专利名称：：癌症的预测和预后以及监控癌症治疗的方法
技术领域：
：本发明涉及生物标记和生物标记用于癌症的预测与预后的用途以及生物标记监控癌症治疗效果的用途。特别地，本发明涉及VEGF作为多激酶抑制剂的生物标记的用途。
背景技术：
：血管内皮生长因子受体(VEGFR)及其配体，血管内皮生长因子(VEGF),在内皮细胞迁移和增殖中起到关键作用。VEGFR/VEGF系统包括三种受体(VEGFR-l,VEGFR-2和VEGFR-3)和四种配体(VEGF-A,B,C,D和E以及胎盘生长因子)。VEGF-A进一步由四种亚型组成，VEGF-121,VEGF-165,VEGF-185和VEGF-204,它们源自VEGF-A基因的可替换转录。受体是具有胞内酪氨酸激酶结构域的血浆跨膜蛋白。与其它蛋白质激酶一样，VEGFR的激活是调节内皮细胞增殖信号的关键机理，并且认为VEGFR/VEGF的异常引起各种人类疾病如牛皮痺和恶性胂瘤中的异常血管形成。在胎盘形成中，VEGFR/VEGF系统是血管系统的正常发育所必需的。在成人中，VEGFR/VEGF在伤口愈合、炎症和血管形成中是重要的。在药物治疗前对患者体内循环的VEGF水平的非入侵性测定对于治疗决策有着潜在的重要辅助作用。尽管总VEGF-A的测定已经用作人类疾病结果的预后指标，但是没有报道过化疗之前患者体内VEGF水平与治疗结果之间的相关性。因此，VEGF可以作为有价值的预后指标，并作为监测使用多激酶抑制剂的治疗效果的生物标记。发明概述本发明涉及生物标记和生物标记用于癌症的预测与预后的用途以及生物标记监控癌症治疗效果的用途。特别地，本发明涉及可溶性VEGF作为多激酶抑制剂(例如，索拉非尼(Sorafenib))的生物标记的用途。在一个实施方案中，本发明涉及使用定量免疫测定来测量使用多激酶(例如，索拉非尼)治疗前的人体液中VEGF蛋白质的水平。所述水平作为使用多激酶抑制剂(例如，索拉非尼)治疗的癌症患者从这样的治疗中获益的潜能指标是特别有用的。VEGF治疗后水平的测量以及疗程中VEGF水平的变化在临床上可以用作患者治疗选择的一种治疗学辅助手段，以监控患者体内胂瘤发生前/肿瘤疾病的情况，和/或监控肿瘤发生前/肺瘤疾病患者怎样应答治疗。在一个实施方案中，VEGF的水平可以用来辅助患者治疗的选择，以及为患者治疗的最佳方法作出决定。可以在患者样品中测定VEGF的水平，这些样品如但不限于，血液、血清、血浆、尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊髓液、泪液、痰、粘液、淋巴、胞液、腹水、胸膜积液、羊水、膀胱冲洗液和支气管肺泡灌洗液。在另一个实施方案中，本发明涉及将免疫测定用作选择有可能获益于多激酶抑制剂(例如，索拉非尼)治疗的患者的方法，通过测量患者样品中的VEGF预处理水平和基于可能的患者结果对VEGF水平的计算图来评价可能的结果。患者体内与激活的VEGF途径相关病态的监控方法可以进一步预后疾病，其中患者样品中的总VEGF蛋白质水平表示患者较好或较弱的治疗结果。预后可以是选自应答率(RR)、完全应答(CR)、部分应答(PR)、稳定疾病(SD)、临床益处[包括完全应答(CR)、部分应答(PR)和稳定疾病(SD)]、进展时间(TTP)、无进展生存(PFS)和总生存率(OS)的临床结果。这些方法可以是标准格式化的，例如，夹心免疫测定形式的免疫测定，如夹心酶联免疫分析(ELISA)或等价测定。这些免疫测定法可以使用单克隆抗体，例如，抗-VEGF单克隆抗体。此外，单克隆抗体可以是生物素化的。本发明的另一个实施方案涉及测量患者样品中总VEGF蛋白水平连续变化的定量免疫测定，作为患病患者治疗选择的方法，该疾病例如为肿瘤发生前/肿瘤疾病。例如，一种这样的治疗选择方法可以包括步骤(a)免疫检测和定量对照群体样品中总VEGF蛋白质的水平；(b)免疫检测和定量随时间取自患者的样品中总VEGF蛋白质的水平；和(c)根据患者样品中VEGF蛋白质的水平决定使用常规治疗和/或多激酶抑制剂(例如，索拉非尼)治疗来治疗患者。例如，如果发现患者样品中VEGF蛋白质的水平在70pg/ml以上，可以得出的结论是患者患有VEGF引起的疾病，并作出使用多激酶抑制剂(例如，索拉非尼)治疗来治疗患者的结论，该治疗可以是单独的或结合一种或更多其他治疗。VEGF途径定向治疗可以是多激酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、双芳基脲、VEGFR-2反义抑制剂或单克隆抗体治疗等。例如，VEGF途径定向治疗可以是双芳基脲索拉非尼，其是血管生成抑制剂以及酪氨酸激酶抑制剂，或酪氨酸激酶抑制剂STI571(也称为曱磺酸伊马替尼或Gleevec)。本发明的另一个实施方案涉及使用定量免疫测定来^r测VEGF水平结合一种或多种其他蛋白质水平的变化。这些其他的蛋白质可以包括，例如，抑制剂(例如，金属蛋白酶-1的组织抑制剂(TIMP-l))、癌蛋白(例如，HER-2/neu,rasp21)、生长因子受体(例如，表皮生长因子受体(EGFR)、血小板衍生的生长因子受体a(PDGFR-a))、转移蛋白(例如，尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂(uPA))、肿瘤标记(例如，癌胚抗原(CEA))和胂瘤抑制基因(例如，p53)。这些方法随后可以用作，例如，诊断/预后工具、患病患者的治疗选择、检测患者的病况和监测患病患者怎样应答VEGF途径定向治疗或其他治疗。测试患者(例如，癌症患者)的总VEGF和其他蛋白(如激活VEGF途径的蛋白)的连续改变是有利的，这将作为扩大临床观察，治疗来源和诊断/预后参数的工具，以便为了最有前景的治疗结果来选择最佳治疗组合。在另一个实施方案中，本发明提供了用于监控患者样品中治疗效果的试剂盒，其包括蛋白质特异性抗体。在特定的实施方案中，该试剂盒进一步包括试剂盒的使用说明。在特定的实施方案中，该试剂盒可以进一步包括悬浮或固定细胞的溶液、检测标记或指示物、提供对抗体结合敏感的多肽的溶液、溶解细胞的溶液或用于纯化多肽的溶液。在进一步的实施方案中，抗体是VEGF特异性的。附图l说明了患者群体在基线(预治疗)和治疗过程中的平均VEGF水平。发明详述可以理解本发明不限于所述的特定方法、实验方案、细胞系、动物种或属、构建体和试剂，同样可以改变。还可以理解在此所用的术语只是为了描述特定实施方案的目的，并不意味着限制本发明的范围，其只受到所附权利要求的限制。必须注意在此和所附权利要求中所用的单数形式"一个，，，"一种，，和"该"包括复数指代物，除非上下文中另外明确地指出。因此，例如，参照"一种基因"指的是一种或多种基因并包括本领域技术人员公知的等价物等。除非另外限定，在此所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。尽管与在此所述的那些相似或等价的任何方法、设备和材料相似或等同的方法、设备、以及原料可以用于本发明的实施或测试中，但是现在描述优选的方法、设备和材料。在此提及的所有出版物和专利为了描述和公开的目的在此引入作为参考，例如，出版物中描述的构建体和方法可以结合在此所述的本发明使用。只是为了本申请申请日之前的公开内容而提供了以上和整个文中讨论的出版物。在此没有任何内容解释为本发明人依据先前发明而有权预料这样的公开内容的容许。定乂为了方便，以下提供了说明书、实施例和所附权利要求中所用的特定术语和短语的意思。在此所用的术语"患者样品"指的是获自患者的样品。样品可以是任何生物组织或流体。样品可以是源自患者的样品。这样的样品包括，但不限于，血液、血清、血浆、尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊髓液、泪液、痰、粘液、、淋巴、胞液、腹水、胸膜积液、腹膜水、羊水、膀胱沖洗液和支气管肺泡灌洗液、血细胞(例如，白细胞)，组织或活组织才企查样品(例如，肿瘤活组织;险查)，或其细^5包。生物样品还可以包括组织切片，如出于组织学目的获取的冷冻切片。术语"生物标记"包括了宽范围的胞内和胞外情况以及完整生物体生理学变化。生物标记本质上可以代表细胞功能的任何方面，例如，但不限于，信号分子、转录因子、代谢产物、基因转录产物的生产水平或生产速率以及蛋白质的翻译后修饰。生物标记可以包括转录产物水平的全基因组分析或蛋白质水平的全蛋白组分析和/或修饰。生物标记也可以指的是基因或基因产物，与未处理的患病细胞相比较，其在患病患者的化合物治疗过的患病细胞中是上调或下调的。即，基因或基因产物对处理过的细胞是充分特异性的，其可以任选地与其他基因或基因产物一起用于鉴定、预测或检测小分子。因此，生物标记是患病细胞中化合物功效特征性的或患病细胞对化合物治疗应答特征性的基因或基因产物。术语"癌症"包括，但不限于，实体肺瘤，如乳房、呼吸道、脑、生殖器官、消化道、尿路、眼睛、肝、皮肤、头颈、甲状腺、副甲状腺的癌症及其远端的转移癌。该术语还包括淋巴瘤、肉瘤和白血病。乳癌的实例包括，但不限于，浸润性导管癌、浸润性小叶癌、原位导管癌和原位小叶癌。呼吸道癌的实例包括，但不限于，小细胞和非小细胞肺癌以及支气管腺瘤和胸膜肺母细胞瘤。脑癌的实例包括，但不限于，脑干和下丘脑神经胶质瘤，小脑和大脑星形细胞瘤，成神经管细胞瘤、室管膜细胞瘤以及神经外胚层和松果体瘤。男性生殖器官肿瘤包括，但不限于，前列腺和睾丸癌。女性生殖器官肿瘤包括，但不限于，子宫内膜、子宫颈、卵巢、阴道和外阴癌，以及子宫肉瘤。消化道肺瘤包括，但不限于，肛门、结肠、结直肠、食道、胆嚢、胃、胰腺、直肠、小肠和唾液腺癌。尿路胂瘤包括，但不限于，膀胱、阴茎、肾、肾盂、输尿管、以及尿道癌。眼癌包括，但不限于，眼内黑素瘤和视网膜成神经细胞瘤。肝癌的实例包括，但不限于，肝细胞癌(带有或不带有纤维板层变体的肝细胞癌)、胆管癌(肝内胆管癌)和混合型肝细胞胆管癌。皮肤癌包括，但不限于，鳞状细胞癌，Kaposi's肉瘤，恶性黑色素瘤，默克尔细胞皮肤癌和非黑素瘤皮肤癌。头颈癌包括，但不限于，喉/舌/鼻咽/口咽癌，以及唇和口腔癌。淋巴瘤包括，但不限于，AIDS-相关淋巴瘤，非霍奇金氏淋巴瘤，表皮T细胞淋巴瘤，霍奇金氏病和中枢神经系统的淋巴瘤。肉瘤包括，但不限于，软组织肉瘤，骨肉瘤，恶性纤维组织细胞瘤，'淋巴肉瘤和一黄紋月几肉瘤。白血病包括，但不限于，急性骨髓性白血病，急性淋巴细胞性白血病，慢性淋巴细胞性白血病，慢性髓细胞性白血病和毛细胞白血病。在此所用的术语"病人"或"患者"包括哺乳动物(例如，人和动物)。本发明涉及测量患者样品中VEGF蛋白质水平的定量免疫测定。如在此所用的，将"活化的VEGF途径"定义为由VEGF蛋白的超表达或突变的VEGF途径，并且同样包括未调节的和/或突变刺激的VEGF途径。与激活的VEGF途径相关的肿瘤疾病，以及导致胂瘤疾病的癌前病变的实例是以下的这些转移性成神经管细胞瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、隆突性皮肤纤维肉瘤(DFSP)、慢性骨髓增生性疾病(CMPD)、结肠直肠癌、结肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、急性髓细胞性白血病、曱状腺癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、头颈癌、脑瘤、肝细胞癌和恶性血液病。因此，VEGF蛋白的水平，单独或结合其他蛋白质(例如，其他癌蛋白)的水平，可以用来预测临床结果和/或作为治疗选择中的辅助手段。因此，本发明公开和要求了免疫测定用来定量测量患者样品中VEGF水平(例如，循环VEGF水平)的申请，以便评估患有癌症的患者从使用多激酶抑制剂(例如，索拉非尼)的治疗中获益的可能性。在本发明的一个实施方案中，在诊断时(例如，肾细胞癌)以及随后的治疗后时间点(例如，第一个治疗周期的第31天，第三个治疗周期的第1天)定量获取的病人样品中的VEGF蛋白。这样的患者样品可以是，例如，血液、血清、血浆、尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊髓液、泪液、痰、粘液、淋巴、胞液、腹水、胸膜积液、羊水、膀胱冲洗液和支气管肺泡灌洗液，以及其它体液样品。患者样品可以是新鲜的或冷冻的，并可以是用肝素、柠檬酸盐或EDTA处理过的。而，可以知道除了在此公开的那些，其他方法可以用来定量患者样品中的VEGF蛋白。此外，许多检测方法可以用来观察VEGF蛋白，如发光标记。许多形式适于与本发明的方法一起使用。例如，可以通过酶联免疫吸附测定、放射免疫测定、二元抗体夹心测定、凝集测定、荧光免疫测定、免疫电子和扫描显微镜检查与其它本领域公知的其他测定来进行患者样品中VEGF蛋白的#全测和定量。可以通过本领域已知的常规方法来适应这些测定中VEGF蛋白的定量。在一个实施方案中，可以通过夹心测定来检测和定量循环VEGF蛋白水平的连续变化，其中已经使用常规技术将捕获抗体固定于支持物表面上。合适的支持物包括，例如，合成的聚合物支持物，如聚丙烯、聚苯乙烯、取代的聚苯乙烯、聚丙烯酰胺(如聚酰胺和聚氯乙烯)、玻璃珠、琼脂糖和硝化纤维。可以用于本发明方法中的ELISA夹心免疫测定的实例使用了纯化的小鼠抗人VEGF单克隆抗体作为捕获抗体以及生物素化山羊抗人VEGF多克隆抗体作为检测抗体。将捕获单克隆抗体固定于微量滴定板孔上。将稀释的人血清/血浆取样或VEGF标准品(例如，重组野生型VEGF蛋白)在孔中培养以使捕获单克隆抗体结合VEGF抗原。孔洗涤后，将固定的VEGF抗原暴露于生物素化检测抗体，此后再次洗涂孔。然后加入抗生蛋白链菌素辣根过氧化物酶缀合物。在最后洗涤后，将TMB蓝色底物加入到孔中来冲企测结合的过氧化物酶活性。通过加入2.5N碌iJ臾来终止反应，同时在450nm处测量吸光度。样品的吸光度值与VEGF标准品的联系使得可以测定以pg/ml计的血清或血浆中的VEGF的定量值。可以知道其他蛋白质(例如，抑制剂、癌蛋白、生长因子受体、血管生成因子、转移蛋白、肺瘤标记、胂瘤抑制剂、与VEGF途径相关的蛋白质)适于结合VEGF来检测和定量。例如，适于结合VEGF测试的其他蛋白质包括金属蛋白酶-1组织抑制剂(TIMP-1)、HER-2/neu、rasp21、表皮生长因子受体(EGFR)、血小板衍生的生长因子受体a、血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂(uPA)、癌胚抗原(CEA)和p53。可以使用本领域^支术人员已知的测定来4企测这些其它蛋白质。例如，用于HER-2/neu和TIMP-1定量的免疫测定是可购得的，如OncogeneScienceTIMP-1ELISA(OncogeneScience,Cambridge,MA(USA))，其可以检测人血清或血浆中TIMP-1水平的ng/ml值。监控VEGF的预治疗水平可以表示用多激酶抑制剂(例如，索拉非尼)治疗后的临床结果。一种评估临床结果的方法可以是应答率(RR)、完全应答(CR)、部分应答(PR)、稳定疾病(SD)、临床益处(包括完全应答(CR)、部分应答(PR)和稳定疾病(SD)),进展时间(TTP)、无进展生存(PFS)和总生存率(OS)的评估。在此的术语"抗体"以最宽泛的意思来使用，特别涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段。可以通过常规方法和/或遗传工程制备根据本发明的方法有用的抗体。例如，根据本发明的抗体包括结合VEGF的那些抗体。"抗体片段"包括全长抗体的一部分，通常是其抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab'》和Fv片段；双价抗体；线性抗体；单链抗体分子；生物特异性抗体；以及从抗体片段形成的多特异性抗体。在此所用的术语"单克隆抗体"指的是从实质性同源抗体的群体获得的抗体，即，包含相同群体的单个抗体，除可能少量存在的天然发生的突变。单克隆抗体是高度特异性的，即，针对单个抗原位点。此外，与通常包括针对不同抗原决定簇(抗原决定部位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反，每个单克隆体抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰语"单克隆"表明该抗体的特征为获自基本上同源的抗体群，而不是解释为需要通过任何特定方法来产生抗体。例如，可以通过由Kohler等(Nature256:495,1975)首先提出的杂交瘤方法，或通过重组DNA方法(辨如，美国专利No.4,816,567)来制备根据本发明所用的单克隆抗体。也可以使用例如Clackson等(Nature352:624-628,1991)和Marks,等(J,Mol.Biol,222:581-597，1991)所述的技术从噬菌体抗体文库分离单克隆抗体。在此单克隆抗体还包括"嵌合"抗体(免疫球蛋白)，其中的重链和/或轻链的一部分与得自特定种或属于特定抗体类或亚类的抗体的相应序列相同或同源，同时链的剩余部分与得自其它种或属于另一个抗体类或亚类的抗体的相应序列相同或同源，以及这样的抗体的片段，只要它们呈现出所需的生物活性(辨如，美国专利No.4,816,567;和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855,1984)。非人(如，鼠类)抗体的"人源化"形式是含有得自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。对于大部分而言，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的高变区残基由来自非人物种(供体抗体)的具有所需特异性，亲和性和容量的高变区残基所代替，这些非人物种如小鼠、大鼠、兔子、或非人类的灵长类动物。在一些情况中，人免疫球蛋白框架区(FR)残基可以由相应的非人残基所代替。此外，人源化抗体可以包括受体抗体或供体抗体中未发现的残基。形成这样的修饰以进一步改进抗体的性能。通常，人源化抗体可以基本上包括至少一个或通常两个可变域的全部，其中对应于那些非人免疫球蛋白和全部或基本上全部FR的全部或基本上全部高变区是人免疫球蛋白的那些。人源化抗体还任选包括至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc),通常是人免疫球蛋白的恒定区。对于综述，参见Jones等，(Nature321:522-525,1986);Reichmann,等(Nature332:323-329,1988);和Presta,(Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596,1992)。"单链Fv"或"sFv"抗体片段包括抗体的VH和Vl結枸域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽进一步在VH和Vt结构域之间包括多肽连接物，其使sFv形成抗原结合所需的结构。对于综述,参见Pluckthun(ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies(单克隆抗体的药理学)，Vol.113,Rosenburg和Moore编辑，Springer誦Verlag,NewYork,pp.269-315，1994)。术语"双价抗体"指的是带有两个抗原结合位点的小的抗体片段，该片段包括连接相同多肽链(Vh-Vl)中的轻链可变区(VL)的重链可变区(Vh)。使用太短的连接物不能在相同链的两个域之间进行配对，迫使该结构域与另一条链的互补结构域配对并形成两个抗原结合位点。双价抗体在例如EP404，097;WO93/11161;和Hollinger等(Proc.Natl.Acad.Sd.USA90:6444-6448,1993)中有更全面的描述。表述"线性抗体，，指的是Zapata等(ProteinEng.8(10):1057-1062，1995)中描述的抗体。简而言之，这样的抗体包括一对串联Fd部分(Vh-Ch1-Vh-Ch1),其形成一对基因结合区。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。根据本发明有用的代表性单克隆抗体包括鼠抗人总VEGF单克隆抗体，如设计来测量人VEGF的OncogeneSciences夹心ELISA试剂盒中找到的那些。根据本发明有用的单克隆抗体用来鉴定不同实验室预后测试中例如临床样品中的VEGF蛋白质。描述了在此有用的其他分子生物技术包括抗体制备的综合性教科书包括Berger和Kimmel(GuidetoMolecularCloningTechniques,MethodsinEnzvmologv,(分子克隆技术指南，酶学中的方法)Vol.152,AcademicPress,Inc.);Sambrook等(MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆实验室手册)(笫二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress;ColdSpringHarbor,N.Y.;1989)Vol.l誦3);CurrentProtocolsinMolecularBiology(分子生物学中的通用实-验方案)(F.M.Ausabel等〔编辑〕,CurrentProtocols,GreenPublishingAssociatesInc.和JohnWiley&Sons,Inc.之间的合营，(2000年的增补))；Harlow,等，(MonoclonalAntibodies:ALaboratoryManual(单克隆抗体:实马全室手册)，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1988),Paul〔编辑〕；FundamentalImmunologv,(基础免疫学)(LippincottWilliams&Wilkins(1998));和Harlow等(UsingAntibodies:ALaboratoryManuald吏用抗体实-验室手册)，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1998))。可以以任何常规方法来标记根据本发明鉴定VEGF蛋白质有用的抗体。标记实例是辣根过氧化物酶，以及抗体标记方法的实例是使用生物素-抗生蛋白链菌素复合物。按照需要，可以以任何方法直接或间接地标记本发明的免疫测定中用作示踪剂的抗体，形成可见或使其可见的信号。可探测标记物物质包括放射性元素，如311、1251和mI;荧光剂，如异硫氰酸荧光素和其它荧光色素、藻胆蛋白、藻红蛋白、稀土螯合物、德克萨斯红、丹酰和玫瑰红；比色试剂(色原体)；不导电物质，如胶体金；生物发光物；化学发光物；染料；酶，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、a-、卩-半乳糖香酶，及其他的；辅酶；酶底物；酶辅因子；酶抑制剂；酶亚基；金属离子；自由基；或任何其它提供了检测或测量形成的免疫复合物的存在或含量的免疫活性或惰性物质。酶底物组合的实例是辣根过氧化物酶和四曱基联苯胺(TMB)，以及碱性磷酸酶和对硝基苯基磷酸酉旨(pNPP)。根据本发明的另一个检测和定量系统产生发光信号、生物发光(BL)或化学发光(CL)。在化学发光或(CL)生物发光(BL)测定中，测量强度或总的光发射并且与未知分析物的浓度相关。可以使用光度计(光电倍增管作为检测器)或电荷耦合掐来定量测定光，或通过拍照或X光片来定性测量。使用该测定的主要优点是简单和分析灵敏度，使得可以检测和/或定量非常少量的分析物。示例发光标记是吖啶镞酯、吖啶镜磺酰基曱酰胺(acridiniumsulfonylcarboxamide),鲁米诺，伞形酮，异氨基苯二酰鲁米诺衍生物，发光蛋白，如水母发光蛋白和来自萤火虫的萤光素酶，海洋细菌，Vargulla和Renilla。鲁米诺可以任选性地与增强分子一起使用，如4-碘苯酚或4-羟基肉桂酸。通常，通过在碱性条件下使用氧化剂处理来产生CL信号。其他发光检测系统是其中信号(可探测标记)由底物上的酶促反应产生的那些。已经研发了CL和BL冲全测方案，用于测定4i性;粦酸酶(AP)、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、辣根过氧化酶(HRP)和黄。票吟氧^f匕酶标记，以及其它的。AP和HRP是两种酶标记，其可以通过CL和BL反应的范围来定量。例如，AP可以与底物一起使用，如金刚烷基1,2-二鹏丁烷芳基磷酸酯底物(例如AMPPD或CSPD;Kricka，L丄,"ChemiluminescenceandBioluminescence，Analysisby,"("通过化学发光和生物发光分析")MolecularBiologyandBiotechnology:AComprehensiveDeskReference(编辑,R.A.Meyers)(VCHPublishers;N.Y.,N.Y.;1995));例如，4-曱氧基-4-(3-磷酸苯基)螺[l,2-二P恶丁烷-3,2，-金刚烷]的二钠盐，带有或不带有如l-(三辛基辚曱基)-4-(三丁基辚曱基)苯二氯化物的增强分子。HRP可以与底物一起使用,如2，,3，,6，-三氟苯基-曱氧基-10-甲基吖啶满-9-曱酸酯。CL和BL反应不仅适用于酶的分析，而且适用于其他底物、辅因子、抑制剂、金属离子等。例如，鲁米诺、荧火虫荧光素酶和海洋细菌荧光素酶反应各自是过氧化物、ATP和NADPH产生或消耗的指示反应。它们可以与其它涉及氧化酶、激酶和脱氢酶的反应相结合，并且可以用于测量耦合反应的任何组分(酶、底物、辅因子)。可探测的标记可以直接或间接地结合本发明的测定中4吏用的抗体。可探测标记的间接连接的实例是抗体和标记之间的结合对的使用或信号扩大系统的使用。用于连接抗体和可探测标记的结合对的实例是生物素/抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、或抗生物素；抗生物素蛋白/抗-抗生物素蛋白；曱状腺素/曱状腺素结合球蛋白；抗原/抗体；抗体/抗-抗体；碳水化合物/凝集素；半抗原/抗半抗原抗体；染料和疏水性分子/疏水蛋白结合位点；酶抑制剂，辅酶或辅因子/酶；多核酸/同源多核酸序列；荧光素/抗荧光素；二硝基酚/解二硝基酚(anti-dinitrophenol);维生素BU/内在因子；可的松、考的松/考的松结合蛋白；和特异性受体蛋白的配体/膜相连的特异性受体蛋白。各种用于将标记直接或间接连接抗体的方法是本领域已知的。例如，可以共价或非共价结合标记。示例的抗体缀合方法描述于Avarmeas等，Scan.J.Immunol.8(i曾才卜7):7,1978);Bayer等，Meth.Enzymol.62:308,1979;Chandler等，J.Immunol.Meth.53:187,1982;Ekeke和Abuknesha,J.SteroidBiochem.11:1579，1979;Engvall和Perlmann,J.Immunol.109:129,1972;Geoghegan等,Immunol.Comm.7:1,1978;以及Wilson和Nakane，ImmunofluorescenceandRelatedTechniques,Elsevier/NorthHollandBiomedicalPress;Amsterdam(1978)。才艮据标记的性质，可以^使用各种4支术用于^r测和定量标记。对于荧光剂，大量荧光剂是可用的。对于化学发光物，光度计或胶巻是可用的。使用酶，可以焚光地、化学发光地、分光光度测量地或在视觉上确定或测量荧光的、化学发光的、或有色的产物。具有吖啶镞、苯并吖啶镜或吖啶满(acridan)型杂环系的各种类型的化学发光化合物是标记的其它实例。吖啶镞酯的实例包括具有杂环或环系的那些，这些环系含有阳性氧化态的杂原子，包括吖啶像、苯并[a]吖啶镞、苯并[b]吖啶镲、苯并[C]吖啶镜、苯并咪唑阳离子、喹啉條、异喹啉櫞、喹。秦锱、环状取代喹啉镞、菲啶输和喹喔啉锱这样的环系。可以通过直接或间接地将吖啶镜或苯并吖啶镞酯上的反应性功能基团连接选择的抗体来制备失踪物，这是本领域普通技术人员公知的(■#JE，辨如，Weeks等，Clin.Chem.29(8):1474-1479,1983)。化合物的实例是在芳环的对位或间位存在芳基环离去基团和反应性功能基团的吖啶镞和苯并吖啶输酯(W如,美国专利No.4,745,181和WO94/21823)。如在此所用的，"VEGF途径定向治疗"包括任何耙向VEGF途径的治疗，VEGF途径包括VEGF蛋白表达的抑制(例如，反义寡核苷酸)、VEGFR激活必需的膜定位的阻止或VEGFR下游^:应物的抑制(例如，Raf丝氨酸/苏氨酸激酶)。VEGF途径定向治疗包括多激酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、单克隆抗体和双芳基脲。激酶抑制剂的实例是双芳基脲索拉非尼，它是小分子并且是Raf(蛋白质-丝氨酸/苏氨酸激酶)和VEGFR(血管内皮生长因子受体，受体酪氨酸激酶)的新双重-作用抑制剂，因此它是肿瘤细胞增殖和血管生成的抑制剂(OnyxPharmaceuticals,Richmond,CA和BayerPharmaceuticalsCorporation,WestHaven,CT(USA);Lyons等,Endocrine-RelatedCancer8:219-225，2001)。此外，发现索拉非尼抑制肿瘤进展和新血管生成中涉及的集中其它受体酪氨酸激酶，包括PDGFR國卩、Flt-3和c-KIT。PD166285(Pfizer,Groton,CT),—种常规的酪氨酸激酶，可以对抗PDGF和FGF-2-介导的应答(Bansai等，丄NeuroscienceRes.74(4):486-493,2003)。其它耙向VEGF途径的示例治疗包括Sutent/SU11248,PTK787,MLN518,PKC-412,CDP860和XL9999。Sutent/SU11248(舒尼替尼苹果酸盐；巧|哚啉-2-酮)(Pfizer,Groton，CT),粑向受体酪氨酸激酶(RTK)，包括PDGFR,具有抗血管生成和抗胂瘤效果。PDGFR通过调节周细胞(支持血管的细胞)的增殖和迁移在培养血管生成中起着重要的作用，认为Sutent/SU11248能抑制PDGFR的血管生成作用。PTK787(Novartis,Basel,Switzerland和ScheringAG,Berlin,Germany)是抗PDGFR以及抗VEGFR和c-Kit酪氨酸激酶受体的口服小分子才元血管生成剂(anilinophthalazine)(梦/;^7,Garcia-Echevera和Fabbro,MiniReviewsinMedicinalChemistry4(3》273-283,2004)。MLN518(之前称为CT53518;MilleniumPharmaceuticals,Cambridge,MA)是设计来抑制包括PDGFR、FLT3、和c-Kit的III型受体酪氨酸激酶(RTK)的口服小分子。PKC-412[米哚妥林；N-苯曱酰-十字孢碱(十字孢碱的衍生物，链霉菌属细菌的产物)；Novartis,Basel,Switzerland]抑制PDGFR，VEGFR和多蛋白激酶Cs,"whichmakesitespeciallyattractiveinpatientswithwild-typeKITwithmutationsinPDGFR"("什么使得它在带有PDGFR突变的野生型KIT的患者中特别有吸引力")(PKC412-AnInterviewwithCharlesBlanke,MD,FACP(www.gistsupport.org/pkc412.html);Reichardt等，J.Clin.Oncol.23(16S):3016,2005)。XL999(来自Exelixis(SouthSanFrancisco,CA，USA)的几种光谱选择性激酶抑制剂(SpectrumSelectiveKinaseInhibitorsTM(SSKI))之一)4中制VEGFR,以及其它RTK,如PDGFR隱卩、FGFR1和FLT3。实施例在此所述的结构、材料、组合物和方法是本发明的代表性实施例，并且理解本发明的范围并不为实施例的范围所限定。本领域的普通技术人员知道可以根据公开的结构、材料、组合物和方法以各种变化来实践本发明，并且将这些变化视为在本发明的范围内。,滋W/.^于入j&清和j&,7fps银务W萄一《关心凝#谅定用于通过VEGFELISA分析的合适样品包括用肝素、柠檬酸盐或EDTA处理的人血浆。由于可能的干扰因子，在人血清和血浆的制备和测定中需要特别的小心。在稀释之前应当通过微量离心从样品中除去任何的絮凝剂物质。待检查的血清或血浆样品的初始浓度应该是12-13%(样品在样品稀释液中为1:8的稀释度)。例如，40)il的样品稀释于280^1的样品稀释剂中，并将100pl加入微量培养板孔中。縱才法以下ELISA实-验方案是用于夹心ELISA(OncogeneScience,Cambridge,MA)来测量人血浆和血清中的人VEGF。1、制备平板洗涤的工作溶液(IX)(作为测定试剂盒的一部分来提供)。2、对于每个样品和标准品，通过使用干净的移液管尖吸移100至适当的孔中来加入预先稀释的样品和对照，以及六个VEGF标准品(0至8000pg/mL)中的每一个，重复两份。将标准品O加入另一个孔中以用作底物空白的测定。3、用干净的塑料包装或封膜机盖住孔。在37°C培养微量滴定板1.5小时。4、小心的移除塑料包装或封膜。使用300pL/孔洗涤孔，平板洗涤緩冲液六次循环(洗涤三个循环，将平板翻转180°,再洗涤另三个循环)。5、将100检测抗体吸移至所有孔中，除了底物空白孔，其是留下空的。用新的塑料包装片盖住孔。在37。C培养微量滴定板1小时。6、通过将适当体积的缀合浓缩物(1:50的稀释度)稀释至缀合物稀释剂中来制备工作缀合物。7、如步骤4所述清洗孔。立即进行步骤8。8、将100工作缀合物吸移至所有孔，除了底物空白孔，其是留下空的。用新的塑料包装盖住孔。在室温(20-27°C)培养微量滴定板1小时。9、通过混合等份的溶液A和溶液B来制备工作底物。每个标准品的6mL溶液将提供12mL工作底物，足以产生一个微量滴定板。根据所用条带的数量来调节工作底物的体积。混合孔。10、将工作底物分配至干净的试剂槽中，并让其达到室温。11、如步骤5所述清洗孔。注意不要让平板变干。立即进行步骤12。12、将100pL工作底物吸移至所有的孔中，并用塑料包装或封膜盖住孔。在室温(20-27。C)培养微量滴定板45分钟。13、将100^L终止溶液吸移至所有孔中。14、使用分光光度平板读数器在650nm的波长测量每个孔中的吸光度。应当在加入终止溶液后的30分钟内对孔进行读数。标准曲线通过使用0、150、1000、3000、5000和8000pg/ml6个不同浓度的VEGF标准品(重组人VEGF)构建标准曲线来进行定量分析。人血清和血浆样品在用索拉非尼治疗前，从证实肾细胞癌的患者获得冷冻血浆样品。,滋辨2^々紧勿應;#,悉,^^,依照制造商的指导使用VEGFELISA(R&DSystems,Minneapolis,MN)将一式两份的样品用来测量VEGF水平。对于每个患者，测定一式两份的测量值的平均值。对于使用索拉非尼治疗的患者组和使用安慰剂治疗的患者组，表1中给出了三个时间点的VEGF的平均水平，三个时间点是基线(预治疗)，第1个周期笫21天和第3个周期第1天。图1中显示了相同的数据。结果表明索拉非尼治疗的患者组在两个时间点具有从基线显著降低的VEGF水平(使用配对t检验，p<<0.01),但是这在安慰剂治疗的患者组中没有发生(p>0.05)。表1:VEGF<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>为了说明和描述的目的，已经呈现了本发明之前描述的实施方案。但是这不意味着是穷举或限制所公开的精确形式，同时根据以上的教导显然可有很多改进和变化。为了解释本发明的原理，选择和描述了实施方案，并且它的实践因此能够使本领域技术人员可以在不同的实施方案中以不同的改进来利用本发明，以此适于所考虑的特定用途。将在此引用的所有参考文献引入作为参考。权利要求1.监控患者体内与VEGF途径相关病况和/或监控患有所述疾病的患者如何应答治疗的方法，所述方法包括在免疫上检测并定量随着时间抽取的患者样品中VEGF蛋白质水平的连续改变，其中VEGF蛋白质随时间的递增水平表明疾病进展或对所述治疗的负面应答，并且其中VEGF蛋白随时间的递减水平表明疾病减轻或对所述治疗的正面应答。2.权利要求1的方法，其中所述治疗选自多激酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制、单克隆抗体和双芳基脲。3.权利要求l的方法，其中所述治疗是VEGF途径定向治疗。4.权利要求3的方法，其中所述VEGF途径定向治疗是酪氨酸激酶抑制剂甲磺酸伊马替尼或双芳基脲索拉非尼。5.权利要求l的方法，其中所述疾病是胂瘤发生前/肿瘤疾病。6.权利要求5的方法，其中所述肿瘤发生前/肿瘤疾病选自转移性成神经管细胞瘤、隆突性皮肤纤维肉瘤、胃肠间质胂瘤、结肠直肠癌、结肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、慢性骨髓增生性疾病、急性骨髓性白血病、曱状腺癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、头颈癌、脑瘤、肝细胞癌、恶性血液病和导致上述癌症的初期癌。7.权利要求1的方法，其进一步是所述疾病的预后，其中患者样品中的所述VEGF蛋白水平表示所述患者更好或更差的预后。8.权利要求7的方法，其中所述预后是选自应答率(RR)、完全应答(CR)、部分应答(PR)、稳定疾病(SD)、进展时间(TTP)、无进展生存(PFS)、总生存率(OS)和临床益处的临床结果，临床益处包括完全应答(CR)、部分应答(PR)和稳定疾病(SD)。9.权利要求7的方法，其中VEGF的递增水平表示早期复发或转移瘤的更好的可能性。10.权利要求l的方法，其中所述患者样品是预治疗样品。11.权利要求1的方法，其中所述的患者样品选自血液、血清、血浆、尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊髓液、泪液、痰、粘液、'淋巴、胞液、腹水、胸膜积液、羊水、膀胱冲洗液和支气管肺泡灌洗液。12.权利要求l的方法，其中所述患者样品是血清或血浆。13.权利要求1的方法，其中所述免疫检测和定量是通过夹心ELISA或等价测定形式的免疫测定来实现的。14.权利要求13的方法，其中夹心ELISA或等价测定包括使用一种或多种选择性结合VEGF蛋白的单克隆体抗体。15.权利要求1的方法，进一步包括使用免疫测定来检测或检测并定量患者样品中的一种或多种其他蛋白质的水平。16.权利要求14的方法，其中所述的其他蛋白是选自抑制剂、癌蛋白、生长因子受体、血管生成因子、转移蛋白、肿瘤标记和肿瘤抑制剂的一种或多种。17.权利要求15的方法，其中所述抑制剂是金属蛋白酶-1(TIMP-1)的组织抑制剂，所述癌蛋白选自HER-2/neu和rasp21,所述生长因子受体选自表皮生长因子受体(EGFR)和血小板衍生的生长因子受体a(PDGFR-a),所述血管生成因子是血管内皮生长因子(VEGF)，所述转移蛋白是尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂(uPA),所述肿瘤标记是癌胚抗原(CEA),以及所述胂瘤抑制剂是p53。18.患病的人患者的治疗选择的方法，所述方法包括(a)免疫检测和定量取自对照群体个体的对照样品中VEGF蛋白质的平均水平；(b)免疫检测和定量随时间取自患者的相等患者样品中VEGF蛋白质水平的连续变化；(c)比较患者样品中VEGF蛋白的水平和对照样品中VEGF蛋白的平均水平；和(d)根据患者样品中VEGF蛋白质水平和对照样品中VEGF蛋白的平均水平之间的差异，并且考虑到患者样品中VEGF蛋白质水平的连续变化，决定是否使用常规治疗和/或VEGF途径定向治疗来治疗患者。19.权利要求18的方法，其中所述患者样品是预治疗样品。20.权利要求18的方法，其进一步是所述疾病的预后，其中患者样品中的所述VEGF蛋白水平表示所述患者更好或更差的预后。21.权利要求20的方法，其中所述预后是选自应答率(RR)、完全应答(CR)、部分应答(PR)、稳定疾病(SD)、进展时间(TTP)、无进展生存(PFS)、总生存率(OS)和临床益处的临床结果，临床益处包括完全应答(CR)、部分应答(PR)和稳定疾病(SD)。22.权利要求18的方法，其中所述疾病是胂瘤发生前/肿瘤疾病。23.权利要求22的方法，其中所述胂瘤发生前/胂瘤疾病选自转移性成神经管细胞瘤、隆突性皮肤纤维肉瘤、胃肠间质肿瘤、结肠直肠癌、结肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、慢性骨髓增生性疾病、急性骨髓性白血病、甲状腺癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、卯巢癌、子宫颈癌、头颈癌、脑瘤、肝细胞癌、恶性血液病和导致上述癌症的初期癌。24.权利要求18的方法，其中患者样品是来自对治疗无应答的癌症患者。25.权利要求18的方法，进一步包括使用免疫测定来检测或检测并定量患者样品中一种或多种其他蛋白质的水平。26.权利要求25的方法，其中所述的其他蛋白是选自抑制剂、癌蛋白、生长因子受体、血管生成因子、转移蛋白、肺瘤标记和肿瘤抑制剂的一种或多种。27.权利要求26的方法，其中所述抑制剂是金属蛋白酶-1(TIMP-1)的组织抑制剂,所述癌蛋白选自包含HER國2/neu和msp21,所述生长因子受体选自表皮生长因子受体(EGFR)和血小板衍生的生长因子受体a(PDGFR-a),所述血管生成因子是血管内皮生长因子(VEGF),所述转移蛋白是尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂(uPA),所述肿瘤标记是癌胚抗原(CEA),以及所述肿瘤抑制剂是p53。28.检测患者与VEGF相关疾病的诊断方法，所述方法包括(a)免疫检测和定量取自对照群体个体的对照样品中VEGF蛋白质的平均水平；(b)免疫检测和定量随时间取自患者的患者样品中VEGF蛋白质水平的连续变化；(c)比较患者样品中VEGF蛋白水平和对照样品中VEGF蛋白的平均水平；其中患者样品中VEGF蛋白水平超过对照样品中VEGF蛋白的平均水平表示患者体内激活的VEGF途径和疾病的存在。29.权利要求28的方法，其中步骤(a)和(b)所述的免疫检测和定量是通过夹心ELISA或等价测定形式的免疫测定来实现的。30.权利要求28的方法，其进一步是所述疾病的预后，其中患者样品中的所述VEGF蛋白水平表示所述患者更好或更差的预后。31.权利要求30的方法，其中所述预后是选自应答率(RR)、完全应答(CR)、部分应答(PR)、稳定疾病(SD)、进展时间(TTP)、无进展生存(PFS)、总生存率(OS)和临床益处的临床结果，临床益处包括完全应答(CR)、部分应答(PR)和稳定疾病(SD)。32.权利要求28的方法，其中所述疾病是肿瘤发生前/肿瘤疾病。33.权利要求32的方法，其中所述胂瘤发生前/肿瘤疾病选自转移性成神经管细胞瘤、隆突性皮肤纤维肉瘤、胃肠间质肿瘤、结肠直肠癌、结肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、慢性骨髓增生性疾病、急性骨髓性白血病、曱状腺癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、卯巢癌、子宫颈癌、头颈癌、脑瘤、肝细胞癌、恶性血液病和导致上述癌症的初期癌。34.权利要求28的方法，进一步包括使用免疫测定来检测或检测并定量患者样品中一种或多种其他蛋白质的水平。35.权利要求34的方法，其中所述的其他蛋白是选自抑制剂、癌蛋白、生长因子受体、血管生成因子、转移蛋白、肿瘤标记和胂瘤抑制剂的一种或多种。36.权利要求35的方法，其中所述抑制剂是金属蛋白酶-1(TIMP-1)组织抑制剂，所述癌蛋白选自包含HER-2/neu和rasp21,所述生长因子受体选自表皮生长因子受体(EGFR)和血小板衍生的生长因子受体a(PDGFR-a),所述血管生成因子是血管内皮生长因子(VEGF),所述转移蛋白是尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂(uPA)，所述肿瘤标记是癌胚抗原(CEA),以及所述肿瘤抑制剂是p53。全文摘要本发明涉及生物标记和生物标记用于癌症的预测和预后的用途，以及生物标记用于监控癌症治疗效果的用途。特别地，本发明涉及VEGF作为多激酶抑制剂的生物标记的用途。文档编号G01N33/574GK101351709SQ200680050030公开日2009年1月21日申请日期2006年11月1日优先权日2005年11月2日发明者D·比格伍德,J·J·埃尔廷,P·J·哈默,W·P·卡尼申请人:拜尔健康护理有限责任公司