 湿热处理是将I X IO7个孢子/ml的绿僵菌的孢悬液进行45°C分别处理2h、4h、6h 和8h，然后取用80 μ 1分别涂布到1/4SDA培养基上，置于8°C的培养箱中培养24h，最后分 别测他们的萌发率。抗湿热的数据结果表明抗湿热逆境方面与野生型和回复菌株无显著性 差异，结果如图3A和B所示，野生型的抗湿热LD5。= 4. 31小时，敲除菌株的抗湿热LD 5。= 4. 18小时，统计学分析无差异。
[0052] 2工程菌株Δ PP5毒力分析
[0053] 以3日龄（蜕皮后第三天）的五龄、大小均一、健康状况一致的东亚飞蝗为生测 对象，以野生型和敲除菌株分别为生测菌株，无菌水为对照，点滴方式验证工程菌株A PP5 的杀虫效应。通过体表侵染后工程菌株ΔΡΡ5的毒力与野生型和回复菌株无显著性差 异，他们的半致死时间分别是 WLTm= 5. 49±0. 30, CPLTm= 5. 12±0. 17 和 APP5LT5。= 5. 10±0. 15天，统计分析表明他们的半致死时间无显著性差异，说明敲除之后不影响绿僵 菌的毒力，结果如图3C和D所示。
【主权项】
1. 一种核酸分子，含有绿僵菌苏氨酸/丝氨酸蛋白磷酸酶基因（Ser/ThrPhosphatase 5,PP5)的5'端延伸片段和3'端延伸片段；所述5'端延伸片段为苏氨酸/丝氨酸蛋白 磷酸酶基因上游的Ser/Thr右臂，3'端延伸片段为苏氨酸/丝氨酸蛋白磷酸酶基因下游的 Ser/Thr左臂。2. 如权利要求1所述的核酸分子，所述5'端延伸片段如SEQIDNO. 2所示；3'端延 伸片段如SEQIDNO. 3所示。3. -种载体，含有权利要求1或2所述的核酸分子；含有Bar基因，Ser/Thr右臂和 Ser/Thr左臂分别位于Bar基因Y端和:V端。4. 如权利要求3所述的载体，其结构如图4所示。5. 如权利要求3所述的载体，其序列如SEQIDNO. 4所示。6. 如权利要求1或2所述核酸分子，或权利要求3、4或5所述载体在敲除绿僵菌的苏 氨酸/丝氨酸蛋白磷酸酶基因中的应用。7. -种菌株，采用权利要求1或2所述核酸分子，或权利要求3、4或5所述载体制备而 成。8. 如权利要求7所述的菌株，其制备方法包括以下步骤：将含有权利要求1或2所述 核酸分子的载体电击转入农杆菌，然后将农杆菌和绿僵菌共培养，经过抗性培养基的筛选 而获得具有产孢快、产孢量高和抗紫外的绿僵菌菌株APP5。9. 如权利要求7或8所述的菌株在防治有害昆虫中的应用。10. 如权利要求7或8所述的菌株在防治有害昆虫中的应用，包括以下步骤：将APP5 孢子配制成石蜡油悬浮液，菌悬液制剂用于防治有害昆虫。
【专利摘要】本发明提供了一种核酸分子，含有绿僵菌苏氨酸/丝氨酸蛋白磷酸酶基因（Ser/Thr？Phosphatase？5，PP5）的5′端延伸片段和3′端延伸片段；所述5′端延伸片段为苏氨酸/丝氨酸蛋白磷酸酶基因上游的Ser/Thr右臂，3′端延伸片段为苏氨酸/丝氨酸蛋白磷酸酶基因下游的Ser/Thr左臂。其可用于制备苏氨酸/丝氨酸蛋白磷酸酶基因缺失菌株，提高绿僵菌产孢速度、产孢量和孢子抗紫外能力。
【IPC分类】A01P7/04, C12N15/80, C12N1/15, C12N15/11, A01N63/04
【公开号】CN105176993
【申请号】
【发明人】夏玉先, 张 杰, 王正龙, 彭国雄
【申请人】夏玉先, 重庆大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月20日