专利名称：癌症靶向肽及其在癌症治疗中的用途的制作方法
癌症靶向肽及其在癌症治疗中的用途相关申请案本申请要求2009年2月19日申请的美国临时申请案第61/153，725号的优先权， 该案内容以全文引用的方式并入本文中。
背景技术：
靶向药物递送将明显改进癌症疗法的功效。完成这一任务的关键是鉴别特异性靶向癌细胞的药剂。发明_既述本发明是基于一个意外发现，S卩，许多肽，包括QNIYAGVPMISF(SEQ ID NO :1)、 EATNSHGSRTMG(SEQ ID NO 2),TVSffSTTGRIPL(SEQ ID NO :3)、QLEFYTQLAHLI(SEQ ID NO 4) 和SMDPFLFQLLQL(SEQ ID NO :5)，可特异性靶向乳腺癌细胞，由此便于将药物递送到乳腺肿瘤部位。因此，本发明一方面特征在于乳腺癌靶向肽，其包括氨基酸序列SEQ ID NO 1-5中之一。这些肽中的任何肽都可与用于治疗乳腺癌的抗癌药物缀合。在一个实例中，将抗乳腺癌药物是封装于微粒(例如脂质体)中。示范性抗癌药物包括但不限于多柔比星(doxorubicin)、他莫昔芬(tamoxifen)、长春瑞宾(vinorelbine)、长春新碱 (vincristine)、紫杉醇(paclitaxel)、勒托替康(Iurtotecan)、多烯紫杉醇(docetaxel)、 亚德利亚霉素(adriamycin)、表柔比星(印irubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、丝裂霉素(mitomycin)、吉西他宾(gemcitabine)、顺钼(cisplatin)、奥沙利钼(oxaliplatin)、长春花碱(vinblastine)、5-FU、UFUR、阿那曲唑(anastrozole)、雷曲唑(Ietrozole)和依西美坦(exemestane)。本发明另一方面特征在于一种通过对患有乳腺癌的个体(例如人类乳腺癌患者) 给予有效量的含有上述乳腺癌靶向肽中之一和抗癌药物的缀合物进行靶向药物递送的方法。本文中使用的“有效量”是指用于将缀合物中所包括的每一活性剂递送到实体肿瘤部位，以使活性剂单独或与一种或一种以上其它活性剂组合对个体提供治疗作用的缀合物的量。本领域技术人员应认识到，有效量将视给药途径、赋形剂选择以及与其它活性剂的共使用而变化。上述任一缀合物用于乳腺癌治疗或用于制造供治疗乳腺癌的药物的用途也在本发明的范围内。有关本发明一个或一个以上实例的细节将陈述于以下描述中。本发明的其它特征或优势将由以下针对数个实施例的详细描述以及所附权利要求书而显而易见。
首先将描述附图。图1是绘示在噬菌体表面上表达的癌症靶向肽与乳腺肿瘤异种移植物的特异性结合活性的图。图面A 噬菌体克隆PC34，展示具有氨基酸序列SEQ ID NO :1的肽。图面B 噬菌体克隆PC65，展示具有氨基酸序列SEQ ID NO :2的肽。图面C 噬菌体克隆PC73，展示具有氨基酸序列SEQ ID N0:3的肽。图面D 噬菌体克隆PC83，展示具有氨基酸序列SEQ ID N0:4的肽。图面E 噬菌体克隆PC90，展示具有氨基酸序列SEQ ID NO :5的肽。图面F: 对照噬菌体克隆PC34，展示对照肽。图2是绘示游离多柔比星(FD)、封装于脂质体中的多柔比星(LD)和封装于缀合 SP90的脂质体中的多柔比星(SP90-LD)的抗乳腺肿瘤活性的图。SP90是指在噬菌体克隆 PC90上展示的肽(SEQ ID NO 5)。图面A 用FD、LD或SP90-LD处理的带有乳腺肿瘤的小鼠的肿瘤体积。图面B 用FD、LD或SP90-LD处理的带有乳腺肿瘤的小鼠的白细胞(WBC) 计数。图面C 用FD、LD或SP90-LD处理的带有乳腺肿瘤的小鼠的体重。图面D 用FD、LD 或SP90-LD处理的带有乳腺肿瘤的小鼠的体重变化。图3是绘示用FD、LD或SP90-LD处理的带有乳腺肿瘤的小鼠的坏死/凋亡区的图。图面A:凋亡和坏死区。图面B:凝集素阳性区(指示存在肿瘤血管)。图4是绘示肿瘤组织中多柔比星的分布的图。图面A 利用灌注法。图面B:不利用灌注法。发明的详细描述本发明涉及许多乳腺癌靶向肽，即，包括氨基酸序列SEQ ID NO :1_5中之一的肽。 本文中使用的术语“肽”是指由最多100个氨基酸单体通过肽键连接而构成的聚合物。本文中所述的每一乳腺癌靶向肽都可包括最多50个(例如30个)氨基酸。这些肽可通过常规方法，即通过化学合成法或重组技术制备。必要时，可对本文所述的任何乳腺癌靶向肽进行修饰以增加其稳定性。就本发明的实践来说，经化学方法修饰的肽或肽类似物包括以体内或体外稳定性和/或功效增加为特征的所述肽的任何功能性化学等效物。术语肽类似物也指本文所述肽的任何氨基酸衍生物。氨基酸类似物的制备程序包括但不限于侧链修饰、在肽合成期间并入非天然氨基酸和/ 或其衍生物和使用交联剂，以及对肽或其类似物施加构象限制的其它方法。侧链修饰的实例包括氨基修饰，例如通过与醛反应随后用NaBH4还原进行的还原烷基化；用乙酰亚胺甲酯酰胺化；用乙酸酐乙酰化；用氰酸酯将氨基氨甲酰化；用2，4，6，三硝基苯磺酸(TNBS)将氨基三硝基苯甲基化；用琥珀酸酐和四氢邻苯二甲酸酐将氨基烷基化；以及用5'-磷酸吡哆醛将赖氨酸吡哆醛化(pyridoxylation)，随后用NABH4还原。精氨酸残基的胍基可通过与例如2，3_ 丁二酮、苯甲酰甲醛和乙二醛等试剂形成杂环缩合产物来进行修饰。羧基可通过形成ο-酰基异脲使碳化二亚胺活化，随后衍生化成为例如相应的酰胺来加以修饰。硫氢基的修饰方法可例如为用碘乙酸或碘乙酰胺羧甲基化；用过甲酸氧化成磺基丙氨酸；与其它硫醇化合物形成混合二硫化物；与马来酰亚胺、马来酸酐或其它取代的马来酰亚胺反应； 使用4-氯汞苯甲酸、4-氯汞苯磺酸、苯基氯化汞、2-氯汞-4-硝基苯酚和其它汞制剂形成汞衍生物；在碱性PH值下用氰酸酯氨甲酰化。色氨酸残基可通过例如用N-溴代琥珀酰亚胺氧化，或用2-羟基-5-硝基苯甲基溴或磺酰基商化物将吲哚环烷基化来进行修饰。酪氨酸残基可通过用四硝基甲烷硝化形成3-硝基酪氨酸衍生物来改变。组氨酸残基咪唑环的修饰可通过用碘乙酸衍生物烷基化或用焦碳酸二乙酯N-乙酯基化(N-carbethoxylation) 实现。在肽合成期间并入非天然氨基酸和衍生物的实例包括但不限于使用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体。如下文实例1-3中所示，本文所述的乳腺癌靶向肽在体内和体外特别结合于乳腺癌组织/细胞。因此，当这些肽与抗癌药物缀合时，其会将药物引导到乳腺癌部位，由此促进乳腺癌的治疗。本发明中使用的“缀合的”是指两个实体(此处为乳腺癌靶向肽和抗癌药物)以足以实现两个实体之间缔合的治疗益处的亲和力缔合。缀合可通过共价或非共价键合以及其它缔合形式实现，例如将一个实体截留于另一实体上或其内，或者将任一实体或两个实体截留于第三个实体(例如微胞)上或其内。在一个实例中，一种本文所述的乳腺癌靶向肽与抗癌药物直接或间接共价连接，通过常规方法形成治疗缀合物。所述药物可以是化疗剂，例如终止DNA结构单元合成的药物(例如甲氨喋呤(methotrexate)、氟尿嘧啶(f luorouracil)、羟基脲和巯基嘌呤)、直接破坏DNA的药物(例如顺钼、道诺霉素(daimorubicin)、多柔比星和依托泊苷 (etoposide))、影响有丝分裂纺锤体合成或断裂的药物(例如长春花碱、长春新碱和紫杉醇)或中断血管生成的药物(例如抗VEGF抗体、血管抑素(angiostatin)、内皮抑素 (endostatin)和肿瘤抑素(tumstatin))。或者，抗乳腺癌药物可以是放射治疗剂(例如 90Y^ 1251 , 188Re,111In DTPA 或 131I 标记的碘化钠)。在另一实例中，乳腺癌靶向肽与封装抗乳腺癌药物的媒剂分子(即，微粒)连接， 由此形成治疗缀合物。媒剂分子包括微胞、脂质体(例如阳离子型脂质体)、纳米粒子、微球或生物可降解聚合物。乳腺癌靶向肽可通过多种键(例如二硫键、酸不稳定性键、基于肽的键、氧基氨基键或胼键)系连于媒剂分子。封装于媒剂内的抗乳腺癌药物可与亲脂性分子缔合，这些亲脂性分子可帮助将成像分子/抗肿瘤药物递送到媒剂内部。在一优选实例中，乳腺癌靶向肽与可封装欲递送到肿瘤部位的抗癌药物的脂质体连接。术语“脂质体”是指包含一个或一个以上同轴有序排列的脂质双层的小泡，其可封装水相。水相通常含有欲递送到肿瘤部位的化合物。在到达肿瘤部位后，脂质体与局部肿瘤细胞或肿瘤血管细胞的质膜融合，由此将化合物释放到细胞溶胶中。或者，脂质体通过胞吞作用或通过其它方式被肿瘤细胞或肿瘤血管细胞摄取作为运输小泡(例如内体或吞噬体0的内容物。一旦进入运输小泡中，脂质体就会降解或与小泡膜融合，并释放其内容物。脂质体膜的构造应使其在附近环境变为酸性时不稳定(例如参见PNAS 84 =7851,1987 ； Biochemistry观908，1989)。当脂质体进入靶细胞时，其变得不稳定，并释放出其封装的内容物。这一不稳定作用称为融合诱导(fusogenesis)。二油酰基磷脂酰乙醇胺(Dioleoy lphosphatidylethanolamine, DOPE)常用于促进这一过程。多种方法可用于制备脂质体。例如参见，Szoka et al.，Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9 :467(1980)；美国专利第 4，186，183 号、第 4，217，344 号、第 4，235，871 号、第 4，261，975 号、第 4，485，054 号、第 4，501，728 号、第 4，774，085 号、第 4，837，028 号、第 4，235，871 号、第 4，261，975 号、第 4，485，054 号、第 4，501，728 号、第 4，774，085 号、第 4，837，028 号、第 4，946，787 ；PCT 公开第 WO 91/17424 号；Deamer & Bangham，Biochim. Biophys. Acta443 :629-634(1976) ；Fraley，et al.，PNAS 76:3348-3352(1979) ；Hope et al. , Biochim. Biophys. Acta 812 :55-65(1985) ；Mayer et al. , Biochim. Biophys. Acta 858 :161-168(1986) ；Williams et al.，PNAS 85:242-246(1988) ；Liposomes (脂质体)(Ostro(ed.)，1983，Chapter 1 (第 1章))；Hope et al.，Chem. Phys. Lip. 40 :89 (1986)； Gregoriadis, Liposome Technology (月旨质体技术)(1984)；以及 Lasic，Liposomes :from Physics to Applications (脂质体物理学到应用)(199 )。适合的方法包括例如超声处理、挤压、高压/均质化、微射流、清洁剂透析、钙诱导的小脂质体小泡融合和醚融合法，所有这些方法都是本领域众所周知的。本文所述的任何乳腺癌治疗缀合物都可与药学上可接受的载体混合，形成药物组合物。“可接受的”是指载体必须与组合物中的活性成分相容(且优选能够使活性成分稳定)，并且对欲治疗的个体无害。适合的载剂包括微晶纤维素、甘露醇、葡萄糖、脱脂奶粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉，或其组合。为了能使用本文所述的任何缀合物进行肿瘤治疗，可经口服、经胃肠外、经局部、 经直肠、经鼻、经口腔、经阴道、经由植入的储积器(reservoir)或经由吸入喷雾给予缀合物。本文中使用的术语“胃肠外”包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、 胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。无菌可注射组合物，例如无菌可注射水性或油性悬浮液，可根据本领域已知的技术，使用适合的分散剂或润湿剂(例如吐温80 (Tween 80))或者悬浮剂配制。无菌可注射制剂也可以是在无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中制成的无菌可注射溶液或悬浮液， 例如于1，3_ 丁二醇中的溶液。可使用的可接受的媒剂和溶剂是甘露醇、水、林格氏溶液 (Ringer' s solution)和等渗氯化钠溶液。此外，还通常使用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质(例如合成单酸甘油酯或二酸甘油酯)。脂肪酸，例如油酸和其三酸甘油酯衍生物，以及天然的药学上可接受的油，例如橄榄油或蓖麻油，尤其是其聚氧乙基化形式，都可用于可注射制剂中。这些油溶液或悬浮液还可含有长链醇稀释剂或分散剂，或者羧甲基纤维或类似的分散剂。出于配配的目的，也可使用常用于制造药学上可接受的固体、液体或其它剂型的其它常用表面活性剂，例如吐温系列(Tweens)、斯盘系列(Spans)，或者其它类似的乳化剂或生物利用率增强剂。供口服给药的组合物可以是任何口服可接受的剂型，包括但不限于胶囊、片剂、乳剂和水性悬浮液、分散液和溶液。在口服片剂/胶囊的情况下，常用载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还添加润滑剂，例如硬脂酸镁。对于口服给药的胶囊形式，适用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当口服给予水性悬浮液或乳剂时，可将活性成分悬浮于或溶解于组合有乳化剂或悬浮剂的油相中。必要时，可以添加某些甜味剂、调味剂或着色剂。鼻用气雾剂或吸入组合物可根据药物配配领域中众所周知的技术来制备。对于直肠给药，也可以栓剂形式给药含噁二唑化合物的组合物。无需进一步详细阐述，相信本领域技术人员可以根据上文的描述，最大限度地利用本发明。因此，以下具体实施例应解释为只是说明性的，且并非以任何方式限制本发明的剩余部分。本文引用的所有出版物都以引用的方式并入本文中。实例1 在噬菌体粒子表面上表达的癌症靶向肽的结合遵循 Lo et al. , Mol. Cancer Ther 7 :579-589 0008)禾口 Lee et al. , Cancer Res. 64 :8002-8008 (2004)中所述的程序，将BT483细胞(乳腺癌细胞)和人粘膜上皮细胞 (正常细胞)接种于96孔板中。将这些细胞与用紫外线灭活的对照辅助噬菌体和下文所列的5种测试噬菌体中的一种一起孵育，所述5种噬菌体各自表达同样列于下文中的5种肽中的一种
权利要求
1.乳腺癌靶向肽，其包含选自以下的氨基酸序列 QNIYAGVPMISF(SEQ ID NO 1), EATNSHGSRTMG(SEQ ID NO 2), TVSffSTTGRIPL(SEQ ID NO 3), QLEFYTQLAHLI(SEQ ID NO 4)禾口 SMDPFLFQLLQL(SEQ ID NO :5)。
2.根据权利要求1所述的肽，其中所述肽具有所述氨基酸序列SEQID N0:l、2、3、4或5。
3.根据权利要求1所述的肽，其中所述肽包括所述氨基酸序列SEQID NO :5。
4.根据权利要求3所述的肽，其中所述肽具有所述氨基酸序列SEQID NO :5。
5.抗癌缀合物，其包含根据权利要求1-4中任一权利要求所述的肽和抗癌药物。
6.根据权利要求5所述的缀合物，其中所述肽与封装所述抗癌药物的微粒缔合。
7.根据权利要求6所述的缀合物，其中所述微粒是脂质体。
8.根据权利要求5-7中任一权利要求所述的缀合物，其中所述抗癌药物选自多柔比星、他莫昔芬、长春瑞宾、长春新碱、紫杉醇、勒托替康、多烯紫杉醇、亚德利亚霉素、表柔比星、米托蒽醌、丝裂霉素、吉西他宾、顺钼、奥沙利钼、长春花碱、5-FU、UFUR、阿那曲唑、雷曲唑和依西美坦。
9.根据权利要求5-8中任一权利要求所述的癌症靶向缀合物用于将抗癌药物递送到乳腺癌部位的用途。
10.根据权利要求5-8中任一权利要求所述的癌症靶向缀合物在制备用于治疗乳腺癌的药物中的用途。
11.核酸，其包含编码根据权利要求1-4中任一权利要求所述的肽的核苷酸序列。
全文摘要
本发明提供癌症靶向肽及其在癌症治疗中的用途。
文档编号A61P35/00GK102325788SQ201080008727
公开日2012年1月18日 申请日期2010年2月19日 优先权日2009年2月19日
发明者吴汉忠, 邱倩玉 申请人:中央研究院, 梁启铭