专利名称：癌症治疗的制作方法
技术领域：
本发明大体上涉及癌症治疗，特别是涉及抗药物诱导的细胞程序性死亡的癌症。
背景技术：
1.引言本申请要求下列各美国临时专利申请的利益和优先权序列号60/625，193，2004 年11月提交，题为“癌症治疗”；和60/660, 266,2005年3月提交，题为“癌症治疗”。这些 申请各自在此以其全文合并作为参考，包括附图、表格和权利要求。下面的描述包括可用于理解本发明的信息。并非承认任何所述信息对于本发明而 言是现有技术或相关技术，或者任何明确或隐含引用的公布是现有技术。2.背景在美国，癌症现在是死亡的第二位主要原因，美国有超过8，000，000人被诊断 为癌症。1995年，癌症占美国所有死亡的23.3%。参见美国卫生和人类服务部，国家健 康统计中心(U. S. Dept. of Health and HumanServices, National Center for Health Statistics)的 Health United Statesl996_97 和Injury Chartbook 117(1997)。癌症尚未在分子学水平被完全了解。已知把细胞暴露于致癌物如某些病毒、某些 化学物质或辐射能导致灭活“抑制性”基因或活化“致癌基因”的DNA的改变。抑制基因是 生长调节基因，其一旦突变就不能再控制细胞生长。致癌基因起初是正常基因(称为原癌 基因)，通过突变或改变表达内容成为转化基因。转化基因的产物导致细胞的不当生长。超 过20个不同的正常细胞基因可通过基因改变成为致癌基因。转化细胞在很多方面与正常 细胞不同，包括细胞形态、细胞-细胞间相互作用、膜的成分、细胞骨架的结构、蛋白分泌、 基因表达和死亡率(转化的细胞可以无限生长)。瘤，或肿瘤，是细胞生长异常的、不受调节的和无组织的增殖，通常称为癌症。如果 瘤具有破坏性生长、浸润和转移的性质，就是恶性或癌。浸润是指瘤通过渗透或破坏周围组 织的局部扩散，通常破坏性穿过限定组织边界的基底层，因此常常进入体循环系统。转移通 常指肿瘤细胞通过浆膜腔、蛛网膜下腔或其它腔隙，以直接扩散的方式迁移。通过转移过 程，肿瘤细胞迁移到身体的其它部位，在远离其最初出现位置的部位生成瘤。癌症现在主要用三种类型的治疗方法之一或联合治疗手术，放疗和化疗。手术涉 及大量清除病变组织。虽然手术对于清除位于某些位置的肿瘤(例如乳房、结肠和皮肤) 有时有效，但它不能用于治疗位于其它部位的肿瘤，如脊椎，也不能治疗散在的肿瘤病症如 白血病。放疗涉及把活组织暴露在能导致暴露的细胞死亡或破坏的电离辐射中。放疗的副 作用可能是急性和短暂的，但有些可能不可逆转。化疗涉及破坏细胞复制或细胞代谢。在 乳房、肺和睾丸癌的治疗中最常用。
用全身化疗治疗肿瘤疾病的不良作用是接受癌症治疗的患者最害怕的。在这些 不良作用中，恶性和呕吐最常见。其它不良副作用包括接受高剂量化疗与骨髓救疗(bone marrow rescue)或放疗的患者中血细胞减少、感染、恶病质、粘膜炎；秃头症(脱发)；皮肤 并发症如瘙痒、荨麻疹和血管性水肿；神经并发症；肺部和心脏并发症；以及生殖和内分 泌并发症。化疗导致的副作用严重影响患者的生命质量，并可能强烈影响患者对治疗的依 从性。因此，需要改进的治疗方法。3.定义“烷化剂”指化学修饰DNA并破坏其功能的化疗化合物。一些烷化剂导致双 链DNA分子的同一条链或互补链的核苷酸之间形成交联，但另外一些导致DNA链之间 的碱基对错配。烷化剂的实例包括苯达莫司汀(bendamustine)、白消安(busulfan)、 卡钼(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、顺钼(cisplatin)、苯丁 酸氮芥 (chlorambucil)、环磷酉先胺(cyclophosphamide)、达卡巴嗪(dacarbazine)、六甲啼胺 (hexamethylmelamine)、异环磷酰胺(ifosphamide)、洛莫司汀(Iomustine)、双氯乙基甲 胺(mechlorethamine)、美法仓(melphalan)、米托坦(mitotane)、丝裂霉素(mytomycin) > 哌泊溴烷(pipobroman)、丙卡巴胼(procarbazine)、链脲菌素(str印tozocin)、噻替哌 (thiotepa)禾口三亚乙基密胺(triethylenemelamine)。“抗代谢药”指干扰生物分子合成的化疗药，所述生物分子包括DNA合成必需(如 核苷酸和核苷)的需要合成DNA者。抗代谢药的实例包括卡培他滨(capecitabine)、 氯脱氧腺苷(chlorodeoxyadenosine)、阿糖胞苷(cytarabine)(及其活性形式， ara-CMP) > H H1^f (cytosinearabinoside) > dacabazine> M J^ Ρ (f loxuridine) > M 拉宾(fludarabine)、5-氟脲嘧啶(5_fluorouracil)、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲 (hydroxyurea) >6- Jft基口票吟(6-mercaptopurine)、甲氛蝶吟(methotrexate)、喷司他丁 (pentostatin)、三甲曲沙(trimetrexate)禾口 6-JlE基鸟曙吟(6—thioguanine)。“抗有丝分裂”指干扰有丝分裂的化疗药，通常是通过破坏微管形成。抗有丝分 裂化合物的实例包括诺维本(navelbine)、紫杉醇(paclitaxel)、泰素帝(taxotere), 长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)和长春瑞宾 (vinorelbine)。在本发明范围内，“化疗药”指目的在于破坏恶性细胞和组织的化学药品。化疗药 包括小分子、核酸(如反义分子、核酶、小干扰RNA分子等)和蛋白质(如抗体、抗体片段、 细胞因子、酶和肽类激素)，当为了预防或治疗癌症或其它恶性肿瘤施用给患者时，其具有 抗肿瘤效应。化疗药经常基于作用机制分类，如烷化剂、抗代谢类和抗有丝分裂剂。术语“联合治疗”指治疗方案涉及至少施用两种不同的疗法，以达到需要的治疗效 果。例如，联合治疗可包括施用两种或多种化学活性不同的成分，如快速起作用的化疗剂 和骨髓保护剂。或者，联合治疗可包括施用一种或多种化疗剂以及给予放疗和/或手术或 其它手段，改善患者的生活质量或治疗癌症。在施用两种或多种化学活性不同的成分的情 况下，应理解活性成分可以作为同一组合物的部分或作为不同组合物施用。当作为分开的 组合物施用时，包含不同活性成分的组合物可以通过相同或不同的途径、采用相同的不同 剂量方案，同时或不同时施用，均根据特定情况的需要并依照主治医师的决定。同样，当一 种或多种化疗药与例如放疗和/或手术联合时，药物可以在手术或放射治疗之前或之后给
5予。“嵌入剂”指将自身插入双链DNA分子中相邻碱基对间的化疗剂，其破坏DNA结构 并干扰DNA复制、基因转录、和/或DNA结合蛋白与DNA的结合。“单一疗法”指治疗方案基于给予一种治疗有效的化合物，不管是单剂施用或在一 段时间内多次施用。在药品商业化的背景下，术语“促进”等指由参与所关注的具体药物化合物、组合 物或治疗方案的发现、研究、开发和/或商业化的制造商、经销商或其它实体所进行或发 起的任何和所有的信息性的、说服性和科学性的活动，直接或间接地导致化合物、组合物或 治疗方案的处方、供应、购买和/或应用。这样的活动可以直接面向供应和经销链中的任何 人，包括但不限于医学专业人员(如医生和护士)、药剂师、保健管理员、保险公司或政府代 表、以及患者(包括潜在的患者)。换句话说，促进的首要目的是刺激特定药物化合物、组合 物或治疗方案的销售或使用和/或兴趣，并因此为该目的服务的任何活动构成了特定药物 化合物、组合物或治疗方案的“促进”。根据本发明的“可获得专利”的组合物、方法、机器或制造的物品是指在进行研究 的时候，该主题满足了关于专利性的所有法定条件。例如，关于新颖性、非显而易见性等，如 果后来的研究表明，一个或多个权利要求包括了一种或多种将破坏新颖性、非显而易见性 等的实施方案，则被定义限制到“可获得专利”的实施方案上的权利要求明确排除不能得到 专利的实施方案。同样所附的权利要求还要解释为提供最宽的合理范围以及保持其有效 性。此外，从本申请提交或专利授权的时间到一条或多条所附权利要求的有效性被质疑的 时间，如果关于专利性的一条或多条法定条件被修订，或者如果评价关于专利性的特定条 件是否满足的标准改变，本权利要求应该以下述方式解释(1)保持其有效性和(2)在这种 情况下提供最宽的合理解释。术语“药物可接受的盐”指保持本发明化合物的生物效力和特性的盐类，并且其不 是生物或其它方面不合乎需要的。很多情况下，本发明的化合物在存在氨基和/或羧基或 与此相似的基团的条件下，能形成酸和/或碱盐。药物可接受的酸式盐可以从无机和有机 酸制备，而药物可接受的碱加成盐可从无机和有机碱制备。关于药物可接受的盐的综述见 Berge, et al. ((1977) J. Pharm. Sd，vol. 66，1)。“药物可接受的无毒盐”指用无毒的药物可 接受的无机或有机酸或者无机或有机碱形成的无毒盐。例如，盐包括从无机酸如盐酸、氢溴 酸、硫酸、磺酰胺酸、磷酸、硝酸等衍生的盐，以及从有机酸如乙酸、丙酸、琥珀酸、甘醇酸、 硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、扑酸(pamoicacid)、马来酸、羟基马来酸、 苯基乙酸、谷氨酸、安息香酸、水杨酸、磺胺酸、富马酸、甲磺酸、和甲苯磺酸等。盐还包括来 自无机碱，如氨水、羟乙胺和胼的盐。适用的有机碱包括甲胺、乙胺、丙胺、二甲胺、二乙胺、 三甲胺、三乙胺、乙二胺、羟乙胺、吗啉、哌嗪和胍。“多个”指超过一个。术语“利妥昔单抗(rituximab)难以治疗的”意思是之前用利妥昔单抗治疗，但是 根据医生或治疗专家的决定，由于单一药剂或者联合治疗施用的利妥昔单抗疗法难以治疗 的疾病(定义为在全部利妥昔单抗治疗的6个月内没有反应或病情发展)，不适合进一步治 疗，和/或对之前的利妥昔单抗治疗有不良反应，使得进一步治疗得不到保证。术语“抗-⑶20难以治疗的”意思是之前用与⑶20抗原相互作用的药剂治疗，但是根据医生或治疗专家的决定，由于单一药剂或者联合治疗施用的抗CD20剂的难以治疗 的疾病(定义为在全部抗CD20治疗的6个月内没有反应或病情发展)，不适合进一步治疗， 和/或对之前的利妥昔单抗治疗有不良反应，使得进一步治疗得不到保证。细胞周期的“S期”指染色体复制的时期。术语“种类”在不同条件下用于本文，如化疗药的具体种类。在每个条件中，术语 指在该特定条件下所指的这类化学区分不明显的分子类群。“对象”或“患者”是指需要可由本发明的分子有效治疗的治疗的动物。可以治疗 的动物依照本发明包括脊椎动物，哺乳动物如牛、犬、马、猫、羊、猪和灵长类(包括人和非 人灵长类)动物是特别优选的实例。“治疗有效量”指施用到需要这种治疗的对象中时，活性成分足以产生治疗作用的 量。在癌症治疗的条件下，“治疗有效量”是在与癌细胞存活或代谢有关的一个或多个参数 中，产生有客观量度的改变的量，包括与特定癌症相关的一个或多个基因表达的增加或减 少、肿瘤负荷降低、癌细胞裂解、在生物样本中(如活检和体液如全血、血浆、血清、尿等的 等分试样)检测到一个或多个癌细胞死亡标记、对诱导细胞程序性死亡或其它的细胞死亡 途径的诱导等。当然，治疗有效量根据具体对象和要治疗的病症、对象的体重和年龄、病情 严重度、所选的特定化合物、要依照的施用方案、施用时间、施用方式等而变化，所有这些可 以由本领域的普通技术人员很容易地确定。应当领会，在联合治疗的情况下，构成特定活性 成分的治疗有效量可以与单一疗法(即治疗方案只采用一种实体化学药品作为活性成分) 施用时构成的活性成分的治疗有效量不同。术语“治疗”意思是对疾病或病症的任何处理，包括预防或保护免患疾病或病症 (即致使临床症状不再发展)；抑制疾病或病症(即阻止或抑制临床症状的发展)；和/或 减轻疾病或病症(即致使临床症状消退)。应当领会，不是总可能区别“预防”和“抑制”疾 病或病症，因为最终的诱导事件可以是未知的或潜在的。因此，术语“预防”应理解为构成 了一类“治疗”，既包括“预防”又包括“抑制”。术语“保护”因而包括“预防”。
发明内容
本发明的一个目的是，通过施用在癌细胞中引起有丝分裂灾变(catastrophe)的 化合物(如苯达莫司汀)，单独施用或者与其它化合物和/或治疗相结合，为治疗特征在于 癌细胞抗死亡的癌症提供了可获得专利的方法。在优选实施方案中，这些方法包括确定患 者是否患有特征在于癌细胞抗死亡的癌症，如果是，给患者施用治疗有效量的苯达莫司汀。 发明的另一个目的涉及在癌症治疗的施用期间或之后的一个或多个时段，在采集的患者 生物样本中检测癌细胞死亡标记的基础上，评价癌症治疗的有效性。因此，本发明的一个方面涉及治疗癌症患者的可获得专利的方法，所述癌症患 者的癌症特征在于癌细胞抗死亡，即癌细胞对抗细胞程序性死亡或其它程序细胞死亡途 径，以及细胞表现出多药抗性(MDR)，这是可以被施用一种或多种烷化剂，单独施用或与抗 CD20如利妥昔单抗结合所诱导的。这些方法包括给患者施用治疗有效量的、在抗死亡癌 细胞中引起有丝分裂灾变的化合物。这样的细胞包括对抗药物引起的细胞程序性死亡的 细胞。所述细胞的实例包括P53缺陷的细胞，通常是包括编码p53的基因中有缺失或该基 因缺失的突变的结果。这样的癌症代表性的实例包括非何杰金氏(Hodgkin' s)淋巴瘤
7(“NHL")和慢性淋巴细胞白血病(“CLL")。诱导有丝分裂灾变特别优选的化合物是 烷化剂苯达莫司汀。因此，相关方面涉及包括鉴定特定癌症细胞为抗死亡癌细胞，之后用在 所述细胞中诱导有丝分裂灾变的化合物单独或与其它化疗药、佐剂、手术和/或放疗结合 治疗的治疗方法。另外，可以监测所述治疗方案的有效性，评价特定的单一疗法或联合疗法 治疗能否达到所需的效果。本发明的另一个方面涉及治疗癌症的某些相关的可获得专利的方法，特别是特征 在于癌细胞抗死亡的癌症。这些方法包括当包含癌症的至少一部分细胞处于细胞周期的S 期时，给患者施用治疗有效量的化合物。在一些实施方案中，给患者施用驱使癌细胞进入S 期的化合物的结果是，患者癌细胞的至少一部分被驱进S期。苯达莫司汀是特别优选的驱 使癌细胞进入S期的化合物。由于苯达莫司汀适用于把细胞驱入S期，另外的优选实施方 案包括随后施用一种或多种其它当细胞在细胞周期的S期时更具活性(即发挥更大的治疗 作用，例如细胞毒性)的化疗剂，。在所述方法中，随后施用一种或多种其他化疗药优选发 生在苯达莫司汀施用后至少约10分钟，优选至少约30-约60分钟或更长，虽然优选施用所 述其它药发生在苯达莫司汀施用后约72小时之内，优选约48小时或更短。在一部分这些 优选实施方案中，其它化疗药在施用苯达莫司汀后约30分钟至约36小时内施用，优选在施 用苯达莫司汀后的大约30分钟至24小时内，某些情况下，在施用苯达莫司汀后大约30分 钟至6至大约12小时内。相关的方法包括减少与癌症治疗有关的毒性。这样的方法包括 给癌症患者施用多个剂量的治疗有效量的苯达莫司汀。首剂就足以导致不需要的毒性。在 这样的事件中，可延迟第二次施用(或后续剂量)，直至不需要的毒性减退。在一些情况下， 苯达莫司汀在不同时间的施用剂量也可以变化。本发明的另一个方面因此涉及在施用烷化剂(如苯达莫司汀)的基础上，评价癌 症治疗疗效的可获得专利的方法，该方法在整个治疗过程期间或之后，可以是单一疗法或 联合疗法。当在施用包括施用烷化剂(如苯达莫司汀)的治疗方案之后进行评价时，优选 先经过足够的时间，使烷化剂能发挥其应有的或需要的治疗作用。在这样的方法中，从来自 患者的生物样品中检测与疗效有关的癌细胞死亡标记(即，由濒死或死亡的癌细胞产生或 释放的分子(例如蛋白质、碳氢化合物、脂质、核酸或其它分子)以及如丧失细胞生存能力、 不能增殖、衰老等表型)来确定所用的治疗是否有效。。优选的细胞死亡标记包括腺苷酸激 酶活性水平、PARP切割产物的水平、和细胞生存能力降低。根据标记，这样的检测可以是定 性、半定量或定量的。检测的标记的存在或水平表明治疗是否有、或曾经有效。本发明的另外一个方面，发明涉及在对患有对一种或多种烷化剂和抗CD20剂(例 如利妥昔单抗)具有抗性或难以治疗的癌症的患者施用苯达莫司汀的基础上，对癌症的治 疗。优选这些方法用于对抗以癌细胞抗死亡为特征的癌症。本发明相关的方面涉及在所述 癌症的治疗中处理事务的方法，包括促进苯达莫司汀用于处理难以治疗的癌症或特征在于 癌细胞抗死亡的癌症，特别是用一种或多种烷化剂和抗CD20剂如利妥昔单抗的联合治疗 难治的癌症。还有一个方面涉及患者的癌症是否对苯达莫司汀治疗敏感。应当领会，可以 采用任何适用于苯达莫司汀敏感性的评价。在这些方法的一些优选实施方案中，从患者采 集的癌组织细胞样本的部分或全部在没有对癌细胞有毒性的化合物存在、使得癌细胞增殖 的生长条件下暴露于苯达莫司汀。然后基于分析结果进行敏感性评价。例如，与对照比较， 增殖减低表明细胞，即患者的癌症，对苯达莫司汀为基础的治疗敏感。反之，没有作用(或提高增殖)显示缺少敏感性。发明的另外一个方面涉及苯达莫司汀在制备治疗癌症的药物中的应用，所述癌症 是特征在于癌细胞抗死亡的癌症或治疗难治性癌症，特别是用一种或多种烷化剂和抗CD20 剂如利妥昔单抗的联合治疗难治的癌症。优选所述药物包括治疗有效量的苯达莫司汀。附图简述本专利申请包含至少一个彩色制图。带有彩色附图的本专利申请的复制件在请求 并付必要的费用后提供。
图1有两个试验组，A和B，各显示基因表达分布图，A显示苯达莫司汀基因表达 图谱簇前100个受调节基因，B显示受三种受试药物上调节水平水平最高的基因。这两 个试验组显示在非何杰金氏淋巴瘤细胞系SU-DHL-I中，用含有超过12，000已知基因的 Affymetrix基因芯片(U133A)测定的基因表达。苯达莫司汀在IC50 (25 μ M ；条带1)和 IC90(35yM;条带2)下测试。苯丁酸氮芥(5 μ M ；条带3)和环磷酰胺代谢物磷酰胺氮芥 (50 μ M ；条带4)在IC90下测试。暴露后8h分离mRNA。Α.显示的簇图(clustergram)代 表与对照(稀释剂，DMS0)比较，前100个受调节水平最高的基因。红色代表上调的基因， 蓝色代表下调的基因。B.该簇图表现出同时被全部三种被测药物诱导的基因。图2有三个柱状图，2A、2B和2C，2A显示Q-PCR验证选择的p53_依赖性和促细胞 程序性死亡基因，2B显示Q-PCR验证选择的有丝分裂关卡基因，2C显示Q-PCR验证选择的 DNA修复基因。按照下文方法部分的叙述，在暴露于等毒性浓度的苯达莫司汀、磷酰胺氮芥 和苯丁酸氮芥的SU-DHL-I中进行Q-PCR分析。用对18s RNA的分析对输入cDNA (input cDNA)的水平标准化，未处理样本中的转录水平设定为1。图2A显示两种代表性p53-依赖 基因p21和NOXA的相对RNA水平。图2B显示参与M期细胞周期关卡的四种基因polo-类 激酶(PLK-I)、aurora激酶A和B、以及细胞周期蛋白Bl的RNA水平。图2C显示涉及DNA 修复机制的基因EXOl和Fenl的RNA水平。柱代表相对于DMSO-处理的对照的倍数改变均 值 +/-SE。图3显示了数个免疫印迹，证明了在NHL细胞(SU-DHL-I)中，苯达莫司汀(50 μ M) 与环磷酰胺(50 μ Μ)和苯丁酸氮芥(4μΜ)比较，细胞程序性死亡作用提高。为了产生这些 免疫印迹，在如下文方法部分所述暴露20小时后制备细胞裂解产物。用β-肌动蛋白作为 点样对照对膜进行探查，并显示在受调节的蛋白质下方。左上端长方图代表Serl5-磷酸化 P53的表达，用磷特异性抗体检测。中间左边的方图显示总p53和p21的表达。左下方图代 表Bax的表达。右方图显示全长PARP (最上方)和用识别特异的半胱天冬酶断裂位点的抗 体的PARP半胱天冬酶断裂片段。图4由两个图组成，A和B，表示所选的DNA修复机制的功能分析，A显示MX (Ape-I 抑制剂)对苯达莫司汀活性的作用与对环磷酰胺活性的作用比较，B显示06-苄基鸟嘌呤 对苯达莫司汀、环磷酰胺和卡莫司汀的作用。图4A显示是苯达莫司汀而不是环磷酰胺，通 过碱基切除修复(BER)导致DNA损伤修复。修复酶Ape-Ι，一种无嘌呤内切酶，在BER途径 中，在苯达莫司汀和环磷酰胺代谢物磷酰胺氮芥(PM)的细胞毒活性中发挥着至关重要的 作用，用Ape-I抑制剂甲氧胺(MX)对其作用进行评价。用苯达莫司汀和MX观察到曲线的 左移，显示苯达莫司汀产生的DNA损伤被BER修复。图4B显示抑制MGMT修复活性不影响 苯达莫司汀的细胞毒性。修复酶MGMT (O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶)在苯达莫司汀细胞毒活性中的作用，用MGMT抑制剂O6-苄基鸟嘌呤(O6-BG)评价。加入O6-苄基鸟嘌呤不显 著改变苯达莫司汀的IC5tl，因此苯达莫司汀不可能诱导O6-烷基鸟嘌呤DNA加成物。反之， O6-苄基鸟嘌呤明显使细胞对其它氮芥如卡莫司汀和磷酰胺氮芥(PM)敏感化。图5图解了苯达莫司汀有效进入肿瘤细胞，引起长时间和大范围的DNA损伤，其导 致了至少三个信号途径的启动1)可能通过促细胞程序性死亡的BCL-2家族成员如NOXA 和Bax激活“经典的”p53-依赖性应激途径，导致内在细胞程序性死亡的强烈激活；2)激活 DNA修复机制，如碱基切除修复工具，其不能通过通常用在NHL或CLL患者中的其它烷化剂 激活；和3)抑制数个有丝分裂关卡，如激酶PLK-I以及Aurora A和B。虽然不希望被局限 于具体理论中，但据估计，同时诱导DNA损伤和抑制有丝分裂关卡阻止了暴露于苯达莫司 汀的肿瘤细胞在经历有丝分裂之前就有效修复DNA损伤。从而细胞以受损的DNA进入有丝 分裂，或者不能继续进行“常规的”P53-依赖性细胞程序性死亡的细胞将通过有丝分裂灾变 而死亡。这个替代的程序化细胞死亡途径，连同传统的细胞程序性死亡的强烈激活，据相信 是苯达莫司汀为何在体外以及在化学药品难以治疗的肿瘤患者中，非常有效地杀死抗药癌 细胞的理由。图6是直方图，显示了在下文的实施例3描述的数个“洗脱”实验期间，进行的腺苷 酸激酶分析的结果，所述腺苷酸激酶分析在用指定的药物处理指定的时间，洗脱，并使细胞 在新鲜培养基上生长48小时(SU-DHL-I)后进行。在这些实验中，SU-DHL-I细胞用50 μ M 苯达莫司汀、20 μ M磷酰胺氮芥或2 μ M苯丁酸氮芥处理30、60或90分钟。定时药物培养之 后，细胞在IX PBS中清洗，“洗脱”特定化疗剂，然后加入新鲜的培养基。之后培养细胞48 小时，这段时间过后在细胞上清液中进行腺苷酸激酶的分析。粉红色柱代表药物(或无药) 培养的零分钟。绿色柱代表培养30分钟，橙色柱代表培养60分钟，紫色柱代表培养120分 钟。结果绘制了三种药物和“无药”对照相比较的上清液中腺苷酸激酶活性的水平。标准 偏差在图上每个柱子的顶部显示。图7与和图6类似是直方图，显示了在下文的实施例3描述的数个“洗脱”实验期 间，进行的腺苷酸激酶分析的结果，所述腺苷酸激酶分析在用指定的药物处理指定的时间， 洗脱，并使细胞在新鲜培养基上生长72小时(SU-DHL-I)后进行。图6和7之间描绘的结 果之间的差异在于图6表现的数据涉及到从培养基“洗脱”各种药物之后，细胞培养48小 时，而图7的数据涉及到“洗脱”特定药物后细胞培养72小时。本领域人员应当领会，下面的说明具体叙述了本发明的某些优选实施方案，因而 只是代表性的，不是描述发明的实际范围。在详细叙述本发明之前，应当理解，本发明并不 局限于所述的具体分子、系统和方法，这些可以变化。还要理解，这里所用的术语只是为了 描述具体实施方案，并非意在限制本发明由所附的权利要求限定的范围。
具体实施例方式本发明是基于意外的发现，即烷化剂苯达莫司汀对多种癌细胞类型发挥出非常迅 速的细胞毒作用，包括传统化疗方案难治的癌细胞。还已经发现，如下文具体所述，与其它 抗癌药相比，苯达莫司汀通过独特的作用模式发挥其毒性作用。苯达莫司汀，4- {5-[双(2-氯乙基)氨基]-1-甲基-2-苯并咪唑基}，是一种氮芥 类化疗剂。苯达莫司汀主要表现烷基化活性，即它是DNA损伤剂。当施用于人(通常通过
10静脉推注)时，苯达莫司汀血清半衰期短，大约2小时。因此，它从患者身体系统迅速清除。 出人意料的是，已经发现，被细胞摄取后，苯达莫司汀迅速发挥其持久的细胞毒作用。实际 上，如下面的实施例3所报告，化合物的大部分毒性作用要在癌细胞暴露于药剂下至少大 约30分钟后发挥。当前典型的苯达莫司汀治疗方案包括分开给予三次静脉推注，各次含有等量的苯 达莫司汀。通常在第一次输注后一天给以第二次输注，之后在第一次输注后三周是第三次 输注。采用这种方案是由于苯达莫司汀的相关毒性，包括骨髓抑制。得到了苯达莫司汀血清 半衰期短和其快速作用的性质，则可以通过延迟第二次和后续施用降低药物的相关毒性。 实际上，因为在与苯达莫司汀治疗非何杰金氏淋巴瘤有关的报告中，偶见大范围的并可能 是致死的肿瘤溶解，所以可以增加药物多次施用的间隔，降低肿瘤溶解的发生率。除了降低 有害的毒性之外，在特定治疗方案中加大苯达莫司汀施用间隔也会加大治疗窗(window)， 即在此时间段内药物发挥其所需的治疗效益。实行本发明所用的组合物依照药物配方技术的传统方法加工，产生施用于对象 的医用药剂(即药物或治疗组合物)，所述对象包括人类和其它哺乳动物，即分别是“药 物”和“兽医”用药。参见，例如最新版 Remington' s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. , Easton, PA) 0通常，化合物如苯达莫司汀与药学可接受的载体组合成组 合物。该组合物还可包括下列的一种或多种防腐剂；增溶剂；稳定剂；润湿剂；乳化剂；甜 味剂；着色剂；芳香剂；盐；缓冲剂；涂层剂；和抗氧化剂。实行本发明所用的药物可制备成游离酸或碱，然后优选与适当的化合物组合，产 生药物可接受的盐。“药物可接受的盐”的表述指用无毒的、药物可接受的无机或有机酸或 者无机或有机碱形成的无毒盐。例如，所述盐包括从无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、磺酰胺 酸、磷酸、硝酸等衍生的盐，以及从有机酸如乙酸、丙酸、琥珀酸、甘醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果 酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、扑酸、马来酸、羟基马来酸、苯基乙酸、谷氨酸、安息香酸、水 杨酸、磺胺酸、富马酸、甲磺酸、和甲苯磺酸等制备的盐。盐还包括来自无机碱，如氨水、羟乙 胺和胼的盐。适用的有机碱包括甲胺、乙胺、丙胺、二甲胺、二乙胺、三甲胺、三乙胺、乙二胺、 羟乙胺、吗啉、哌嗪和胍。在任何情况下，药物组合物优选制成含有给定量所需治疗药(如苯达莫司汀)和 载体(即生理可接受的赋形剂)的剂量单位的形式。任何这样的分子对人类或其它哺乳动 物(或其它动物)的治疗有效量的构成，将取决于各种因素，其中包括疾病或病症的类型、 年龄、体重、性别、对象的医疗状况、病情严重度、施用途径、采用的具体化合物。因此，剂量 方案可以变化很大，但用标准方法可以常规确定。任何情况下，化疗药的“有效量”是引起 想要的细胞毒性的量。为达到想要的作用，所述治疗分子的需要量将取决于众多的考虑事 项，包括特定分子本身、要治疗的疾病或病症、对象的癌症响应分子的能力，给药途径等。为 达到想要的作用，所需的该分子的精确量取决于执业医师的判断，并对每个单独的对象是 特定的。但是，适用剂量可以从每天每千克体重约数纳克(ng)活性成分至约数毫克(mg)。治疗组合物的制备是本领域公知的。通常，这样的组合物制成注射剂，或为液体 溶液或为悬液，但是，也能制成注射前适合溶解在或悬浮在液体中的固体形式。制剂也能被 乳化。活性治疗成分经常同生理可接受并与活性成分可兼容的赋形剂混合。适用的赋形剂 是，例如注射用水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等、及其组合。另外，如果需要，组合物可以含有少量提高活性成分的有效性的助剂如润湿或乳化剂、退热剂、稳定剂、增稠剂、悬浮剂、麻醉 剂、防腐剂、抗氧化剂、抑菌剂、止痛剂、PH缓冲剂等。所述成分能提供附加的治疗效益，或 作用于预防施用药物组合物可能造成的任何潜在的副作用。本发明的组合物以含有常规载体、助剂和介质的剂量单位制剂，可以口服施用、通 过吸入喷雾剂胃肠外施用、直肠施用、结内施用(intranodally)、鞘内施用、或局部施用。在 治疗组合物是为了人类施用的情况下，应用药物可接受的载体。术语“药物可接受的载体” 和“生理可接受的载体”指施用于对象时，生理可耐受并且通常不产生不想要的过敏或类似 不当反应的分子实体和组合物，所述不当反应如胃不适、头晕等。对于口服施用，组合物可以是任何适当的形式，其中包括例如胶囊、片齐IJ、锭齐U、软 锭剂、粉剂、悬液剂或液体。液体可以作为带有适当载体包括盐水、葡萄糖或水的组合物注 射施用。术语“胃肠外”包括经皮下、静脉内、肌内、胸骨内或腹腔内途径输注(包括持续或 间断输注)和注射。直肠施用的栓剂可以通过将活性成分与适当的无刺激赋形剂如常温下 为固体但生理温度下为液体的可可脂和/或聚乙二醇混合而制备。组合物也可以制备成固体形式(包括颗粒、粉末或栓剂)。组合物可以经过传统的 药物操作如杀菌和/或可含有传统的助剂如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、缓冲剂等。口 服施用的固体剂型可包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在所述固体剂型中，活性化合物 可以与至少一种惰性赋形剂如蔗糖、乳糖或淀粉混合。所述剂型也可包含除了惰性稀释剂 以外的附加物质，如润滑剂例如硬脂酸镁。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型也可包含缓 冲剂。片剂和丸剂也可另外制备成带有肠衣。口服施用的液体剂型也可包括药物可接受的 乳液、溶液、悬液、糖浆和酏剂，其含有通常用于本领域的惰性稀释剂如水。所述组合物也可 包含助剂，如润湿剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。注射制剂如无菌注射含水或含油悬液，可以根据已知方法用适当的分散剂或润湿 剂和悬浮剂制备。注射制剂也可以是在胃肠外可接受的无毒稀释剂或溶剂中的无菌注射溶 液或悬液。可以用的适用介质和溶剂是注射用水，Rimger溶液和等渗的氯化钠溶液等。另 外，无菌固定油可以用作溶剂或悬浮介质。为此，可以用任何温和的固定油，包括合成的甘 油一酯或甘油二酯。另外，发现了脂肪酸如油酸在制备注射剂中的用途。作为局部用药，组合物的适当的局部剂量可以每天施用一至四次，优选两或 三次。该剂量的施用也可以有期间不用药的居间日。局部施用的适用组合物常包含 0. 001% -10% w/w的活性成分，例如制剂的1-2重量％，尽管它可包含多达10% w/w，但优 选不超过5 % w/w,更优选为制剂的0. 1 % -1 %。适于局部施用的制剂包括适于透过皮肤的 液体或半液体的制剂(如擦剂、洗剂、膏剂、霜剂或糊剂)，滴剂适合对眼睛、耳朵或鼻子施 用。施用本发明的组合物的示例性方法(如使其达到消毒或无菌条件)，对于技术人 员是显见的。适合该目的的某些方法在Goodman和GiIman的The Pharmacological Basis of Therapeutics, 7th Ed. (1985)中提出。对患者的施用可以是间断的；或者是以逐步的、 持续的、恒定的、或控制的速度施用。苯达莫司汀治疗非何杰金氏淋巴瘤的典型治疗有效剂量可以约60-120mg/m2，连 续两天单剂施用，或在剂量之间间隔数日。可以大约每三至四周为周期重复。为了治疗慢 性淋巴细胞白血病(CLL)，可以在第1和2天给予苯达莫司汀约80-100mg/m2。可以在大约4周后重复该周期。为了治疗何杰金氏病(II-IV期)，在"DBVBe方案"中可以给予苯达 莫司汀伴第1和15天用柔红霉素25mg/m2，第1和15天用博来霉素10mg/m2，第1和15天 用长春新碱1. 4mg/m2,以及第1-5天苯达莫司汀50mg/m2，大约每四周为周期重复。对于乳 腺癌，可以在第1和8天给予苯达莫司汀(120mg/m2)联合第1和8天氨甲蝶呤40mg/m2，以 及第1和8天5-氟脲嘧啶600mg/m2，大约每四周为周期重复。作为乳腺癌的二线治疗，苯 达莫司汀可以在第1和2天给予大约100-150mg/m2，大约每四周为周期重复。本发明的方法包括单一疗法和联合治疗。在联合治疗的情况下，本发明预想了施 用两种或多种化疗剂。各种各样的化疗剂是本领域已知的。这些化合物中一些已经被许 可用于治疗一种或多种癌症适应症。另一些在不同阶段的临床前和临床开发中。适合实 行本发明的联合治疗的化疗剂实例包括烷化剂白消安、卡钼、卡莫司汀、顺钼、苯丁酸氮芥、 环磷酰胺、达卡巴嗪、六甲嘧胺、异环磷酰胺、洛莫司汀、双氯乙基甲胺、美法仑、米托坦、丝 裂霉素、哌泊溴烷、丙卡巴胼、链脲菌素、噻替哌和三亚乙基密胺。优选的与苯达莫司汀合用 的抗代谢物类包括卡培他滨、氯脱氧腺苷、阿糖胞苷(及其活性形式，ara-CMP)、阿糖胞苷、 dacabazine、氟尿苷、氟达拉宾、5-氟脲嘧啶、吉西他滨、羟基脲、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、喷 司他丁、三甲曲沙和6-巯基鸟嘌呤。优选的与苯达莫司汀合用的抗有丝分裂的化合物包括 诺维本、紫杉醇、泰素帝、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞宾。其它类的化疗剂包括拓扑异构酶I抑制剂(如喜树碱(camptothecin)，伊 立替康(irinotecan)，拓扑替康(topotecan)等)；拓扑异构酶II抑制剂如柔红霉素 (daunorubicin)、阿霄素(doxorubicin)、依托泊昔(etoposide)、伊达比星(idarubicin)、 米托蒽醌(mitoxantrone)和替尼泊甙(teniposide)；血管生成抑制剂(如达肝素 (dalteparin)，苏拉明(suramin)等)；抗体，包括阿仑单抗(alemtuzumab)、贝伐
Jtl (bevacizumab)、胃 # 罗了 (bexarotene)、epratuzumab> pf ^ Jfl (gemtuzumab ozogamicin)、伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、甲石黄酸伊马替尼(imatinib mesylate)、 雷替曲噻(raltitrexed)、revlimid、利妥昔单抗、曲妥珠单抗(trastuzumab)；酪氨酸激 酶抑制剂；插入剂；和激素，如阿那曲唑(anastrozole)、雌激素、抗雌激素(如氟维司群 (fulvestrant)和他莫昔芬(tamoxifen))、依西美坦(exemestane)、氟他胺(flutamide)、 戈舍瑞林(goserelin)、亮丙瑞林(Ieuprolide)、尼鲁米特(nilutamide) > levimasole、 来曲唑(Ietrozole)、泼尼松(prednisone)和托瑞米芬(toremifene)。其它化疗剂包 括蛋白质如血管生成抑制素、天冬酰胺酶、deniluekin diftitox、血管内皮抑素、咪喹 莫特(imiquimod)、干扰素、白细胞介素-11和培加帕酶(pegaspargase)。还有其它 的化疗剂包括分子，如9-顺式视黄酸(alitretinoin)、六甲嘧胺(altretamine)、氨 磷汀(amifostine)、安丫啶(amsacrine)、三氧化砷、博来霉素(bleomycin)、卡培他滨 (capecitabine)、羧酰胺三唑、塞来考昔(celecoxib)、更生霉素(dactinomycin)、表柔比 星(印irubicin)、geldanmycin、17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素(17AAG)、伊 立替康、2-甲氧雌二醇、光辉霉素(mithramycin)、丝裂霉素C(mytomycin C)、奥沙利钼 (oxaliplatin)、鲨胺(squalamine)、替莫唑胺(temozolamide)、沙利度胺(thalidomide)、 tretinoin triapine和valrubicin。本领域人员应体会，这些和其它现在已知或之后开发 的化疗剂可以与苯达莫司汀合用，治疗各种肿瘤，包括癌症。实施例
提供下列实施例用于说明本发明的某些方面，并帮助本领域技术人员实施本发 明。这些实施例决不能认为是以任何方式限制了发明的范围。实施例1苯达莫司汀作用机制的分子学分析A.引言苯达莫司汀(Treanda ，Salmedix,Inc. CA ；Ribomustin (Ribosepharm GmbH, Munich Germany))是一种抗肿瘤剂，已被临床前和临床证明对抗各种人类肿瘤的活性，如 非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴细胞白血病、实体瘤、乳腺癌和小细胞肺癌，以及多种骨 髓瘤，包括传统DNA损伤剂难治性肿瘤。苯达莫司汀，4-{5_[双(2-氯乙基)氨基]-1-甲 基-2-苯并咪唑基}盐酸丁酸，最初的合成是为了产生具有低毒以及兼具烷基化和抗代谢 物性质的药剂。它具有三个亚结构元件2_氯乙基氨烷基化基团；苯并咪唑环；和丁酸侧 链。2-氯乙基氨烷基化基团与其它氮芥类，如环磷酰胺、苯丁酸氮芥和美法仑共用。虽然苯 丁酸氮芥中也有丁酸侧链，但苯并咪唑中央环体系是苯达莫司汀的独有特点。其独特的抗 肿瘤活性特点可能归功于这种多层面结构，并使其与传统的烷化剂区别开来。DNA烷化剂在化疗物质中极为有用。这些药物具有预料不到的作用机制，如这些化 合物中的一些诱导程序化坏死的能力，和另一些(如钼类(platins))甚至在缺少核的细胞 中诱导细胞程序性死亡的能力。在“氮芥”的情况下，主要的差异存在于各种适应症中它们 的区别使用所反映的活性图谱环磷酰胺，主要用于治疗NHL ；苯丁酸氮芥，用于治疗慢性 淋巴细胞白血病；美法仑，治疗多发性骨髓瘤。苯达莫司汀主要的抗肿瘤作用，与其它烷化剂相同，来自DNA配对链之间形成交 联，虽然也可包括其它作用方式。因此，苯达莫司汀的抗肿瘤作用可以源于比简单的经典 烷基化活性更为复杂的机制，因为苯达莫司汀导致的DNA链断裂比环磷酰胺或BNCU导致 的明显更持久，苯达莫司汀表现出对在体外和离体抗其它烷化剂的细胞系的对抗活性，并 已证明苯达莫司汀作为单一药剂以及与其它抗癌剂合用，在数个体外肿瘤模型中具有独特 的促细胞程序性死亡活性。对苯达莫司汀作用确切机制的详细分子研究还很少。为此， 运用现有的分子工具充分详细分析苯达莫司汀的作用机制。本实施例介绍了来自药物基 因组学分析的结果来分析苯达莫司汀在NHL细胞系中引起的基因表达图谱的改变。这些 药物基因组学分析通过处理细胞程序性死亡信号的启动、DNA修复机制和有丝分裂关卡的 调节的功能分析来验证。最终，苯达莫司汀在体外筛选中，以国家癌症研究所(National CancerInstitute)的人类肿瘤60个细胞系表征，并且研究了其相对于烷化剂库(即苯丁酸 氮芥和磷酰胺氮芥(环磷酰胺的代谢物))的比较活性。利用药物基因组分析进行苯达莫 司汀在NHL细胞系中引起的基因表达图谱改变的分析，也产生了结果。这些药物基因组学 分析通过Q-PCR和处理细胞程序性死亡信号的启动、DNA修复机制和有丝分裂关卡的调节 的功能分析来验证。总之，这些结果表明苯达莫司汀具有与其它烷基化药物不同的多种作 用机制，解释了苯达莫司汀在患有传统疗法难治性肿瘤的患者中的活性。B.材料与方法a.细胞SU-DHL-I 细胞从加利福尼亚圣地亚哥大学(University CaliforniaSan Diego) 得到。细胞在补充有10% FBS(Invitrogen)和100单位/ml青霉素/链霉素的RPMI
141640 (Hyclone)上生长。b.试剂盐酸苯达莫司汀得自Fujisawa Deutschland(Munich，德国)。磷酰胺氮芥环己 胺盐(PM，NSC69945)，环磷酰胺的活性代谢物，得自国家癌症研究所(NCI)发展治疗计划 (Developmental Therapeutics Program, DTP)的合成物贮藏库。其它所有的试剂得自商 业来源，如 Sigma-Aldrich。c.药物处理对于本实施例的多数分析，选择使用的苯达莫司汀、磷酰胺氮芥(环磷酰胺的活 性代谢物)和苯丁酸氮芥浓度，基于用MTT分析经三天时间测定的它们的细胞毒活性。在 DMSO中制备药物，然后在培养基中稀释。d.制备RNA样品和分析表达数据细胞(5xIO6 细胞)收集在 ImL TRIZOL 液(Invitrogen，San Diego, CA)中， 然后按照制造商的说明书分离总RNA。生物素标记的cDNA(15 μ g)与每个基因芯片阵列 (Affymetrix, Santa Clara)杂交。简言之，制备杂交到芯片上的材料的程序包括多个步骤。 分离总RNA并通过光密度定量。⑶NA的产生用特定的能识别与T7启动子(dT7-(T)24)结 合的PolyA尾的特定引物，与dNTP、DTT和Superscript II产生cDNA第一条链。这种方法 减少了对分离的poly-A(+)mRNA的需要。第二条链通过加入dNTP，用DNA连接酶、DNA poll 和RNAse H合成，并在加入T4DNA聚合酶再培养5分钟之前，在16°C培养2小时。进行cDNA 柱纯化和定量。在与高密度寡核苷酸阵列杂交之前，进行体外转录(IVT)。该反应的启始 材料是ι μ g cDNA，其中加入NTP，该NTP少于25%的CTP和UTP是通过加入IOmM生物素 化-Il-CTP和IOmM生物素化-16-UTP来代替。最后在37°C下加入在适当的缓冲液中的T7 酶6h，产生生物素化的IVT RNA，然后将其进行柱纯化(RNeasy，Qiagen)。化学片段的IVT RNA (15 μ g)与对照寡核苷酸、标准(包括管家基因)和鲑鱼精子DNA在适当的缓冲液中混 合，加热到95°C 5分钟，与芯片在42°C下杂交16h。未杂交的材料用2XSSPE洗掉，然后在反 应中加入藻红素标记的抗生物素蛋白。洗掉过量的荧光染料，然后扫描芯片每个合成部件 的荧光强度(合成部件为7. 5平方微米)。e.生物信息分析开发了分析基因表达数据的策略和方法，其涉及运用C0RG0N法分析Affymetrix 基因芯片的扫描图像。C0RG0N是免费使用的软件，其核心统计方法已知(Sasik，et al. (2002)，Bioinformatics, vol. 18，no. 12 1633-40) 只有在至少一种情况下呈现 ρ < 0. 05 (95%置信水平)的基因要考虑作进一步分析。C0RG0N与Affymetrix Microarray Suite (AMS) 5. 0软件的比较表明，C0RG0N的假阳性误差率为4. 4%，比较之下，AMS 5. 0为 29%。所选的基因根据调节的平均值或峰宽来分选。基于表达模式的相似性，选择前100 个受调节水平最高的基因进行聚类。采用分级聚类法。这种最初分类在确定研究中什么是 主要基因和该方法的调节途径中极为有用。表现出共调节的基因簇接受启动子分析。下一 步是G03分析，是在Gene Ontology数据库(网址www. geneontology. org)中发现与该过 程有关的统计学显著性条件的无偏和无监督工具。G03易化了识别被显著调节的系统关键 成分的过程。在数据库中有三种本体(ontology)分子功能；生物过程；和细胞成分。该分 l/fi aids Research Genomics Core Facility ^ UCSD Center 巾 it if。
f.定量PCR分析特定转录的表达水平用定量PCR (Q-PCR)确定。用RNeasymini-pr印试剂 盒(Qiagen，Valencia, CA)分离每个处理过的SU-DHL-1细胞沉淀的总RNA。cDNA用 ThermoScript逆转录试剂盒(Invitrogen)和寡_dT引物根据制造商的方案制作。Q-PCR 扩增和定量用iCycler机(Bio-RAD，Hercules, CA)进行。样品扩增在25 μ L含有2x IQSybrGreen Mix (Bio-Rad) 12. 5 μ L、各引物 1 μ M 和对应于 80ng 总 RNA 的 cDNA 体积的容 量中进行。循环条件为95°C 5秒；每个引物的适当退火温度下30秒；以及72°C 30秒。分 析的靶特异性通过熔融曲线分析来验证。各个基因的表达相对于每个样品18s表达水平进 行标准化。然后通过 Livak and Schmittgen ((2001), Methods, vol. 25 402-408)的方法 计算各个基因相对于未处理的对照的表达。用BeaconDesigner (Premier Biosoft, Palo Alto,CA)设计引物或根据文献设计。引物序列和退火温度如下(各引物按5’至3’书写， 后面是其SEQ IDN0)基因ID正向引物反向引物退火温度
18sCGCCGCTAGAGGTGAAATTC(1)TTGGCAAATGCTTTCGCT (2)55 0C
p21CCTCATCCCGTGTTCTCCTTT(3)GTACCACCCAGCGGACAAGT(4)57 0C
NoxaATTTCTTCGGTCACTACACAA(5)AACGCCCAACAGGAACAC(6)55 0C
PLK-ICTCAACACGCCTCATCCT(7)GTGCTCGCTCATGTAATTGC(8)57 0C
Aurora ATCCTTGTCAGAATCCATTACCTGT(9)GAATGCGCTGGGAAGAATTTG (10)55 0C
Aurora BAGAGTGCATCACACAACGAGA(11)CTGAGCAGTTTGGAGATGAGGTC (12)56 0C
Cyclin BlAGTGTGACCCAGACTGCCTC(13)CAAGCCAGGTCCACCTCCTC (14)57 0C
ExolTTGGTCTGGAGGTCTTGGAGA(15)GAATCGCTCTTTCTTCGGAACTG (16)57 0C
g.比较分析
苯达莫司汀在NCI的由60个人类肿瘤细胞系组成的体外抗肿瘤筛查中进行实验。
实验包括10倍稀释液中最少5个浓度，每个筛查重复两次。采用48小时持续药物暴露方 案。磺酰罗丹明(Sulforhodamine)B蛋白分析评价细胞的存活能力或生长。比较法和相关 数据可由发展治疗计划(DTP)的网站(网址dtp. nci.nih.gov)免费获得。NCI指定的苯 达莫司汀号NSC138783。h. Western 印迹分析SU-DHL-I细胞用50 μ M苯达莫司汀、2 μ M苯丁酸氮芥或20 μ M磷酰胺氮芥培 养20小时。细胞用Ix PBS清洗两次并用在裂解之前直接加入的冰冷的裂解缓冲液(1Μ Tris-HCl (ρΗ7. 4)，IM KCl,5mMEDTA, 1 % NP-40,0. 5 % 脱氧胆碱钠，带有 ImM 原钒酸钠 (sodiumorthovanidate)、lmM氟化钠、蛋白酶抑制剂混合物(Roche，Nut ley, NJ)和磷酸酶 抑制剂混合物(Sigma，St. Louis, MO))进行裂解。沉淀不溶的膜、DNA和其它沉淀物，得到 蛋白上清。蛋白质浓度用Bradford分析(Pierce，Rockford，IL)测定。20 μ g裂解产物用 凝胶电泳在4-12%的聚丙烯酰胺凝胶上分离，转移到硝化纤维素膜(Invitrogen)上，用下 列单克隆一抗通过免疫印迹法检测抗-P53、抗-磷酸化p53 (Serospecific)、抗-21、抗裂 解的PARP (半胱天冬酶特异性切割位点)，均购自Cell Signaling (Beverly, ΜΑ)；抗-Bax 和抗PARP，购自BD Pharmingen(San Diego, CA)；以及抗-β肌动蛋白，用作点样对照，购自Sigma (St. Louis，M0)。一抗在轻柔振动下，4°C培养过夜。膜用Ix PBS洗三次，用Alexa Flour680 山羊抗小鼠的二抗(1 4000) (Molecular Probes,Eugene,OR)在室温下轻柔振 动培养2小时。印迹用Ix PBS洗三次，在LiCor Odyssey扫描器上扫描。i.基于细胞的体外Ape-I和AGT分析细胞或用6mM甲氧胺(Sigma)或用50 μ M O6-苄基鸟嘌呤(Sigma)预先培养30 分钟，二者分别是Ape-I碱基切除修复酶和烷基脒基转移酶(AGT)的抑制剂。然后将细胞 暴露在各种浓度的指示剂下72小时。用MTT分析(13)评价细胞毒性，测定IC5tl作为未处 理的对照数值被抑制了 50%时的药物浓度。用GraphPad Prism 3. 00版GraphPad软件 (SanDiego, CA)进行分析。j.细胞周期分析SU-DHL-I细胞用等毒浓度(IC5tl)的苯达莫司汀(50μΜ)、苯丁酸氮芥(4 μ Μ) 或磷酰胺氮芥(50μΜ)培养8小时。细胞用PBS清洗，并固定在20°C的70%乙醇 中至少1小时。固定的细胞通过PBS清洗重新水合。细胞重新悬浮在由IOyg/ ml 鹏化丙 Pg (Calbiochem, La Jolla, CA)、10 μ g/mlRNAse A(DNase free, Novagen, Madison, WI)和10 μ 1/ml Triton-X (Sigma)在PBS中组成的碘化丙啶染色液中。样 品用 FACSCalibur(BDBiosciences，San Jose, CA)分析。用 DNA ModFit LT(Verity HouseSoftware, Inc. Sunnyvale, CA)模型软件分析细胞周期分布。LH2AX转化灶形成细胞在 Lab-Tek 室玻片(chamber slides) (NaIge Nunc Intl.，Naperville, IL) 上，于补充有10% FBS的RPMI 1640培养基中生长。让细胞附着至少一天后，细胞在培养 基中用DMSO或50 μ M苯达莫司汀处理。细胞在37°C培养30分钟，然后用PBS洗两次。在 37°C再培养4小时。然后细胞用Ix PBS洗两次，并在-20°C的100%乙醇中培养10分钟 固定细胞。然后清洗三次，每次用Ix PBS洗5分钟。室温下在封阻缓冲液(10% FBS的 Ix PBS, 1% BSA)中培养1小时。玻片在4°C下用一级多克隆抗-H2AX抗体(R&D Systems, Minneapolis，MN)振摇过夜培养。抗体在封阻缓冲液中以1 10，000的比例稀释。玻片 用 Ix PBS 洗三次，并用 Alexa Flour 488 山羊抗兔二抗(1 4000) (Molecular Probes, Eugene, OR)室温下轻柔振摇培养45分钟。玻片用Ix PBS洗三次，然后取下舱室，细胞中 加入带有 DAPI (Molecular Probes)的退色防止剂(SlowFade Light Antifade)，并用盖玻 片封闭玻片。用具有DIC光学和荧光、Zeiss AxioCam HRm照相机和Zeiss Axiovision软 件4. 2版的电控Zeiss AxioPlan 2e成像显微镜进行分析。1.免疫印迹中H2AX在Ser 139残基的磷酸化细胞系生长，铺满补充有10% FBS的RPMI 1640培养基。然后细胞用Ix PBS洗 两次，并用在裂解之前直接加入的冰冷的裂解缓冲液(1M Tris-HCl (pH7. 4)，IM KCl, 5mM EDTA，NP-40，0. 5%脱氧胆碱钠，带有 ImM 原钒酸钠(sodium orthovanidate) UmM NaF、 蛋白酶抑制剂混合物(Roche，Nut ley，NJ)和磷酸酶抑制剂混合物(Sigma，St. Louis, MO)) 进行裂解。沉淀不溶的膜、DNA和其它沉淀物，得到蛋白上清。蛋白质浓度用Bradford分 析(Pierce，Rockford, IL)测定。20微克裂解产物用凝胶电泳在4-12%的聚丙烯酰胺凝 胶上分离，转移到硝化纤维素膜(Invitrogen，Carlsbad, CA)上，用多克隆抗-H2AX抗体 (R&DSystems，Minneapolis，MN)通过免疫印迹法检测。抗体在封阻缓冲液中以1 2000的比例稀释，膜在室温下轻柔振动培养2小时。膜用Ix PBS洗三次，用Alexa Flour 680 山羊抗兔的二抗(1 5000) (Molecular Probes, Eugene, OR)在室温下轻柔振动培养2小 时。印迹用Ix PBS洗三次，在LiCor Odyssey扫描器上扫描。C.结果a.基因表达图谱鉴定了受不同于苯丁酸氮芥或环磷酰胺的苯达莫司汀调节的特 征基因通过测定细胞暴露在药物下三天后的存活率，测定苯达莫司汀、苯丁酸氮芥和磷 酰胺氮芥(环磷酰胺活性代谢物)的等毒浓度。对于本研究出现的分析，选用的苯达莫司 汀、磷酰胺氮芥和苯丁酸氮芥的浓度以该数据为基础(下面的表1)。这些浓度也反映了各 药的临床可实现水平。AffymetriX基因芯片分析用于比较在药物处理过的SU-DHL-I (非 何杰金氏淋巴瘤细胞系)中超过12，000个基因的表达水平，细胞与对照细胞比较。 SU-DHL-I细胞用IC5tl浓度(25 μ M)和IC9tl浓度(35 μ Μ)的苯达莫司汀培养。苯丁酸氮芥 和环磷酰胺代谢物磷酰胺氮芥在IC9tl，即分别为5 μ M和50 μ M下，进行测试。药物处理后8 小时监测基因表达，鉴定该早期应激反应的最接近事件。基因组分析揭示，在三个受试药物之间，多数基因的调节相似，如前100个受调节 的基因的簇图所示(图1Α)。大多数基因暴露于药物后被上调(红色)。基因的亚群在药 物处理后被抑制转录(蓝色)。重要的是，鉴定了一组基因，其表现出被苯达莫司汀的调节 较之其它两个受试药有差异。已知很多被诱导的基因(图1Β)在其启动子区具有ρ53-反应元件，被认为是ρ53 依赖性的。这些基因的实例有Ρ21(ρ53-诱导的细胞分裂激酶抑制剂)；wipl(p53-诱 导的蛋白磷酸酶1) ；N0XA(p53-诱导的促细胞程序性死亡Bcl-2家族成员)；DR5/ KILLER( P 53-调节的DNA损伤-可诱导的细胞死亡受体)；和BTG2。有趣的是，在前100个 受调节的基因中，鉴定了肿瘤坏死因子受体超家族的四个成员(成员6、9、10和10b)。这些 基因中数个已表现出在调节外在细胞程序性死亡途径(REF，TRAIL/TNF细胞程序性死亡) 中有关键作用。另外几个基因在苯达莫司汀和另两个化合物之间表现出相反的趋势(数据 未显示)。这些基因受苯达莫司汀两种浓度的上调，但均被苯丁酸氮芥和磷酰胺氮芥下调。为了评价苯达莫司汀、苯丁酸氮芥和磷酰胺氮芥之间的药物基因组学差异，基因 图谱的结果用G03软件重新分析，该软件是无偏和无监督工具，用于在Gene Ontology(GO) 数据库中(网址WWW，gene0nt0l0gv. org)发现与该过程有关的有统计学显著性的条件。在 苯达莫司汀处理的细胞中明显上调或下调的基因和超过或低于对照处理的细胞表达至少 1.5倍的基因与Gene Ontology(GO)联盟提供的生物过程注解关联。基于GO注解的分级结 构，每个紧接着的子项目与所选基因数目关联的可能性(P值)用概率进行计算。DMSO处理 的对照和苯达莫司汀处理的细胞(在IC9tl剂量)相比较的GO分析结果报告在下文表2中。 在下面的表2中，第一列说明一般类别，第二和第三列是特定生物过程的编号和名称，最后 一列是每个过程的P值。P值用G03软件计算。发现四个主要的功能组被苯达莫司汀统计 水平调节=(I)DNA损伤，应激反应，细胞程序性死亡；(2) DNA代谢，DNA修复，转录；(3)细胞 增殖，细胞周期，有丝分裂关卡；和(4)细胞调节。这些组每个都包括数个被发现受到苯达 莫司汀明显调节的生物过程。P值最低且因此最具统计显著性的生物过程是对DNA损伤 应激的反应(G06974) ；DNA代谢(G06259)；和细胞增殖(G08283)。
用苯丁酸氮芥和磷酰胺氮芥进行类似的分析提示，用苯达莫司汀和苯丁酸氮芥得 到的图谱之间很少有重叠。苯达莫司汀和磷酰胺氮芥之间观察到基因调节的一些相似性， 虽然只限于“DNA代谢，DNA修复，和转录”组。这些结果为选择特定基因产物进行定量验证 苯达莫司汀的基因阵列结果和更确定的区别提供了基础。b.用实时定量Q-PCR分析进行基因组分析的验证阵列数据的证实和验证通过实时定量PCR分析(Q-PCR)进行。当将苯达莫司汀与 其他检验的烷化剂相比较时，数个参与P53-信号转导、细胞程序性死亡、DNA修复和细胞周 期/有丝分裂关卡的基因均被差异调节。为Q-PCR验证选择的“经典的”p53-依赖性基因的两个实例是，p21 (Cipl/ffafl)， 细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A，和促细胞程序性死亡BH3-only Bcl_2家族成员， Ν0ΧΑ。暴露于苯达莫司汀8小时后，发现两个基因均在SU-DHL-I细胞中被诱导。两个基因 也被等毒浓度的磷酰胺氮芥和苯丁酸氮芥诱导，但程度低得多(图2A)。从验证分析中显现的最惊人的结果之一是，数个有丝分裂-相关基因的差异化调 节，包括polo-类激酶I(PLK-I)、Aurora激酶A和B、以及细胞周期蛋白B 1。这些基因被 认为在有丝分裂关卡的调节中发挥了重要作用。用苯达莫司汀处理导致所有这些基因的 mRNA表达下调了 60-80%。相比之下，磷酰胺氮芥和苯丁酸氮芥对这些基因的转录本仅仅 发挥了很小的效应，可能除了 Aurora激酶(图2B)。在分析DNA-修复基因核酸外切酶-I(EXOl)的mRNA表达中也显现出不同。苯达 莫司汀诱导的Exol表达上调(2.5倍)(图20较之磷酰胺氮芥(1.5-倍)或苯丁酸氮芥 (1.8-倍)稍微强一些。Fenl (flap核酸内切酶1)也被苯达莫司汀上调，用等毒浓度的磷 酰胺氮芥时，该基因也被上调同样水平(图2C)。c. NHL细胞中苯达莫司汀的细胞程序性死亡信号转导为了仔细研究NHL细胞中参与苯达莫司汀-诱导的程序化细胞死亡的分子事件， 用免疫印迹分析监测关键的细胞程序性死亡蛋白的表达。结果清楚表明，苯达莫司汀能有 效和迅速地触发典型的p53-依赖性细胞程序性死亡途径。正如用特异识别丝氨酸-15残 基磷酸化的抗体所检测，起始和顶端事件之一是诱导P53磷酸化。在暴露于苯达莫司汀的 SU-DHL-I细胞中观察到丝氨酸-15磷酸化p53上调了 8倍，而在磷酰胺氮芥处理的细胞中， 仅见到轻微上调，苯丁酸氮芥处理的细胞没有发现变化(图3，左上图)。与磷酸化p53平行，在苯达莫司汀处理的细胞中，总p53的表达强烈上升。苯丁酸 氮芥处理的细胞表现出总P53的少量增加，而暴露于磷酰胺氮芥没有诱导p53水平改变。 与P53蛋白表达水平的改变相比较，在p21蛋白表达中观察到的变化，对于各药是轻微的。 仅在苯达莫司汀处理的SU-DHL-I细胞中，观察到Bax (关键的BH3-only促细胞程序性死亡 Bcl-2家族成员)的蛋白表达增加(图3，左下板)。在比较苯达莫司汀与磷酰胺氮芥和苯丁酸氮芥的作用中，观察到的最惊人的差异 是在比较PARP(聚ADP核糖聚合酶-1)的表达时发现的。PARP是关键的NAD需要的酶，在 DNA修复机制中很重要。PARP也是促细胞程序性死亡的蛋白水解半胱天冬酶(caspase)的 “早期”底物。用苯达莫司汀处理的SU-DHL-I细胞表现出PARP蛋白表达的急剧减少(图 3，右上图)。PARP表达减少的原因是它被半胱天冬酶切割，这被“切割_特异性”抗体识别 的蛋白水解切割产物的出现所证实(图3，中右图)。值得注意的是，在以等毒浓度的磷酰
19胺氮芥或苯丁酸氮芥处理的NHL细胞中，没有检测到PARP表达的改变。当用双倍等毒剂量 的磷酰胺氮芥(40 μ Μ)和苯丁酸氮芥(4 μ Μ)，而保持苯达莫司汀(50 μ Μ)的剂量时，结果是 相似的(数据未显示)。因此，评价PARP表达水平可以用于各种目的。例如，PARP分析可 以提供具体治疗方案有效性的指示，其中PARP表达减少(优选在蛋白水平测定，例如通过 PARP活性，PARP切割产物的存在，等等)指示施用的药物具有所需的作用。另外，PARP分 析可以用于前瞻性地确定，例如，组织的细胞(例如，来自活检或其它生物样品的细胞)是 否可能对特定治疗起反应(如，苯达莫司汀单一治疗或其中疗法之一利用了苯达莫司汀的 组合治疗)。d.抑制碱基切除修复，但不是O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶修复，阻断了苯达 莫司汀的活性用Ape-I抑制剂甲氧胺评价修复酶Ape-I的作用，它是一种无嘌呤核酸内切酶，在 苯达莫司汀和环磷酰胺代谢物磷酰胺氮芥的细胞毒活性中，在碱基切除修复(BER)中起到 关键的作用。加入甲氧胺，苯达莫司汀的IC5tl降低了约四倍(从大约50μΜ至大约12μΜ) (图4Α)。反之，加入甲氧胺时，磷酰胺氮芥的ICstl只有轻微改变。结果提示BER可能在修 复苯达莫司汀诱导的DNA损伤中起了重要作用，而不是在修复环磷酰胺诱导的损伤中。O6-苄基鸟嘌呤，一种已知的O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)，对苯达莫司 汀的抗肿瘤活性的作用也在SU-DHL-I细胞中进行了测试。结果表明，加入O6-苄基鸟嘌呤 不提高苯达莫司汀细胞毒效力。环磷酰胺得到了相反的结果，提示与环磷酰胺不同，苯达莫 司汀对O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶DNA修复机制并不特别依赖(图4Β)。e.盐酸苯达莫司汀迅速引起导致独有的细胞周期改变的双链断裂形成为了研究盐酸苯达莫司汀引起双链断裂(DSBs)的能力，分析了两个生化标记以 免疫荧光法进行H2AX组蛋白的核定位；和用免疫印迹分析H2AX Serl39残基的磷酸化。结 果证实，盐酸苯达莫司汀在各种肿瘤细胞中有力和迅速地诱导DSBs，包括多药抗性和p53 缺陷的细胞系。用50 μ M盐酸苯达莫司汀培养，导致在短至30分钟的时间内，可检测到核 内转化灶的形成。时程分析显示，在持续暴露在盐酸苯达莫司汀24小时后以及在很短时间 暴露于药物(30分钟)，随后药物被清除(洗脱后)，可检测到Y -Η2ΑΧ的Serl39磷酸化。 盐酸苯达莫司汀诱导的H2AX磷酸化发生得早于其它2-氯乙基胺DNA烷化剂如环磷酰胺。 SU-DHL-I淋巴瘤细胞暴露于50 μ M盐酸苯达莫司汀8小时的细胞周期分析显示，平均S-期 分布增加了超过40%，而没有伴随的G2M停滞。暴露于等毒浓度的苯丁酸氮芥和环磷酰胺， 分别增加了 S-期分布大约20%和15%。这些发现说明，盐酸苯达莫司汀能诱导DNA双链 断裂，即便是在短暂的30分钟暴露后。f.用NCI比较分析，苯达莫司汀表现出独特的活性图谱在国家癌症研究所(National Cancer Institute)的临床前抗肿瘤药物发现筛选 (NCI筛选)的60个人类细胞系中，评价苯达莫司汀的细胞毒性。NCI筛选适用于从超过 45，000个化合物和天然产物的大范围数据库中，比较潜在的抗肿瘤剂与已知治疗剂的相对 效力。COMPARE分析用苯达莫司汀作为“种子”产生的GI50结果运行。具有高Pearson相 关系数(PCC)的化合物经常具有相似的作用机制。在NCI筛选中，没有表明苯达莫司汀与 任何药有强相关(> 0. 8)(下面的表3)。在与苯达莫司汀匹配的前六个之外，只有甲基化 剂DTIC(达卡巴嗪)表现出大约80%的相关一致性(r值)。反之，鉴别出了 25个与美法
20仑、苯丁酸氮芥或环磷酰胺的活性代谢物相关系数超过0. 83的化合物。另外，在此筛选中， 美法仑、苯丁酸氮芥和环磷酰胺敏感性模式的直接比较表明这三个药物之间有高相关系数 (0. 762-0. 934，数据未显示)。这些数据显示了药剂的敏感性图谱的统计学一致性和作用机 制共用的高似然率。苯达莫司汀和氮芥类其它成员之间缺少相关性是引人注目的，并揭示 苯达莫司汀具有独特的抗肿瘤活性模式。D.讨论用各种生物和分析工具得到的这些实验的结果表明，与其它共享相同“氮芥”活 性部分的临床应用的化合物如环磷酰胺和苯丁酸氮芥相比，苯达莫司汀拥有独特的作用机 制。本研究采用的工具之一是药物基因组方法，其在靶细胞系与所选的药物培养后， 可以同时分析和监测数千个完全表征的基因的表达水平，已经成功地用于阐明其它抗癌药 物的作用机制。其主要优势在于产生无偏信息，导致苯达莫司汀独特作用机制的鉴定，并将 其与其它DNA烷化剂区分开来。用这种方法，检测到苯达莫司汀强烈的经典p53-依赖性应激反应“特征”，在磷酰 胺氮芥和苯丁酸氮芥处理的细胞中也存在，但强度低得多。Q-PCR分析证实了基因阵列分 析，确认了含有P53-效应元件的基因的上调，如p21(Waf/Cipl)和NOXA。作为细胞周期 蛋白_依赖性激酶的抑制剂，特别是那些在细胞周期的G1期起作用的抑制剂，据相信p21/ Wafl/Cipl是介导，至少部分介导，p53-诱导的G1停滞。导致p53_诱导的细胞周期停滞和 细胞程序性死亡的机制已被广泛研究和报告。Noxa编码Bcl-2蛋白家族的Bcl-2同源体 3(BH3)-only成员。NOXA显示出是p53-介导的反式激活的标靶，并且通过线粒体功能异常 起到P53-依赖性细胞程序性死亡的介导体的作用。小鼠胚胎成纤维细胞中Noxa缺陷表现 出对DNA损伤起反应的原癌基因依赖性细胞程序性死亡的显著抗性。然后通过免疫印迹分析，检测磷酸化的p53(Serl5)，以及Bax的上调，证实了 p53 促细胞程序性死亡途径的激活。虽然对其它氮芥类诱导P53-介导的应激反应之前已经有 报告，但与等毒剂量的环磷酰胺代谢物(PM)或苯丁酸氮芥比较，苯达莫司汀提供了更强和 更快速的诱导信号。还发现苯达莫司汀诱导快速和广泛的PARP切割，PARP是催化各种蛋白 的聚(ADP-核糖基化)的酶。虽然苯达莫司汀诱导PARP切割，但在SU-DHL-I细胞中，三种 药物之间导致PARP切割的能力差异是显著的。快速诱导PARP切割在苯达莫司汀的作用机 制中可能发挥至关重要的作用，给予了 PARP对DNA修复机制的重要性。事实上，对DNA损 伤发生反应，细胞最初激活PARP，导致DNA与DNA修复酶和转录因子的接近度增加。另外， PARP通过细胞程序性死亡或坏死参与启动细胞死亡。从药物基因组学图谱显现出的苯达莫司汀和其它受试氮芥的另一个主要差别在 于对polo-类激酶1 (PLK-I)、Aurora激酶(A和B)和细胞周期蛋白Bl表达水平的作用。 有丝分裂关卡激酶PLK-I和Aurora参与了细胞周期调节的很多方面，如激活和灭活CDK/ 细胞周期蛋白复合体、中心体的装配和成熟、以及在中期-后期转变期间活化后期促进复 合体(APC)、还有胞质分裂。有趣的是，当用siRNA或用目标小分子抑制这些关卡调节物时， 观察到了 DNA-损伤药物作用的增强，连同出现有丝分裂灾变。有丝分裂灾变是细胞死亡的 一种形式，发生在中期，形态上与细胞程序性死亡截然不同。有丝分裂灾变能发生在没有功 能性P53的情况下或在常规的半胱天冬酶依赖性细胞程序性死亡被抑制的细胞中。因此，有丝分裂灾变是肿瘤细胞死亡的诱人机制，因为它在用常规化疗药进行数轮化疗后选择出 的肿瘤细胞中也可能起作用。苯达莫司汀引发的广泛和持久的DNA-损伤以及苯达莫司汀 对M-期特异性关卡的协同抑制，可能在受处理的细胞中触发有丝分裂灾变。这可以解释 临床资料中苯达莫司汀在包括环磷酰胺和苯丁酸氮芥的方案中对难治的患者的活性。已经证实，有效的DNA修复机制在DNA-烷化药物的作用机制中发挥着关键作用。 对于共有相似的化学特征的药物而言，激活离散的DNA药物修复机制也可赋予独特的活性 图谱。本文所述的药物基因组学分析鉴定了被苯达莫司汀较之磷酰胺氮芥和苯丁酸氮芥有 区别调节的DNA修复基因。一个这样的基因，内切核酸酶1 (Exol)，是与MutS和MutL同源 物相互作用的5' -3'内切核酸酶，并牵涉DNA错配修复的切除步骤以及双链断裂的加工 和修复。Exol参与体细胞超突变和类别转换重组，并因此在B细胞功能和抗体产生中非常 重要。为了进一步研究苯达莫司汀、环磷酰胺和苯丁酸氮芥之间修复机制的差异，进行 功能分析。研究了两个主要机制DNA修复蛋白，O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)；和 无嘌呤/无嘧啶的内切核酸酶Ape-1。AGT，一种泛素酶，清除由数个烷化剂(包括硝脲类和 三氮烯类)导致的O6-烷基鸟嘌呤-DNA加合物。临床证据提示，脑肿瘤表达高水平AGT，可 因此对某些DNA烷化剂如替莫唑胺更具抗性。核苷O6-苄基鸟嘌呤(O6-BG)提供了有效灭 活AGT蛋白的方法。在一些细胞系中，苄基鸟嘌呤明确提高了环磷酰胺活化态的毒性。如 本文所示，添加O6-苄基鸟嘌呤，提高了环磷酰胺而不是苯达莫司汀的细胞毒效力，表明苯 达莫司汀不诱导能被AGT修复的O6-烷基鸟嘌呤DNA加成物。Ape-1/Ref-l是无嘌呤/无嘧啶的内切核酸酶，在碱基切除修复(BER)途径中发 挥极为重要的作用。BER被各种DNA-损伤药物，包括DNA烷化剂和DNA甲基化剂如替莫唑 胺诱导的损伤所激活。Ape-I的作用以化合物甲氧胺(MX)，该酶活性的特异抑制剂-测试。 用MX抑制Ape-Ι，提高了苯达莫司汀的细胞毒活性，表明了对BER的作用。用环磷酰胺代 谢物没有观察到改变，隐示了在这些药物活化的DNA修复机制之间的主要差异。对可能的抗肿瘤剂和其它已知的治疗剂进行比较，适用NCI人类肿瘤60细胞系 体外筛查。还已经证明，在许多情况下，当发现配对化合物在用该系列的筛选结果之间有 高相关系数，则如COMPARE统计分析程序所评价，这些药物通常有相似的作用机制。氮芥 类美法仑、苯丁酸氮芥和环磷酰胺观察到的高相关性在已知的烷化剂中都如此，证实了 COMPARE分析发现共同作用机制的能力。除了与苯达莫司汀相配的前6名之外，只有甲基化 剂DTIC(达卡巴嗪)表现出大约80%的相关一致性(r值)。这些结果揭示，苯达莫司汀在 与其它已知烷化剂的关系中，表现出独特的作用机制。基于本实施例呈现的结果，苯达莫司汀的推导作用机制显示在图5中。苯达莫司 汀可有效进入肿瘤细胞，并诱导长时间和广泛的DNA烷基化和断裂，可能是由于苯达莫司 汀的苯并咪唑环体系赋予的吖丙啶转换态环的高化学稳定性。苯达莫司汀处理启动了三个 主要的信号途径1) “经典的”P53依赖性应激途径的激活，导致内在细胞程序性死亡的强 烈激活，其由促细胞程序性死亡BCL-2家族成员如NOXA和Bax介导；2)DNA修复机制的激 活，如碱基切除修复元件(machinery)，其不由常用于NHL或CLL患者的其它氮芥类激活； 和3)抑制数个有丝分裂关卡，如激酶PLK-I以及Aurora A和B。协同诱导DNA损伤和抑制 有丝分裂关卡可使暴露于苯达莫司汀的肿瘤细胞在经历有丝分裂之前，不能充分修复DNA损伤。带着广泛损伤的DNA进入有丝分裂的细胞，或者不能继续进行“常规” P53依赖性细 胞程序性死亡的细胞，将通过有丝分裂灾变经受死亡。这种替代的程序化细胞死亡途径，连 同传统细胞程序性死亡的强烈激活，表明了为何苯达莫司汀在体外的药物抗性细胞中以及 在患有化疗难治性肿瘤的患者中有效。因此，在其它作用中，对于临床医生治疗患有慢性的 非何杰金氏淋巴瘤和其它血癌的患者的全部治疗方法(armamentarium)中，苯达莫司汀治 疗将表现出是重要的添补。实施例2苯达莫司汀在NHL细胞中的活性诱导了有丝分裂灾变死亡途径如上文实施例1所述，苯达莫司汀是具有独特作用机制的烷化剂，并在传统DNA损 伤剂难治的NHL和CLL患者中进行了临床试验。苯达莫司汀在NHL细胞的基因表达中诱导 了独有的改变，并表现于与其它2-氯乙胺烷化剂缺少交叉抗性。定量PCR分析证实，NHL细 胞系SU-DHL-I在暴露于药物的临床相关浓度8小时后，细胞中G 2/M关卡调节剂Polo-类 激酶I(PLK-I)和Aurora A激酶(AurkA)下调。当细胞暴露在等毒剂量的苯丁酸氮芥或环 磷酰胺的活性代谢物时，在同样这些基因中没有改变。对苯达莫司汀在不能经受经典的caspase介导的细胞程序性死亡的细胞中诱导 细胞毒性的能力进行了调查。多药抗性的MCF-7/ADR和p53缺陷的RK0-E6结肠腺癌细胞， 在只有50 μ M苯达莫司汀或者50 μ M苯达莫司汀和20 μ M泛半胱天冬酶抑制剂zVAD-fmk 下暴露二或三天。虽然zVAD-fmk能抑制苯达莫司汀诱导的Armexin-V阳性细胞增加，但在 苯达莫司汀单独或与zVAD-fmk联合处理的细胞中，用DNA染色剂DAPI进行核形态的显微 分析表明，微核发生率增加。多核/微核以及异常的染色质凝聚二者是有丝分裂灾变的标 记，并在暴露于微管结合药物如长春生物碱类和紫杉类的肿瘤细胞中已经观察到。有丝分 裂灾变的激活可扩大苯达莫司汀的细胞毒性以及其在经典细胞程序性死亡途径受抑制的 肿瘤细胞中的活性。实施例3在淋巴瘤和白血病细胞中，快速起效的苯达莫司汀激活有效的细胞程序性死亡和 细胞死亡如上所述，在其它作用中，烷化剂苯达莫司汀表现出对抗有药物抗性的癌症的化 疗活性，并在与其它相关抗肿瘤剂比较时，具有独特的作用机制。与其它抗肿瘤氮芥类的 情况一致，苯达莫司汀在人类中的血清半衰期相对短(大约2小时)，并且临床通过静脉推 注施用。本实施例报告的工作目的是，评价苯达莫司汀短期暴露于体外癌细胞时，诱导细胞 死亡和细胞程序性死亡的能力。在该实验模型中苯达莫司汀的活性与其它结构相关的药物 相比较。得到的结果表明，苯达莫司汀短时(30分钟)暴露于细胞中后，发挥最大的抗肿瘤 活性。为得到这些结果，NHL细胞系SU-DHL-I短期(30分钟至4小时)暴露在50 μ M苯达 莫司汀下，清洗，在无药培养基中恢复20小时。细胞暴露在苯达莫司汀中短达30分钟即表 现出广泛的生存能力丧失，这用各种生物分析测定，包括在药物暴露后48和72小时，测定 细胞内ATP和释放到上清液中的腺苷酸激酶(图6和7)。相反，细胞用这类烷化剂的其它 成员处理(这里是苯丁酸氮芥、美法仑和环磷酰胺的代谢物磷酰胺氮芥；显示的数据是苯 丁酸氮芥和磷酰胺氮芥)，当暴露于这些药剂30、60和120分钟时，存活率有极轻微的损失。 在这些分析中，其它这些氮芥需要长得多的暴露时段(至少4小时)诱导与苯达莫司汀相当的细胞毒性。用MTT为基础的分析证实了这些结果，其中在暴露于药物30分钟、4小时 或72小时后72小时的SU-DHL-I和HL-60细胞中，苯达莫司汀的IC5tl相似。相比之下，苯 丁酸氮芥、美法仑和磷酰胺氮芥用同样这些细胞系培养30分钟，与持续(72小时)暴露比 较，显示出IC50要高10-20倍。细胞内ATP水平用下面的荧光素酶为基础的ATP分析进行分析。IOmL CellTiter-Glo 试剂与适当量的CellTiter-Glo底物(根据制造商的说明书；Promega Corp.)混合， 混合物平衡10分钟。然后该溶液100 μ L与100 μ L含有细胞的培养基结合，让混合物培养 10分钟。用CCD为基础的平板读数器检测发光。选择腺苷酸激酶(ADK)分析是因为处理过的细胞完整性松解，ADK释放到培养基 中，或者在生物样品的条件下，释放到细胞间隙、血液等。为了在96孔板中进行ADK分析， 每个测试孔中，短时离心沉淀细胞的培养基等分试样的上清20 μ L，与100 μ L新鲜制备 的ADK试剂(根据制造商说明书，20mL Cambrex ToxiLight试剂加上适当量的Cambrex ToxiLight底物；Cambrex Corp.，NJ)混合，并使其平衡15分钟。然后培养反应混合物两分 钟，使激酶反应发生。然后在平板读数器上立即读出样品的发光。还通过20 μ L特定细胞培养物的等分试样与180 μ L GuavaViaCount试剂(Guava Technologies，Hayward，CA)混合，使用前即刻稀释的1 10稀释液，评价细胞存活率。之 后各混合物培养5分钟。然后用Guava PC流式细胞计数器进行ViaCoimt细胞计数，测定 每1，000个总细胞中的活细胞数。存活和死亡的细胞用染料7AAD区别，其能通过损坏的细 胞膜扩散进死亡或濒死的细胞中。如实施例1所述，快速诱导PARP(聚[ADP-核糖]聚合酶)断裂是苯达莫司汀在 NHL细胞中诱导死亡的标志。SU-DHL-I细胞暴露于50 μ M SDX-105短达30分钟，之后洗 去药物，进一步培养8小时，观察到PARP最大断裂。在以相似方式用40 μ M磷酰胺氮芥、 4 μ M苯丁酸氮芥或2 μ M美法仑处理30分钟的细胞中，没有观察到PARP断裂。所用的各药 物浓度代表了与50 μ M苯达莫司汀相比较的等毒浓度，这是在暴露在药物下72小时后，用 MTT [3-(4，5- 二甲基噻唑-2-基)-2，5_溴化二苯基四唑]为基础的分析测定的。MTT分析用各种药物的递增剂量进行，测定杀死50%受处理细胞所需的有效浓 度。这些分析在96孔板中进行。浓度范围最高可达500 μ Μ。在各分析中，对照包括未处理 细胞和杀死对照。对于在“洗脱”实验中用于检验细胞的平板，离心平板5分钟，沉淀细胞。 然后除去培养基，细胞沉淀用IX PBS洗一次，然后重新悬浮在新鲜培养基中。细胞用特定 剂量的药物在含有5.0% CO2的气氛中，37°C培养3天。三天后，各孔加入IOyL MTT(12mM) 试剂(5mg/mL MTT(Promega)溶解于新鲜培养基中，过滤消毒，保存在2_8°C )。培养四小时 后，各孔加入100 μ L裂解缓冲液(20% SDS, 0. 015Μ HCl)。混合物在含有5. 0% CO2的气 氛中，37°C放置过夜。第二天早晨，用多孔扫描分光光度计在595nm下测定细胞裂解水平。用100 μ M苯达莫司汀或12 μ M苯丁酸氮芥处理人类癌细胞系HL-60，得到可比拟 的结果。暴露在药物下的时间是30分钟、1小时或2. 5小时，其中在所提到的时间后，除去 含有药物的培养基，用不含药物的新鲜培养基取代。汇总起来，这些结果表明了苯达莫司汀即便与癌细胞短暂培养之后，即可激活不 可逆的细胞死亡途径的独特能力，这种能力有别于其它相关的烷化剂。所述的快速起效的 细胞毒性证实了苯达莫司汀有效的临床活性，并表明它将适用于治疗各种癌症，包括传统
24化疗难治的癌症。实施例4临床数据本研究评价了苯达莫司汀在患有复发的或之前化疗方案难治的NHL患者中的有 效性和毒性。利妥昔单抗难治的患者在治疗的6个月内病情发展。方法该II期多中心试验在美国和加拿大的17个地点，募集患有复发的慢性或转 化的利妥昔单抗难治的B-细胞NHL患者。在84%患者中发现了慢性的组织学表型，而16% 有转化的疾病。患者的中位年龄为63岁(38-84岁)，88%有III/IV期疾病。患者在第1 和2天，经30-60分钟接受苯达莫司汀120mg/m2，21天为1周期，直至6个周期。用国际工
(International Working Group) t示}i^flJ胃β@。结果意向治疗(ITT)人群由之前化疗中位数为2的75名难治性患者组成。ITT 人群的总体目标反应率(ORR)为74% ；25%有完全的反应，49%有部分反应，12%病情稳 定，14%病情发展。在以前的烷化剂治疗难控制的15名患者中(患者在至少一次以前的 含烷化剂治疗后病情发展)，10人(67%)经历了对苯达莫司汀的目标反应。所有患者的反 应中位时期为6. 6月，慢性患者为9. 3个月，转化患者为2. 4个月。结论在预治疗的利妥昔单抗难治的慢性和转化NHL患者中，包括之前的烷化剂 治疗难治的患者，苯达莫司汀单药能产生持久的目标反应，毒性可接受，虽然有不乐观的预 后特征。虽然本发明参考上述实施例进行描述，但应当理解对其的修改和变化也包括在本 发明的精神和范围内。因此，本发明仅受所附的权利要求的限制。根据本公开，本文公开和要求的所有组合物和方法无需过多的实验即能制备和实 行。虽然本发明的组合物和方法根据其优选的实施方案进行了描述，但是显然对于本领域 技术人员各种变化可以应用于本组合物和方法，并按照这里描述的方法的步骤或步骤的顺 序，而不背离本发明以所附的权利要求限定的精神和范围。说明书中提到的所有发明、申请和公开表示本发明所属的领域的普通技术人员的 水平。所有发明、申请和公开，包括要求优先权或其它利益者，在此以其全文作为参考引入， 如同各单独公开被具体和单独表明作为参考引入。本文适当地说明性描述的发明，在缺少任何没有在此公开的具体元素的情况下可 以实施。因此，例如，在本文的每个例子中，任何术语“包含”、“基本由...组成”和“组成” 可以用其它两个术语之一代替。采用的术语和表达用作说明的术语而非限制，并且没有意 向在所述术语的使用和表达中，排除了表现和描述的任何等效特征或其部分，需要认识在 本发明要求的范围内，各种修改都是可能的。因此，应当理解，虽然本发明被优选的实施方 案和任选的特征所具体公开，但是本领域技术人员可以采取这里公开的理念的各种修改和 变化，这样的修改和变化被认为是在所附的权利要求限定的本发明范围内。
序列表
<110>赛福伦公司(C印halon，INC.) <120> 癌症治疗(Cancer Treatments) <130>SPI095027-41 <160>16
<170>PatentIn version 3.5<210>1
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<223>Exo 1反向引物 <400>16
gaatcgctct ttcttcggaa ctg23[0163权利要求
治疗癌症的方法，包括确定患者患有特征在于癌细胞抗死亡的癌症，然后给所述患者施用治疗有效量的苯达莫司汀。
2.根据权利要求1的方法，其中所述的癌症抗细胞程序性死亡。
3.根据权利要求1的方法，其中抗死亡的癌细胞包含p53缺陷。
4.根据权利要求1的方法，其中的癌症选自非何杰金氏淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病。
5.治疗癌症患者的方法，包括施用苯达莫司汀，等至少约30分钟但不长于约48小时， 以及施用另一种化疗剂或当细胞在细胞周期的S期时更有效的药剂。
6.根据权利要求5的方法，其中的化疗剂在施用苯达莫司汀后约30分钟至约36小时 施用。
7.根据权利要求5的方法，其中的化疗剂在施用苯达莫司汀后约30分钟至24小时施用。
8.根据权利要求5的方法，其中的化疗剂在施用苯达莫司汀后约30分钟至12小时施用。
9.根据权利要求5的方法，其中的化疗剂在施用苯达莫司汀后约30分钟至6小时施用。
10.根据权利要求5的方法，其中的患者患有特征在于癌细胞抗死亡的癌症。
11.评价癌症治疗有效性的方法，包括确定从癌症患者采集的生物样品中癌细胞死亡 标记的水平是否与治疗有效性相关，其中所述确定在施用目的在于治疗癌症的治疗方案期 间或之后进行，其中的治疗方案包括施用烷化剂。
12.根据权利要求11的方法，其中的烷化剂是苯达莫司汀。
13.评价癌症治疗的有效性的方法，包括a.用治疗有效量的苯达莫司汀治疗癌症；b.等待足够长的时间使苯达莫司汀发挥所需的治疗作用；以及c.测定癌细胞死亡标记的水平，以确定用苯达莫司汀治疗是否有效。
14.减少与包括给癌症患者施用多个剂量的苯达莫司汀的癌症治疗有关的毒性的方 法，包括给患者施用第一剂量的治疗有效量的苯达莫司汀，所述第一个苯达莫司汀的剂量 导致不需要的毒性，并延迟给患者施用第二剂治疗有效量的苯达莫司汀，直至不需要的毒 性开始消退。
15.评价患者的癌症是否对苯达莫司汀敏感的方法，包括a.在不存在对癌细胞有毒性的化合物的生长条件下，将患者癌组织的细胞样品的至少 一部分暴露于苯达莫司汀，使癌细胞增殖；以及b.评价癌症是否对暴露于苯达莫司汀敏感。
16.根据权利要求15的方法，其中评价癌症是否对暴露于苯达莫司汀敏感包括测定癌 细胞死亡标记的水平。
17.根据权利要求16的方法，其中的癌细胞死亡标记选自腺苷酸激酶活性水平、细胞 存活率和PARP切割产物的水平。
18.治疗癌症的方法，包括确定患者患有特征在于抗一种或多种烷化剂和抗CD20剂的 癌症，包括给所述患者施用治疗有效量的苯达莫司汀。
19.根据权利要求18的方法，其中所述癌症为非何杰金氏淋巴瘤。
20.根据权利要求18的方法，其中的抗CD20剂为利妥昔单抗。
21.与治疗特征在于癌细胞抗死亡的癌症有关的工作方法，包括促进苯达莫司汀用于 治疗特征在于癌细胞抗死亡的癌症。
22.根据权利要求21的方法，其中的癌症是用包括一种或多种烷化剂和抗CD20剂的组 合难以治疗的癌症。
23.与难以治疗的癌症的治疗有关的工作方法，包括促进苯达莫司汀用于治疗难以治疗的癌症。
24.根据权利要求23的方法，其中难以治疗的癌症是用一种或多种烷化剂和抗CD20剂 的组合难以治疗的癌症。
25.苯达莫司汀在制备用于治疗特征在于癌细胞抗死亡的癌症药物中的应用。
26.苯达莫司汀在制备用于治疗难以治疗的癌症药物中的应用。
27.根据权利要求26的应用，其中难以治性的癌症是用一种或多种烷化剂和抗CD20剂 的组合难以治疗的癌症。全文摘要
本发明描述了用于治疗特征在于癌细胞抗死亡的癌症的方法和组合物。大体上，这样的方法包括施用治疗有效量的诱导一些，并且优选大多数或者所有癌细胞的有丝分裂灾变的化合物。本发明还提供了评价这种治疗的有效性的方法。
文档编号G01N33/574GK101933923SQ20101000151
公开日2011年1月5日 申请日期2005年11月4日 优先权日2004年11月5日
发明者克里斯蒂娜·卡洛尔·尼迈尔, 加里·T·埃利奥特, 希瑟·海伦妮·宾德尔, 普拉提克·S·穆尔塔尼, 洛伦佐·M·莱奥尼 申请人:赛福伦公司