用于癌症治疗的对接和锁定(dnl)疫苗的制作方法

专利名称：用于癌症治疗的对接和锁定(dnl)疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于癌症(如多发性骨髓瘤)治疗的基于树突状细胞的体内靶向抗原的疫苗的设计和产生。在优选的实施例中，通过对接和锁定(DNL)方法产生这些疫苗，其中效应子部分连接于源自AKAP蛋白的锚定域(AD)和源自蛋白激酶A (PKA)的二聚及对接域 (DDD)部分。DNL复合体在DDD部分自发地二聚并与AD部分结合时产生，所得到的复合体的DDD与连接AD的效应子之间的化学计量比为2 1。在更优选的实施例中，效应子部分包含人化抗CD74抗体和肿瘤相关异种抗原(如CD20异种抗原)。在最优选的实施例中，抗 CD74抗体为hLLl抗体。DNL构建体可用于制备药物组合物、用于产生针对癌症(如多发性骨髓瘤(MM))的疫苗以及用于诱导针对表达肿瘤抗原的细胞(如患有多发性骨髓瘤和其它表达CD20的癌的患者中的CD20阳性癌细胞)的免疫反应。
相关技术 多发性骨髓瘤(MM)是恶性血液肿瘤，其特征是骨髓中的赘生性浆细胞的克隆样增生。尽管MM对许多化学治疗剂有反应，但其基本上仍难以治愈，并且大多数患者最终会复发，这是因为存在一小群MM癌干细胞，这些癌干细胞可在经标准或高剂量化学治疗下存活，并且对化学治疗药物具有抗性(Reece等，Leuk Lymphoma，2008，49 1470-85)。此少量的MM癌干细胞构成微小的残留病变并引起复发，最终导致所有治疗的失败。因此，根除MM 癌干细胞可长期控制或甚至治愈MM。
近来，从MM患者的MM细胞系和初级骨髓中鉴别出一小群克隆型B细胞，这些细胞不表达特性浆细胞表面抗原⑶138，但确实表达B细胞抗原⑶20 (Matsui等，Blood 2004， 103 :2332-6)。这一小群细胞对许多临床抗骨髓瘤药物有抗性，并且能够进行离体克隆性生长(Matsui 等，Blood 2004，103 :2332-6 ；Matsui 等，Cancer Res. 2008,68 :190-7)以及在 3D培养模型中克隆性生长(Kirshner等，Blood 2008，112 :2935-45)，且能够离体地分化成 MM细胞以及在植入N0D/SCID小鼠中(初次移植和再次移植期间)分化成MM细胞(Matsui 等，Cancer Res. 2008，68 190-7)。因此已提出这些CD138MgCD20+细胞代表假定的多发性骨髓癌干细胞(Huff 和 Matsui，J Clin Oncol. 2008，26 :2895-900)。
类似于其它癌干细胞，MM癌干细胞耐受许多化学治疗药物，并且是肿瘤再生长和复发的原因(Huff 和 Matsui，J Clin Oncol. 2008，26 J895-900 ;Yang 和 Chang，Cancer divest. 2008，沈741-55)。需要可选择性地靶向并根除癌干细胞(如MM干细胞)的策略和方法。由于癌干细胞的多重抗药性，免疫疗法和疫苗接种可提供潜在的方式根除这些细胞，特别是在进行标准疗法和/或干细胞移植之后，肿瘤负荷大幅减少之时。需要探索针对性治疗多发性骨髓瘤的免疫疗法和疫苗接种的有效组合物及方法，特别是能够诱导针对MM 癌干细胞的免疫反应、抑制或根除MM癌干细胞的组合物及方法。进一步需要探索针对性治疗一般癌症的免疫疗法和疫苗接种的有效组合物及方法。

发明内容
本发明公开了用于针对癌干细胞(如匪干细胞)的疫苗的方法和组合物，所述组合物是通过采用对接和锁定(DNL)方法制备的(Chang等，2007，Clin Cancer Res 13: 5586s-91s)。DNL技术已用于产生适于体内应用的各种稳定和确定的复合体。在优选的实施例中，DNL复合体包含连接于二聚及对接域(DDD)或锚定域(AD)部分的抗⑶74抗体或其抗原结合片段(如hLLl抗体)。DDD部分自发地二聚且每个DDD 二聚体与AD部分结合。 在更优选的实施例中，互补AD或DDD部分连接于CD20异种抗原(如下文进一步详述)，结果形成包含抗CD74部分和CD20异种抗原部分的DNL复合体。然而，技术人员会意识到，根据癌症的情况，可利用不同的异种抗原和/或抗体或抗体片段。抗体组分将DNL复合体导向诸如树突状细胞(DC)的抗原呈递细胞(APC)，而异种抗原组分的进程引起针对表达靶抗原的细胞的免疫反应。
在请求保护的方法和组合物的范围内可以构建和使用具有不同结构和不同的靶抗原(如CD20)与抗体或抗体片段之比的各种类型的DNL复合体，如以下当中所公开的那些美国专利No. 7，550，143 (其第观栏第30行至第44栏第观行以引用的方式并入本文)； 美国专利No. 7，521，056 (其第58栏第1行至第84栏第45行以引用的方式并入本文)；美国专利No. 7，534，866 (其第31栏第1行至第36栏第38行以引用的方式并入本文)；美国专利No. 7，527，787 (其第61栏第51行至第94栏第65行以引用的方式并入本文)以及美国专利申请公开No. 2009/006082(其W035]段至W097]段以引用的方式并入本文)。由三聚体、四聚体、五聚体、六聚体及其它结构组成的DNL复合体已经报道在以上引用的公布专利中。
在最优选的实施例中，该抗癌疫苗DNL构建体包含人化或嵌合LLl抗CD74 抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含轻链可变互补决定区(CDR) 序列 CDRl(RSSQSLVHRNGNTYLH ；SEQ ID NO 1) , CDR2(TVSNRFS ；SEQ ID NO 2)禾口 CDR3 (SQSSHVPPT ；SEQ ID NO 3)以及重链可变区 CDR 序列 CDRl (NYGVN ;SEQ ID NO :4)、 CDR2 (WINPNTGEPTFDDDFKG ；SEQ ID NO 5)和 CDR3 (SRGKNEAWFAY ；SEQ ID NO 6)。适用于请求保护的DNL复合体的人化LLl (hLLl)抗⑶74抗体公开于美国专利No. 7，312，318中，该专利的第35栏第1行至第42第27行以及图1至图4以引用的方式并入本文。作为另外的选择，可利用其它抗CD74抗体或针对其它APC或DC相关抗原的抗体。
适用于抗癌疫苗DNL复合体中的各种CD20异种抗原的序列是本领域中已知的， 如鼠⑶20序列(SEQ ID NO :7)。技术人员通过诸如NCBI蛋白质数据库(见例如，NCBI Accession No. NP 031667 ；P19437 ；AAA37394 ；BAE47068 ；ABA29631 ；BAD77809)之类的公知公用数据库可易于获得其它可能使用的CD20氨基酸序列。尽管本文提及了鼠CD20序列， 但技术人员会意识到CD20氨基酸序列是已知的且可从多种物种中获得，并且可结合到抗癌疫苗DNL复合体当中。然而，技术人员会意识到，其它肿瘤相关抗原(TAA)在本领域中是已知的，并且可用于DNL复合体中来诱导针对表达不同TAA的肿瘤的免疫反应。
具有潜在用途的已知TAA包括但不限于碳酸酐酶IX、甲胎蛋白、α -辅肌动蛋白-4、A3、Α33 抗体特异性抗原、ART-4、Β7、Ba 733、BAGE、BrE3-抗原、CAl25、CAMEL、CAP-I、 CASP-8/m、CCCL19、CCCL21、CDl、CDla, CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CDl 1A、CD14、CD15、CD16、 CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、 CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54, CD55、CD59、CD64、CD66a_e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、 CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK_4/m、CDKN2A、结肠特异性抗原-ρ (CSAp)、CEA(CEACAMQ、CEACAM6、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGPl、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、 Flt-U Flt-3、叶酸盐受体、G250 抗原、GAGE、gplOO、GROB, HLA-DR、HMl. 24、人体绒毛膜促性腺激素(HCG)及其亚单元、HER2/neu、HMGB-l、缺氧诱导因子(HIF-I)、HSP70-2M、HST-2、 la、IGF-1R、IFN-y、IFN- α、IFN- β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、 IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)、KC4_ 抗原、 KS-I-抗原、KS 1-4、Le-Y, LDR/FUT、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART-1、 MART-2、NY-ES0-1、TRAG-3、mCRP、MCP-U MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUCl、MUC2、MUC3、MUC4、 MUM-1/2, MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、PAM-4抗体特异性抗原、胎盘生长因子、p53、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME, PSMA、PlGF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES, TlOl、 SAGE、S100、存活素、存活素-2B、TAC、TAG-72、腱生蛋白、TRAIL受体、TNF-α、Tn抗原、 TF(Thomson-Friedenreich)抗原、肿瘤坏死抗原、VEGFR、ED-B 纤连蛋白、WT-1U7-1A-抗原、补体因子〔3、033、0313、(^1、05、血管生成标记物、1^1-2、1^1-6、1(仪8、0]\^1\致癌基因标记物和致癌基因产物(见例如，Sensi 等，Clin Cancer Res 2006,12 :5023-32 ；Parmiani 等，J Immunol 2007，178 1975-79 ;Novellino 等，Cancer Immunol Immunother 2005,54 187-207)。诸如鼠蛋白氨基酸序列的异种抗原氨基酸序列可易于从诸如NCBI蛋白质数据库的公用数据库获得。
技术人员会进一步意识到，有可能将其它已知的抗体或其抗原结合片段结合到抗癌疫苗DNL构建体当中。在优选的实施例中，抗体与由APC、更优选由树突状细胞表达的抗原结合。多种与树突状细胞相关的抗原是本领域中已知的，这些抗原包括但不限于 CD209 (DC-SIGN)、CD34、CD74、CD205、TLR 2 (铎样受体 2)、TLR 4、TLR 7、TLR 9、BDCA-2、 BDCA-3、BDCA-4和HLA-DR。在优选的实施例中，靶抗原为⑶74。然而，已知其它类型的靶抗原与树突状细胞相关，且结合靶向任何这种备选抗原的抗体的抗癌疫苗DNL构建体可用于请求保护的方法和组合物中。在一些实施例中，抗癌疫苗DNL构建体可包含抗CD74抗体或其抗原结合片段以及另一抗树突状细胞抗体或片段。可用于抗癌疫苗DNL构建体的示例性抗体包括但不限于hLLl (抗CD74，美国专利No. 7，312，318)和hL243 (抗HLA-DR，美国专利申请No. 11/368，四6)，这两者的实例部分均以引用的方式并入本文。
优选使用嵌合抗体，因为它们具有人抗体恒定区序列，因此不会引起如鼠抗体那样强的人抗鼠抗体(HAMA)反应。甚至更优选使用人化抗体，以便进一步降低诱导HAMA反应的可能性。如下文所讨论，通过用相应的人抗体框架和恒定区序列取代鼠框架和恒定区序列使鼠抗体人化的技术在本领域内已熟知且已应用于许多鼠抗癌抗体中。抗体人化还可涉及用来自亲本鼠框架区序列的相应残基来取代一个或多个人框架氨基酸残基。也如下文所讨论，用于产生人抗体的技术也已熟知，且这种抗体可结合到受试者抗癌疫苗构建体当中。
在某些实施例中，可将抗癌疫苗DNL构建体与至少一种治疗剂联合施用，该治疗剂可在构建体之前、与其同时或在其后施用。在优选的实施例中，治疗剂在抗癌疫苗之前施用。然而，在可供选择的实施例中，治疗剂可与DNL构建体联合施用或甚至与DNL构建体缀合。如下文更为详细的讨论，本领域已知的任何治疗剂均可与抗癌疫苗DNL构建体联合使用，这些治疗剂包括但不限于放射性核素、免疫调节剂、抗血管生成剂、细胞因子、趋化因子、生长因子、激素、药物、前体药物、酶、寡核苷酸、SiRNA、促凋亡剂、光敏治疗剂、细胞毒素剂、化学治疗剂、毒素、其它抗体或其抗原结合片段。
在一个优选的实施例中，治疗剂为细胞毒素剂，如药物或毒素。还优选的是，该药物选自氮芥、乙撑亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲、吉西他滨、三氮烯、叶酸类似物、蒽环霉素、紫杉烷、C0X-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗生素、酶抑制剂、表鬼白毒素、钼配位络合物、长春花生物碱、取代脲、甲基胼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、激素拮抗剂、内皮他丁、紫杉酚、喜树碱、SN-38、阿霉素及其类食物、抗代谢物、烷化剂、抗有丝分裂物质、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、mTOR抑制剂、热休克蛋白(HSP90)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、 HDAC抑制剂、促凋亡剂、甲氨蝶呤、CPT-Il以及它们的组合。
在另一优选的实施例中，治疗剂为选自以下的毒素篦麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素Α、商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素以及它们的组合。或者为选自以下的免疫调节剂细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、成血因子、菌落刺激因子(CSF)、干扰素 (IFN)、干细胞生长因子、促红细胞生成素、促血小板生成素以及它们的组合。
在其它优选的实施例中，治疗剂为选自mh、mLu、212Bi、213Bi、211At、62CU、67CU、9°Y、 125I、131I、32P、33P、47SC、mAg、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166H0、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、 ”5Ac、59!^、75k J7AsJ9SiN99McK1c15RtK1c19PcU 143ft~、149Pm、lfi9Er、194Ir、198AU、199AU 和 211Pb 及其组合的放射性核素。还优选的是随俄歇发射粒子而充分衰变的放射性核素。例如，Co-58、Ga-67、 Br-80m、Tc_99m、Rh_103m、Pt-109、In-Ill、Sb-119、1-125、Ho-161、0s_189m 和 Ir-192。 有用的发射β粒子的核素的衰变能优选小于l，000keV，更优选小于lOOkeV，最优选小于 <70keV。还优选的是随α粒子产生而充分衰变的放射性核素。这种放射性核素包括(但不限于)Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、 Bi-213和Fm-255。有用的发射α粒子的放射性核素的衰变能优选为2，000-10，OOOkeV， 更优选为3，000-8, OOOkeV，最优选为4，000-7, OOOkeV。可能应用的其它放射性同位素包括 11Cj3Nj5Oj5Bni98AuJ24AGi26L133IJ7Bn113In^Riu 97Riu imRu、舰Riu1ci7Hg^3Hg, 1211e、 122mI^i25mThl65TnKl67TnKl68TnKi97Ptjc19Pcuic15RtKi42PiNi43PiNl6lTlKl66HcKi99Aiu57CcK58CcK51CiN 59Fe J5Se^1TL225AcJ6BiN16Ib等。在其它实施例中，治疗剂为选自发色团和染料的光敏治疗剂。
作为另外的选择，治疗剂为选自以下的酶苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V 型类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α -磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β -半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。这种酶可与(例如)前体药物联合使用，这些前体药物可以相对无毒的形式施用并在靶位点由酶转化成细胞毒素剂。在其它可供选择的方案中，药物可通过受试者中的内源酶转化成低毒形式，但也可通过治疗酶再转化成细胞毒素形式。
虽然在优选的实施例中，抗癌疫苗DNL复合体可用于治疗多发性骨髓瘤，但技术人员会意识到CD20/抗CD74构建体可潜在地用于其它类型的疾病，如其它形式的CD20+癌症，如B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、弥漫性B细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin' s lymphoma)或非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin' s lymphoma) 0若使用不同于⑶20的肿瘤相关异种抗原，技术人员会意识到，使用请求保护的DNL复合体可靶向带有相关TAA的任何类型的癌。
还有其它实施例涉及编码融合蛋白(如抗体-DDD或异种抗原-DDD融合蛋白或者抗体-AD或异种抗原-AD融合蛋白)的DNA序列、包含所述DNA序列的载体和宿主细胞以及制备用于产生抗癌疫苗DNL构建体的融合蛋白的方法。相关的实施例包括用于制备抗癌疫苗DNL构建体的融合蛋白、抗体-DDD或异种抗原-DDD融合蛋白或者抗体-AD或异种抗原-AD融合蛋白。在可供选择的实施例中，可通过例如抗体或抗体片段与DDD肽或CD20异种抗原与AD肽的化学交联形成DNL复合体的亚单元组分。就特定的实施例而言，融合蛋白或化学交联的缀合物可连接于诸如诊断剂的报告部分。多种诊断剂是本领域中已知的，如放射性核素、造影剂、荧光剂、化学发光剂、生物发光剂、顺磁离子、酶和光敏诊断剂。
优选地，诊断剂为能量介于20KeV与4，OOOKeV的放射性核素或选自以下的放射性核素:110h、mIn、117LU、18F、5午θ、62^!、64^!、67^!、6^!、 ^、’、9’、8^、94"^、94!^、99"^、120!、 123l、124l、125l、131l、154-158Gd、32p、llc、13N、15o、186Re、188Re、5lMn、52mMn、55Co、72As、75Br、7fiBr、82mRb、
83Sr或其它Y-、或正电子发射体。
还优选的是，诊断剂为顺磁离子，如铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、 镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬 (III)和铒(III)；或不透射线的材料，如钡、泛影酸盐(diatrizoate)、乙碘油、柠檬酸镓、 碘卡明酸、碘西他酸、碘达酸、胆影酸、碘沙酸、碘古酰胺(iogulamide)、碘海醇、碘帕醇、 碘番酸、碘普西酸、碘西法酸、碘丝酸、碘砜葡胺、iosemetic acid、碘酞硫、碘得酸、异泛影酸、碘托西酸、碘克沙酸、羟泛影酸、碘泊酸盐(ipodate)、葡甲胺、甲泛葡胺、甲泛影酸盐 (metrizoate)、丙碘酮和氯化亚铊。
还在其它实施例中，诊断剂为选自异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、 别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺的荧光标记化合物、选自鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶酯、 咪唑、吖啶盐和草酸酯的化学发光标记化合物或选自莹光素、荧光素酶和水母发光蛋白 (aequorin)的生物发光化合物。
具体实施例方式定义 如本文所用，术语“一”和“所述”可指单数或复数，除非上下文以其它方式明确其仅指单数。
如本文所用，术语“约”是指数值增加或减少百分之十(10% )。例如，“约100”是指介于90与110之间的任何数值。
抗体是指全长(即天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组方法形成的) 免疫球蛋白分子(例如IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性的抗原结合部分(如抗体片段)。
抗体片段是指抗体的一部分，如F(ab丨)2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等。无论结构如何，抗体片段均与由完整抗体识别的相同抗原结合。因此，该术语与“抗原结合抗体片段”的使用含义相同。术语“抗体片段”还包括由可变区组成的分离片段，如由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段，以及其中轻链与重链的可变区通过肽连接体连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)。如本文所用，术语“抗体片段”不包括无抗原结合活性的抗体部分，如Fc片段或单个氨基酸残基。其它抗体片段(例如单域抗体片段)是本领域中已知的且可用于请求保护的构建体中(见例如Muyldermans等，TIBS26 =230-235,2001 ；Yau等，J Immunol Methods 281161-75，2003 ；Maass 等，J Immunol Methods 324 13-25，2007)。
术语SM^m可指重组产生的抗原结合分子，其中具有相同或不同特异性的一个或多个相同或不同的单链抗体或抗体片段部分相连接。融合蛋白的价(valency)是指该融合蛋白所具有的与单抗原或表位结合的结合臂或位点的数目，即单价、二价、三价或多价。抗体融合蛋白的多价是指其可利用多种相互作用与抗原结合，从而提高与抗原结合的亲合力。特异性是指抗体融合蛋白能够结合的抗原或表位数，即单特异性、双特异性、三特异性、多特异性。根据这些定义，天然抗体，例如IgG，由于其具有两个结合臂而为单价，但由于其与一个表位结合而为单特异性。单特异性的多价融合蛋白具有不止一个表位的结合位点，但仅与一个表位结合。融合蛋白可包含单抗体组分、不同抗体组分的多价或多特异性的组合或相同抗体组分的多个拷贝。融合蛋白可另外包含抗体或抗体片段以及治疗剂。适于这种融合蛋白的治疗剂的例子包括免疫调节剂和毒素。一种优选的毒素包含核糖核酸酶 (RNA酶)，优选为重组RNA酶。然而，该术语不是限制性的，多种蛋白质或肽效应子可结合到融合蛋白当中。在另一非限制性实例中，融合蛋白可包含用于产生如下所述DNL构建体的AD或DDD序列。
嵌合抗体是含有包括源自一个物种的抗体互补决定区(OTR)在内的可变域的重组蛋白质，该抗体优选为啮齿动物抗体，而抗体分子的恒定区源自人抗体的恒定区。就兽医应用而言，嵌合抗体的恒定区可源自其它物种，如猫或犬。
人化抗体为重组蛋白质，其中将来自一个物种的抗体(如啮齿动物抗体)的CDR 从啮齿动物抗体的重可变链和轻可变链转移至人重链和轻链可变域(例如框架区序列)当中。抗体分子的恒定域源自人抗体的恒定域。在某些实施例中，有限数目的来自亲本(啮齿动物)抗体的框架区氨基酸残基可取代到人抗体框架区序列当中。
人抗体是例如从转基因小鼠中获得的抗体，这种小鼠已“经过改造”而可响应抗原刺激产生特异性人抗体。在此技术中，将人重链和轻链基因座的元件引入到源自胚胎干细胞系的小鼠品系当中，所述胚胎干细胞系具有内源鼠重链和轻链基因座的靶向断裂。转基因小鼠能够合成对特定抗原具有特异性的人抗体，这些小鼠可用于产生分泌人抗体的杂交瘤。从转基因小鼠中获得人抗体的方法由下列学者进行了描述=Green等，Nature Genet. 7 13(1994) ；Lonberg 等，Nature368 :856(1994)；和 Taylor 等，Int. Immun. 6 :579 (1994)。也可以通过基因或染色体转染方法以及噬菌体展示技术来构建全人抗体，所有这些技术都是本领域中是已知的。见例如，McCafferty等，Nature348 :552-553 (1990)，其描述了从未免疫供体的免疫球蛋白可变域基因谱中离体产生人抗体及其片段。在此技术中，将抗体可变域基因按阅读框架克隆到丝状噬菌体的主要或次要的外壳蛋白基因当中，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体功能特性的选择也导致对编码显示出那些特性的抗体的基因进行选择。以此方式，噬菌体模拟了 B细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种格式实施，作为回顾，见例如 Johnson禾口 Chiswell,Current Opiniion in Structural Biology 3 :5564-571 (1993)。也可通过离体活化B细胞来产生人抗体。见美国专利No. 5，567，610和No. 5，229，275，其实例部分以引用的方式并入本文。


图1. hLLl在人血DC亚群、B细胞和单核细胞上的特异性结合。(A)不同APC亚群的门控策略。(B)⑶74在APC中的表达。(C)hLLl在细胞上的结合效率。数字代表平均荧光强度。
图2.⑶74在源于人单核细胞的未成熟(对比成熟)的DC中的表达，以及hLLl 与源于人单核细胞的未成熟(对比成熟)的DC的结合效率。将源于人单核细胞的DC(在 hGM-CSF和hIL-4的存在下培养后第5天)用FITC标记的抗CD74抗体或AlexaFluor488 标记的hLLl染色，同时结合用抗HLA-DR和⑶83的荧光标记的mAb染色。对HLA-DR阳性细胞进行门控和分析。(A) CD74在未成熟和LPS成熟的DC中的表达。(B) hLLl与未成熟(对比LPS成熟)的DC的结合。(C)在未成熟和成熟的DC中⑶83、HLA-DR、⑶74的表达以及 hLLl结合的比较。
图3. hLLl对B细胞恶性Daudi细胞和正常DC的细胞毒性效应的并列比较。㈧ hLLl对Daudi和DC的影响的比较。(B)延长剂量时间后hLLl对DC的细胞活力的影响。 (C) hLLl对Daudi细胞的细胞毒性影响。(D)显微图像显示hLLl对DC活力无影响。
图4.通过hLLl对DC结构成熟度的适度增强。从源于人单核细胞在hGM_CSF和 hIL-4的存在下第5天的DC中门控HLA-DR阳性细胞群。㈧通过流式细胞术测量抗原呈递分子HLA-DR、共刺激分子⑶M和⑶86的表达。(B)抗原呈递分子HLA-DR、共刺激分子 ⑶讨和⑶86的表达水平。
图5. hLLl对DC介导的T细胞增殖无显著影响。将经hLLl处理的DC与CFSE标记的异源PBMC共同培养8天㈧或11天(B)。将扩增T细胞用针对CD4的Percp缀合mAb 染色。分析了总T细胞、⑶4+和⑶4-T细胞的细胞增殖。
图6.通过有利于朝Thl效应细胞分化的hLLl处理的DC对原态⑶4+T细胞的极化。将采用磁珠分选柱(MACS)从人PBMC中分离的原态CD4+T细胞与hLLl处理的异源DC 共同培养。不同时间点(第11、13和18天)后收获细胞，用PMA和离子霉素刺激，并通过用荧光标记的hIFN-γ和hIL-4抗体染色的细胞内细胞因子进行分析。对Thl/Th2/Th0细胞群进行门控和分析。确定在由hLLl处理的DC或由GAH交联的hLLl处理的DC刺激的T 细胞中的流动细胞因子产量。(C)示出在DC/T共培养后的不同天时，在没有或存在通过GAH 交联的情况下在两个供体中的Thl响应的数据。(D)通过hLLl来增加Thl群的剂量-效应曲线。
用于治疗多发性骨髓瘤和其它癌症的疫苗 ⑶20通常在B细胞谱系的细胞中表达。据最近报道，⑶20在从MM细胞系或临床标本中分离的MM细胞的小群中表达，这些MM细胞不表达特性浆细胞表面抗原⑶138，但具有高度的产克隆潜能，并且对多种临床抗骨髓瘤药物具有抗性(Matsui等，Blood 2004，103 2332-6 ；Matsui 等，Cancer Res. 2008,68 :190-7)。这些 CD20+CD138-细胞能够离体地克隆性生长和在3D培养模型中克隆性生长(Kirshner等，Blood 2008，112 :2935-45)，并且能够离体地分化成MM细胞以及在植入N0D/SCID小鼠模型中(初次移植和再次移植期间)分化成MM细胞。因此已提出这些⑶138胃CD20+细胞代表假定的多发性骨髓瘤癌干细胞。
贞1 丰丁石皮X寸罾.贞^^去白々免.贞而寸f十牛白々力fe。 午目关 Ag(TAA)代表非先天免疫原性的组织分化Ag。识别这些具有高亲合力的TAA/自体Ag的T 细胞在胸腺中被克隆性删除或者在外周被去能化(anergized)。然而，已证实用异种抗原进行免疫能够克服针对同源自体Ag的免疫耐受性。在I期临床试验中，在用负载重组小鼠PAP的树突状细胞免疫的21名前列腺癌患者中，有11名患者对同源自体Ag产生了 I型 T细胞增殖反应，有6名患者表现出先发前列腺癌的临床稳定(Rmg等，J Immunol. 2001, 167(12) :7150-6)。这些结果表明异种抗原免疫可打破人体中对自体Ag的耐受性，从而在临床上取得显著的抗肿瘤效果。
CD20作为针对MM的免疫治疗和疫苗接种的靶标。如上所沭,CD20为匪癌干细胞的标志。由于免疫耐受性的原因，作为大多数分化阶段上在正常B细胞上表达的自体抗原在理论上难以通过疫苗策略被靶向。然而，已在B细胞淋巴瘤的肿瘤攻击模型中通过针对 CD20的异种DNA疫苗成功地实现了疫苗接种。尽管通过靶向CD20的疫苗可诱导针对B细胞的自身免疫，但其不应引起较大的问题，因为B细胞池并非重要和关键的组织，可由其系祖细胞补充。基于这些考虑，靶向CD20的治疗疫苗会有效地选择性根除MM癌干细胞。
单克隆抗⑶20抗体作为用于根除匪干细胞的潜在形式。⑶20+MM祖细胞的发现推动了若干小临床试验的开展，用以测试利妥昔(rituximab，一种抗CD20单克隆抗体) 在MM患者中的功效。如Kapoor等(Br J Haematol. 2008，141 :135-48)所综述，采用利妥昔的抗CD20疗法在大约10%的患有多发性骨髓瘤的CD20+患者中诱导出局部反应。此外，初步证据显示50-57%的⑶20+患者的病情稳定性持续10-27个月(Kapoor等，(Br J Haematol. 2008，141 :135-48)。此外，Bergua 等的病例报告(Leukemia. 2008,22 :1082-3) 中将利妥昔与化学疗法联合使用，治疗后未在免疫表型、骨髓穿刺或活组织检查中发现微小的残存病灶，并且CD20+浆细胞消失。这些结果证明有必要进行大规模的临床试验来确定此策略在治疗骨髓瘤中的作用。由于疫苗方法可诱导CTL反应，因此预期可用于补充针对CD20MM干细胞的单克隆抗体治疗。
将抗原体内靶向至树突状细胞及其它抗原呈递细胞作为用于疫苗接种和打破免疫耐警件的有效策略。作为专门的抗原旱递细胞，树突状细胞(DO在协调先天性免疫与适应性免疫中起关键作用，并已用于产生有效疫苗(Vulink等，Adv Cancer Res. 2008,99 363-407 ；0' Neill 等，Mol Biotechnol. 2007，36 131-41)。将抗原体内靴向至 DC 代表了一种基于DC的疫苗接种的有前途的方法，因为该方法可避免繁杂且昂贵的体外抗原负载和培养，并有利于基于DC的免疫疗法的大规模应用(Tacken等，Nat Rev Immunol. 2007, 7 790-80 。更显著地，体内DC靶向疫苗接种在诱导抗肿瘤免疫反应方面更有效，并且可更有效地控制动物模型中的肿瘤生长(Kretz-Rommel等，J Immunother 2007,30 :715-726) 除 DC 外，B 细胞为能够激发 Thl/Th2 细胞(Morris 等，J Immunol. 1994，152 :3777-3785 ； Constant, J Immunol. 1999，162 :5695-5703)和通过交叉呈递激活 CD8 T 细胞(Heit 等，JImmunol. 2004,172 :1501-1507 ；Yan 等，Int Immunol. 2005,17 :869-773)的另一种类型的有效抗原呈递细胞。据最近报道，将抗原体内靶向至B细胞打破MUCl的免疫耐受性(Ding 等，Blood 2008，112 :2817-25)。
CD74作为用于靶向疫苗接种的潜在警体。一㈣在DC上表汰的警体已用作体内抗原靶向的靶标，这些受体如甘露糖受体(He等，J. Immunol 2007,178,6259-6267 ； Ramakrishna 等，J. Immunol. 2004，172,2845-2852)、CD205 (Bonifaz 等，J Exp Med. 2004， 199 :815-24)、DC-SIGN(Tacken 等，Blood 2005，106 1278-85)和 LOXl (Deineste 等， Immunity 2002，17，353-362)等。CD74 是对正确折叠 MHC II 和将MHC II-CD74 复合体靶向至核内体所必需的II型整合膜蛋白(Stein等，Clin Cancer Res. 2007，13 :5556s_5563s ； Matza等，Trends Immunol. 2003,24(5) :264-8)。CD74表达不限于DC，而是可见于几乎所有的抗原呈递细胞(Freudenthal 等，Proc Natl Acad Sci USA. 1990,87 :7698-702 ；Clark 等，J Immunol. 1992,148(11) :3327-35)。CD74在APC中的广泛表达与在骨髓DC中的单一表达相比可具有一些优点，因为已报道将抗原靶向至其它APC (如B细胞)会打破免疫耐受性(Ding等，Blood 2008，112 :2817-25)，且靶向至类浆细胞DC会将抗原交叉呈递至原态 CD8 T细胞。更重要的是，CD74也在滤泡DC中表达(Clark等，J Immunol. 1992，148 (11) 3327-3 ，这些滤泡DC是对将抗原呈递至B细胞至关重要的DC亚群(Tew等，Immunol Rev. 1997，156 :39-52)。这种表达型使⑶74成为用于体内靶向疫苗接种的极佳候选物。
人化抗CD74单克隆抗体hLLl作为具有对接和锁定技术平台的新型靶向工具。下文更详细讨论的DNL技术提供将几乎任何选定的效应子部分连接到共价或非共价复合体当中的方法(Goldenberg 等，J Nucl Med. 2008，49 158-63 ;Rossi 等，Proc Natl Acad Sci USA. 2006,103(18) :6841-6)。DNL方法已产生了若干含与癌胚抗原(CEA)反应的Fab片段的三价双特异性结合蛋白，并且已通过预靶向策略成功地用于改善癌成像和放射免疫性治疗(Goldenberg 等，J Nucl Med. 2008，49 :158-63)。
hLLl 为针对人 CD74 的人化单克隆抗体(Leung 等，Mol Immunol. 1995，32 1416-1427 ；Losman 等，Cancer 1997,80 :2660-2666 ；Stein 等，Blood 2004,104 3705-11)。此MAb在通过第二抗体交联时表现出针对B细胞恶性肿瘤的细胞毒性。裸hLLl 还能控制匪小鼠模型中的肿瘤生长。然而，我们近来的数据表明，在存在或不存在交联作用时，hLLl都没有针对人单核细胞源性DC的细胞毒性。但我们的初步数据显示，hLLl能有效地结合血液DC和B细胞的不同亚群。其还可适度地诱导DC成熟并朝Thl效应子细胞极化原态T细胞分化，这表明其具有一些辅助活性，可以用作靶向工具的良好候选物。这使得通过DNL携带的hLLl抗体来构建靶向APC的基于DNL的肿瘤疫苗成为可能且可行。
用于选择性消除癌干细胞的免疫疗法。癌干细胞能自我更新，具有不受限制的增殖能力，并且对多种治疗方法具有抗性。一个紧迫且值得关注的问题是，癌干细胞是否对免疫疗法敏感。就白血病而言，据报道CD8(+)次要组织相容性抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞克隆可消除人急性骨髓性白血病干细胞(Bonnet等，Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1999， 96:8639-8644)。最近，Rosinski 等(Blood 2008, 111 :4817-26)报道 DDX36 编码的 H-Y 表位通过白血病干细胞表达，并且可通过DDX36特异性CTL识别，这可防止在N0D/SCID小鼠中植入人急性白血病(Rosinski等，Blood 2008，111 :4817-26)。另一份报道指出，通过mHA 特异性CTL克隆的离体预培养完全抑制mHA骨髓性白血病干细胞在N0D/SCID y cnu11小鼠中的植入(Kawase等，Blood 2007,110 :1055-63)。这些结果突出了免疫疗法可以成为选择性消除癌干细胞(包括MM干细胞)的潜在有效方法的前景，该方法应可实现对这种恶性肿瘤的长期控制或甚至治愈这种恶性肿瘤。
对接和锁定(DNL)方法 DNL方法利用发生在cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)的调节(R)亚单元与A激酶锚定蛋白(AKAP)的锚定域(AD)之间的特异性蛋白质/蛋白质相互作用(Baillie等，FEBS Letters. 2005 ；579 :3264 ；Wong 和 Scott,Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004 ；5 :959)。1968 年首次从兔骨骼肌中分离出PKA，其在由第二信使cAMP与R亚单元的结合所引导的研究最充分的信号转导途径之一中起核心作用(Walsh等，J. Biol. Chem. 1968 ；243 :3763)。全酶结构由被R亚单元保持于非活性形式的两个催化亚单元组成(Taylor，J. Biol. Chem. 1989 ；264 8443)。发现PKA的同工酶具有两种类型的R亚单元(RI和RII)，每种类型均具有α和β 异形体(Scott, Pharmacol. Ther. 1991 ；50 :123)。R亚单元仅被分离为稳定的二聚体，并且已证实二聚域由前44个氨基末端残基组成(Newlon等，Nat. Struct. Biol. 1999 ；6 :222)。 cAMP与R亚单元的结合导致活性催化亚单元的释放，从而得到广谱的丝氨酸/苏氨酸激酶活性，这些活性催化亚单元通过PKA经由其与AKAP的对接实现的区室化朝选定的底物定位 (Scott 等，J. Biol. Chem. 1990 ；265 ；21561)。
自从1984年表征首个AKAP，即微管相关蛋白_2以来(Lohmann等，Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1984 ；81 :6723)，已经在从酵母到人类的多个物种中鉴别出具有不同样结构的50多种AKAP，它们定位于各种亚细胞位点，包括质膜、肌动蛋自细胞骨架、细胞核、线粒体和内质网(Wong 和 kott，Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004 ；5 :959)。AKAP 对 PKA 的 AD 为 14-18个残基的两亲性螺旋(Carr等，J. Biol. Chem. 1991 ；266 :14188)。AD的氨基酸序列在各AKAP之间差别很大，据报道对RII 二聚体的结合亲和力为2至90nM(Alto等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003 ； 100 :4445)。有意思的是，AKAP只与二聚R亚单元结合。对于人 RII α，AD与由23个氨基末端残基形成的疏水表面结合(Colledge和kott，Trends Cell Biol. 1999 ；6 216)。因此，人RIIa的二聚域和AKAP结合域均位于在本文中称为DDD的相同的 N-末端 44 氨基酸序列内(Newlon 等，Nat. Mruct. Biol. 1999 ；6 :222 ；Newlon 等，EMBO J. 2001 ；20 1651)。
作为连接体模块的人RII α的DDD和AKAP的AD 我们已经开发出利用人RII α的DDD和AKAP的AD作为极佳的连接体模块对用于将任何两个实体(在下文中称为A和B)对接成非共价复合体的平台技术，可通过将半胱氨酸残基引入DDD和AD的重要位置以促进二硫键的形成而将该非共价复合体进一步锁定成稳定束缚结构(stably tethered structure) 0 “对接和锁定”技术的一般方法如下。通过使DDD序列与A的前体连接来构建实体A，得到以下称为a的第一组分。由于DDD序列会影响二聚体的自发形成，因此A将由 组成。通过使AD序列与B的前体连接来构建实体B， 得到以下称为b的第二组分。包含在％中的DDD的二聚模体将产生用于与包含在b中的 AD序列结合的对接位点，从而促进 与b迅速缔合以形成由a2b构成的二元三聚复合体。 通过随后经由二硫桥共价固定两个实体的反应使这一结合事件不可逆，该反应基于有效的局部浓度原理而非常有效地发生，因为初始的结合相互作用会使置于DDD和AD 二者上的活性硫醇基靠近(Chmura等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001 ；98 :8480)，从而进行位点特异性连接。
在优选的实施例中，抗癌疫苗DNL构建体基于ii2b结构的变化，其中抗CD74抗体或F (ab ‘ ) 2或F (ab) 2抗体片段(如hLLl抗体或片段)的每个重链在其C-末端连接于AD 部分的一个拷贝。由于每个抗体或片段具有两个重链，因此每个抗体或片段具有两个AD部分。⑶20异种抗原连接于互补的DDD部分。DDD部分二聚化后，每个DOD 二聚体与连接于 IgG抗体的AD部分或连接于F(ab' )2或？(ab) 2片段的AD部分之一结合，从而得到每个IgG 或F(ab' )2或？(油)2单元中有四个CD20异种抗原的化学计量。然而，技术人员会意识到可使用替换的复合体，如将⑶20连接于AD序列，并将抗⑶74MAb或片段连接于DDD部分， 从而得到不同化学计量的效应子部分。例如，通过将DDD序列连接于IgG抗体或F(ab' )2 片段的每个重链的C-末端，并将AD序列连接于⑶20异种抗原，可构建包含一个⑶20分子和一个抗⑶74抗体或片段的DNL复合体。
通过在远离两个前体的官能团处连接DDD和AD，可预期这种位点特异性连接可保持两个前体的原始活性。此方法具有模块化的性质，并能潜在地用于位点特异性地和共价地连接多种物质。
如下文实例所示，在优选的实施例中，效应部分为蛋白质或肽，该效应部分可连接于DDD或AD单元以形成融合蛋白或肽。已知有多种方法可形成融合蛋白，包括核酸合成、 杂交和/或扩增，以产生编码目标融合蛋白的合成双链核酸。可将这种双链核酸插入表达载体中，用于通过标准的分子生物学技术产生融合蛋白(见例如Sambrook等，Molecular CloninR, A laboratory manual 第二版，Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)。在这种优选的实施例中，AD和/或DDD部分可连接于效应蛋白或肽的N-末端或 C-末端。然而，技术人员会意识到，AD或DDD部分与效应部分的连接位点可根据效应部分的化学性质和效应部分涉及其生理活性的部分而变化。例如，尽管AD或DDD部分可在保持抗原结合活性的同时连接于抗体或抗体片段的N-末端或C-末端，但与C-末端的连接使AD 或DDD部分的位置远离抗原结合位点，且似乎可能导致较强的结合相互作用(例如Chang 等，Clin Cancer Res 2007，13 :5586s_91s)。也可采用本领中已知的技术进行多种效应部分的位点特异性连接，例如采用二价交联试剂和/或其它化学缀合技术。
抗体和抗体片段 在各实施例中，抗体或抗体的抗原结合片段可结合到抗癌疫苗DNL复合体当中。 抗原结合抗体片段是本领域中已知的，如F(ab' )2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等，并且任何这种已知的片段均可使用。如本文所用，抗原结合抗体片段是指与由完整抗体或亲本抗体识别的相同抗原结合的抗体的任何片段。用于制备几乎任何的目标抗体或片段的AD 和/或DDD缀合物的技术是已知的(例如美国专利No. 7，527，787)。
可使用未与治疗剂缀合的抗体或其片段，其被称为“裸”抗体或其片段。在可供选择的实施例中，抗体或片段可与一种或多种治疗剂和/或诊断剂缀合。许多这种治疗剂和诊断剂是本领中已知的(如下文更为详细地讨论)，并且任何这种已知的治疗剂或诊断剂均可使用。
用于制备针对几乎任何靶抗原的单克隆抗体(例如CD74)的技术是本领域中已知的。见例如 Kohler 和 Milstein，Nature 256 :495(1975)；和 Coligan 等(编辑)CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY 第 1 卷第 2. 5. 1 至 2. 6. 7 页(John ffiley&Sons 1991)。简单而言，单克隆抗体可以通过下列步骤来获得向小鼠注射含有抗原的组合物，摘除脾脏以获得 B-淋巴细胞，将B-淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，克隆杂交瘤，选出对抗原产生抗体的阳性克隆，培养对抗原产生抗体的克隆，以及从杂交瘤培养物中分离抗体。
可以用多种完善的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化出MAb。这种分离技术包括使用蛋白A琼脂糖凝胶的亲和色谱、尺寸排阻色谱和离子交换色谱。见例如，Coligan 在 2. 7. 1-2. 7. 12 页和 2. 9. 1-2. 9. 3 页所述。也可见 Baines 等，“Purification of Immunoglobulin G(IgG) “，METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY 第 10 卷第 79 至 104 页(The Humana Press,Inc.1992)。
在起始形成免疫原的抗体之后，抗体可以进行测序并随后用重组技术来制备。鼠抗体和抗体片段的人化和嵌合是本领域的技术人员熟知的。使用源自人化、嵌合或人抗体的抗体组分避免了与鼠恒定区的免疫原性相关的潜在问题。
嵌合抗体 嵌合抗体是重组蛋白质，其中人抗体的可变区被例如包括小鼠抗体的互补决定区 (CDR)在内的小鼠抗体的可变区所取代。当施用给受试者时，嵌合抗体表现出免疫原性降低而稳定性增加。克隆鼠免疫球蛋白可变区的一般技术公开于例如Orlandi等的Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA 86 :3833(1989)中。构建嵌合抗体的技术是本领域的技术人员所熟知的。举例而言，Leung等，Hybridoma 13 :469(1994)描述了通过将编码鼠LL2 (抗CD22单克隆抗体)的Vk和Vh域的DNA序列与相应的人κ和IgGJi定区域结合来产生LL2嵌合体。
人化抗体 产生人化MAb的技术是本领域中所熟知的(见例如Jones等，Nature 321 522 (1986) ；Riechmann 等，Nature 332 323 (1988) ；Verhoeyen 等，Science 239 1534(1988) ；Carter 等，Proc. Nat ‘ 1 Acad. Sci. USA89 :4285(1992) ；Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12 :437(1992)以及 Singer 等，J. Immun. 150 :2844 (1993)) 可通过将小鼠 CDR 从重可变链和轻可变链转移到人抗体的相应可变域来人化嵌合或鼠单克隆抗体。嵌合单克隆抗体中的小鼠框架区(FR)也用人FR序列取代。因为简单地将小鼠⑶R转移至人FR中常常导致抗体亲和性的降低或者甚至是丧失，所以可能需要附加的修饰以恢复鼠抗体的原始亲和性。这可通过将FR区中的一个或多个人残基用其鼠对应物取代来完成，从而获得对其表位具有良好结合亲和性的抗体。见例如Tempest等，Biotechnology 9:266(1991)；和 Verhoeyen等，Science 239:1534(1988)。一般来讲，不同于其鼠对应物且位置接近一个或多个CDR氨基酸残基或与其接触的人FR氨基酸残基为取代的候选物。
人化LLl (hLLl)抗⑶74抗体公开于美国专利No. 7，312，318中，该专利的第35栏第1行至第42第27行以及图1至图4以引用的方式并入本文。
人抗体 采用组合方法或用人免疫球蛋白基因座转化的转基因动物来产生全人抗体的方法是本领域中已知的(例如 Mancini 等，2004，NewMicrobiol. 27 :315-28 ；Conrad 和 Scheller,2005, Comb. Chem. High Throughput Screen. 8 :117-26 ；Brekke 禾口 Loset,2003, Curr. Opin. Phamaco 1. 3 :544-50)。全人抗体也可以通过基因或染色体转染方法以及噬菌体展示技术来构建，所有这些技术在本领域中是已知的。见例如McCafferty等，Nature 348 552-553(1990)。预期这种全人抗体表现出比嵌合或人化抗体更少的副作用，并且在体内基本上起到内源性人抗体的作用。在某些实施例中，请求保护的方法和程序可利用通过这种技术产生的人抗体。
在一个可供选择的方案中，噬菌体展示技术可用于产生人抗体(例如， Dantas-Barbosa等，2005, Genet. Mol. Res. 4 :126-40)。人抗体可产生自正常人或产生自显示特定疾病状态(例如癌)的人(Dantas-Barbosa等，200幻。由患病个体构建人抗体的优势在于，循环抗体谱可偏向(biased towards)针对疾病相关抗原的抗体。
在此方法论的一个非限制性实例中，Dantas-Barbosa等^00 构建了来自骨肉瘤患者的人Fab抗体片段的噬菌体展示库。通常，总RNA得自循环血淋巴细胞(Id.)。重组Fab克隆自μ、γ和κ链抗体谱并插入噬菌体展示库(Id.)。使用针对重链和轻链免疫球蛋白序列的特异性引物将RNA转化为cDNA，并用于制造Fab cDNA库(Marks等，1991，J Mol. Biol. 222 :581-97)。按照 Andris-Widhopf 等(2000，In =Phage Display Laboratory Manual,Barbas ^ ()第 1 IK,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor，NY第9. 1至9. 22页)进行库构建。最终的Fab片段用限制性内切酶消化并插入到噬菌体基因组以制造噬菌体展示库。可通过本领域中已知的标准噬菌体展示方法筛选这种库(见例如 Pasqualini 禾口 Ruoslahti，1996，Nature 380 :364-366 ；Pasqualini, 1999，The Quart. J. Nuc 1. Med. 43 :159162)。
可以多种形式进行噬菌体展示，其综述见例如，Johnson和Chiswell，Current Opinion in Structural Biology 3 :5564-571 (1993)。人抗体也可由离体活化的 B 细胞来产生。见美国专利No. 5，567，610和No. 5，229，275，其全文以引用的方式并入本文。技术人员会意识到，这些技术仅为示例性的，可以利用制造与筛选人抗体或抗体片段的任何已知方法。
在另一个可供选择的方案中，采用标准的免疫方案，可以使用经基因工程改造产生人抗体的转基因动物来产生针对基本上任何免疫原性靶标的抗体。用于从转基因小鼠中获得人抗体的方法由下列学者进行了描述=Green等，Nature Genet. 7 :13(1994)，Lonberg 等，Nature368 :856(1994)；和 Taylor 等，Int. Immun. 6 :579 (1994)。这种系统的非限制性例子有得自 Abgenix (Fremont, CA)的 XenoMouse (例如 Green 等，1999, J. Immunol. Methods 231 :11-23)。在XenoMouse 和类似动物中，小鼠抗体基因已经被灭活并被功能性人抗体基因取代，而小鼠免疫系统的其余部分保持不变。
用种系配置的(germline-configured)YAC(酵母人工染色体)转化XenoMouse , 所述YAC含有人IgH和Igkappa基因座的若干部分，包括大多数可变区序列，以及附加基因和调节序列。人可变区库可用来生成产生抗体的B细胞，其可以通过已知的技术被处理成杂交瘤。用靶抗原免疫的XenoMouse 通过正常的免疫反应产生人抗体，可以通过上面讨论的标准技术进行收获和/或生产。可得到多种品系的XenoMouse ,每种品系均能产生不同类的抗体。转基因方法产生的人抗体经证明具有治疗潜力，同时保留正常人抗体的药代动力学性质(Green等，1999)。技术人员会意识到请求保护的组合物和方法不限于使用 XenoMouse⑩系统，而是可以利用已通过基因改造产生人抗体的任何转基因动物。
抗体片段 可以通过已知的技术来产生识别特异表位的抗体片段。抗体片段为抗体的抗原结合部分，如F(ab' )2、Fab'、F(ab)2、Fab、Fv、sFv等。F(ab' )2片段可通过胃蛋白酶消化抗体分子产生，而Fab'片段可通过还原F(ab' )2片段的二硫桥产生。作为另外的选择， 可构建Fab'表达库(Huse等，1989，Science, 246 :1274-1281)，以使得能快速和容易地鉴定具有所需特异性的单克隆Fab'片段。F(ab)2片段可通过木瓜蛋白酶消化由二硫还原得到的抗体和Fab片段来产生。
单链Fv分子(scFv)包含VL域和VH域。VL域和VH域联合形成靶结合位点。 这两个域进一步通过肽连接体(L)共价连接。用于制造scFv分子和设计合适的肽连接体的方法在下列文献中进行了描述美国专利No. 4，704，692 ；美国专利No. 4，946，778 ； R. Raag 和 M. Whitlow，〃 Single Chain Fvs. “ FASEB Vol 9:73-80(1995)；以及 R. Ε. Bird 和 B. W. Walker, “ Single Chain Antibody Variable Regions “，TIBTECH, Vol9 132-137(1991)。
用于产生单域抗体的技术是本领中已知的，例如由Cossins等Q006， Express Purif 51 :253-259)所公开。单域抗体(VHH)可通过标准免疫技术从骆驼、羊马它或大羊轮中获得(见例如 Muyldermans 等，TIBS 26 :230-235,2001 ；Yau 等，J Immunol Methods 281 161-75，2003 ；Maass 等，J Immunol Methods 324 13-25，2007)。VHH 可具有有效的抗原结合能力并可与常规VH-VL对接触不到的新表位相互作用(Muyldermans等， 2001)。羊驼血清IgG含约50%的只有骆驼科重链的IgG抗体(HCAb) (Maass等，2007)。羊驼可用已知的抗原免疫(如TNF- α )，并且可将结合并中和靶抗原的VHH分离(Maass等， 2007)。已鉴定出扩增几乎所有羊驼VHH编码序列的PCR引物，并且这些引物可用于构建羊驼VHH噬菌体展示库，其可用于通过本领域中熟知的标准生物淘选技术来进行抗体片段分离(Maass 等，2007)。
可通过全长抗体的蛋白水解或通过在大肠杆菌(E. coli)或其它宿主中表达编码该片段的DNA来制备抗体片段。可以按常规方法通过全长抗体的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化来获得抗体片段。这些方法由例如Goldenberg，美国专利No. 4，036, 945和No. 4，331，647 以及其中所包含的文献所描述。此外，见Nisonoff等，Arch Biochem. Biophys. 89 230(1960) ；Porter, Biochem. J. 73 :119(1959) ；EdeIman 等，METHODS IN ENZYM0L0GY 第 1 卷第 422 页(Academic Pressl967)；和 Coligan, 2. 8. 1-2. 8. 10 页和 2. 10. -2. 10. 4 页。
已知的抗体 在某些实施例中，除CD74外，可以把针对其它抗原靶标的抗体结合到抗癌疫苗 DNL复合体当中。针对肿瘤相关抗原的多种抗体是已知的，并且可通过商业渠道获得。例如，许多分泌抗体的杂交瘤细胞系得自美国模式培养物保藏所(ATCC，Manassas, VA)。见例如美国专利号7‘，312，318 ；7，282，567 ；7，151，164；7，074，403 ；:7，060，802 ；1‘’ 056，5097;,049,,060 -J,,,045,,132 ；7,,041;,803 ；7,,041，802 ；7，041,,293 ；7,,038，018 ；7，037，4987,,012，133 ；7,,001，598 ；6，998，468 ；6，994，976 ；6，994，852 ；6，989，241 ；6，974，8636，965，018 ；6，964，854 ；6，962，981 ；6，962:,813 ；6，956，107 ；6，951，924 ；6，949，2446，946，129 ；6，943，020 ；6，939，547 ；6，921;,645 ；6，921，645 ；6，921，533 ；6，919，4336，919，078 ；6，916，475 ；6，905，681 ；6，899;,879 ；6，893，625 ；6，887，468 ；6，887，4666，884，594 ；6，881，405 ；6，878，812 ；6，875，580 ；6，872，568 ；6，867，006 ；6，864，0626，861，511 ；6，861，227 ；6，861，226 ；6，838，282 ；6，835，549 ；6，835，370 ；6，824，7806824778；6812，206 ；6793924 ；6，783，758 ；6，770，450 ；6，767，7116，764，6886，764681；6764679 ；6，743，898 ；6，733，981 ；6，730，307 ；6，720，156，716，9666，709653；6,693，176 ；6，692，908 ；6，689，607 ；6，689，362 ；6，689，3556，682，7376，682，736；6,682，734 ；6，673，344 ；6，653，104 ；6，652，852 ；6，635，4826，630，1446，610，833；6,610，294 ；6，605，441 ；6，605，279 ；6，596，852 ；6，605，2796，596，8526，592，868；6,576，745 ；6，572，856 ；6，566，076 ；6，562，618 ；6，545，1306，544，7496，534058；6528，625 ；6，528269 ；6，521，227 ；6，518，404 ；6，511，6656，491，9156，488，930；6,482，598 ；6，482，408 ；6，479，247 ；6，468，531 ；6，468，529 ；6465，1736，461823；6,458，356 ；6，455，044 ；6，455，040 ；6，451，310 ；6，444，2066，441，1436，432，404；6,432，402 ；6，419，928 ；6，413，726 ；6，406，694 ；6，403，7706，403，0916，395，276；6,395，274 ；6，387，350 ；6，383，759 ；6，383，484 ；6，376，6546，372，2156，359，126；6355，481 ；6355444 ；6,355，245 ；6，355，244 ；6，346，2466，344，1986，340571；6340，459 ；6，331175 ；6,306，393 ；6，254，868 ；6，187，2876，183，7446，129914；6,120，767 ；6，096，289 ；6，077，499 ；5，922，302 ；5，874，5405，814，4405，798，229；5,789，554 ；5，776，456 ；5，736，119 ；5，716，595 ；5，677，1365，587，4595，443，953 ；5，525, 338。
这些抗体仅为示例性的，许多其它抗体及其杂交賴I是本领域中已知的。技术人员
会意识到，可通过在ATCC、NCBI和/或USPTO数据库中简单检索针对选定的疾病相关目标靶的抗体来获得针对几乎任何肿瘤相关抗原的抗体序列或分泌抗体的杂交瘤。可采用本领域中熟知的标准技术，将克隆抗体的抗原结合域扩增、切下、连接到表达载体、转染到已适应的宿主细胞中以及用于蛋白生产。
氨基酸取代 在某些实施例中，本发明所公开的方法和组合物可涉及生产和使用具有一个或多个取代氨基酸残基的蛋白质或肽。例如，如以下工作实例所讨论，可以改变AD和/或DDD 部分的序列以改善DNL复合体的形成和/或其体内稳定性。在其它实施例中，可通过取代一个或多个氨基酸残基来优化天然、嵌合、人化或人抗体的结构特性、物理特性和/或治疗特性。例如，本领域中熟知的是，可通过用亲本鼠抗体的相应FR氨基酸取代有限数目的人框架区(FR)氨基酸来改善人化抗体的功能特性。当框架区氨基酸残基近接CDR残基时尤其如此。
在其它情况下，可通过有限数目的氨基酸取代来优化抗体的治疗特性，如对靶抗原的结合亲和性、抗体从其靶抗原中的解离或脱离的速率或甚至抗体诱导CDC(补体依赖性细胞毒性)或ADCC (抗体依赖性细胞的细胞毒性)的有效性。
技术人员会意识到，一般而言，氨基酸取代通常涉及将氨基酸用另一种具有相对类似性质的氨基酸取代(保守氨基酸取代)。各种氨基酸的特性和氨基酸取代对蛋白质结构和功能的影响已成为本领域中广泛研究和已知的课题。
例如，可考虑氨基酸的疏水性指数(hydropathicindex) (Kyte&Doolittle，1982， J. Mol. Biol. ,157 :105-132)。氨基酸的相对疏水特性有助于所得蛋白质的二级结构，后者又限定蛋白质与其它分子的相互作用。对每种氨基酸根据其疏水性和电荷性质指定了一个疏水性指数(Kyte&D00little，1982)，即异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3. 8)；苯丙氨酸(+2. 8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2. 5)；蛋氨酸(+1. 9)；丙氨酸(+1. 8)；甘氨酸("0. 4)；苏氨酸(0. 7)；丝氨酸(-0. 8)；色氨酸(-0. 9)；酪氨酸(-1. 3)；脯氨酸(-1. 6)； 组氨酸("3. 2)；谷氨酸盐(-3. 5)；谷氨酰胺(-3. 5)；天冬氨酸盐(-3. 5)；天冬酰胺(-3. 5)； 赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(_4.幻。在进行保守取代时，优选使用疏水性指数在士2范围内的氨基酸，更优选使用疏水性指数在士 1范围内的氨基酸，甚至更优选疏水性指数在士 0. 5 范围内的氨基酸。
氨基酸取代还要考虑氨基酸残基的亲水性(例如U. S. Pat. No. 4，554，101)。已对氨基酸残基指定了亲水性值精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸盐(+3.0)；谷氨酸盐(+3.0)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸("0. 4)；脯氨酸(-0. 5. +-· 1)；丙氨酸(-0. 5)；组氨酸(-0. 5)；半胱氨酸(-1. 0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸 (-2. 5)；色氨酸(-3.4)。用其它具有类似亲水性的物质进行氨基酸的取代是优选的。
其它考虑因素包括氨基酸侧链的大小。例如，用具有较大侧链的氨基酸(如色氨酸或酪氨酸)取代具有紧凑侧链的氨基酸(如甘氨酸或丝氨酸)通常不是优选的。还考虑各种氨基酸残基对蛋白质二级结构的影响。通过实证研究，不同氨基酸残基对蛋白质结构域采取α -螺旋、β -折叠或翻转二级结构的倾向性的影响已经确定，并且是本领域中已知的(见例如 Chou&Fasman，1974，Biochemistry, 13 :222-245 ； 1978，Ann. Rev. Biochem. ,47 251-276 ； 1979，Biophys. J. ,26 :367-384)。
基于这种考虑因素和大量的实证研究已建立了保守氨基酸取代表，这些表在本领域中是已知的。例如，精氨酸和赖氨酸；谷氨酸盐和天冬氨酸盐；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。作为另外的选择，可为Ala(A)Ieu, ile, val ；Arg(R) gin，asn，Iys ；Asn(N) his, asp，lys，arg，gin ；Asp (D)asn, glu ；Cys(C)ala, ser ；GIn (Q)glu, asn ；GIu(E) gin，asp ；GIy(G)ala ；His(H)asn, gin，lys, arg ；He (I)val, met，ala, phe，leu ；Leu (L) val, met，ala, phe，ile ；Lys (K) gin，asn, arg ；Met (M)phe，ile, leu ；Phe (F) leu, val, ile, ala, tyr ；Pro (P) ala ；Ser (S)，thr ；Thr (T) ser ；Trp (W)phe, tyr ； Tyr (Y) top，phe, thr, ser ；Val (V) ile, leu, met，phe, ala。
氨基酸取代的其它考虑因素包括残基是否位于蛋白内部或暴露在溶剂中。就内部残基而言，保守取代包括Asp和Asn ；Ser和Thr ；Ser和Ala ；Thr和Ala ；Ala和GIy ；He 禾口 Val ；Val 禾口 Leu ；Leu 禾口 Ile ；Leu 禾口 Met ；Phe 禾口 Tyr ；Tyr 禾口 Trp (见例如，PROWL 网立占 rockefeller, edu)。就溶剂暴露的残基而言，保守取代包括Asp和Asn ；Asp和Glu ；Glu和 GIn ；Glu 禾口 Ala ；GIy 禾口 Asn ；Ala 禾口 Pro ；Ala 禾口 GIy ；Ala 禾口 Ser ；Ala 禾口 Lys ；Ser 禾口 Thr ；Lys 和 Arg ；Val 和 Leu ；Leu 和 Ile ；Ile 和 Val ；Phe 和 Tyr (见例如 PROffL 网站:rockefeller. edu)。已构建各种矩阵来辅助氨基酸取代的选择，如PAM250计分矩阵、Dayhoff矩阵、 Grantham 矩阵、McLachlan 矩阵、Doolittle 矩阵、Henikoff 矩阵、Miyata 矩阵、Fitch 矩阵、 Jones 矩阵、Rao 矩阵、Levin 矩阵和 Risler 矩阵(见例如 PROWL 网站rockefeller. edu)。
在确定氨基酸取代时，还要考虑分子间键或分子内键的存在，例如带正电的残基 (例如HiS、Arg、LyS)与带负电的残基(例如Asp、Glu)之间形成的离子键(盐桥)或附近的半胱氨酸残基之间形成的二硫键。
对技术人员而言，在编码的蛋白质序列中将氨基酸取代为任何其它氨基酸的方法是熟知的，仅需要进行常规的实验，例如通过定点诱变技术或通过合成和组装编码氨基酸取代物的寡核苷酸并将其拼接到表达载体构建体当中(例如Sambrook等，Molecular CloninR, A laboratory manual 第二版，Cold Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)。
治疗剂 在某些实施例中，治疗剂(如细胞毒素剂、抗血管生成剂、促凋亡剂、抗生素、激素、激素拮抗剂、趋化因子、药物、前体药物、毒素、酶或其它试剂)可以用作本文所述抗癌疫苗DNL复合体的辅助治疗。有用的药物可以具有选自以下的药物特性抗有丝分裂、抗激酶、烷基化、抗代谢、抗生、生物碱、抗血管生成、促凋亡剂及其组合。
有用的示例药物可包括5-氟尿嘧啶、阿普立啶(aplidin)、阿扎立平、阿纳托唑、蒽环霉素、苯达莫司汀、博莱霉素、硼替佐米、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、 喜树碱、卡钼、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、西乐葆、瘤可宁、顺钼(CDDP)、Cox-2抑制剂、依立替康(CPT-Il)、SN-38、卡钼、克拉屈滨、喜树碱(camptothecans)、环磷酰胺、阿糖胞苷、氮烯唑胺、多西他奇、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、2-吡咯啉并阿霉素(2-pyrrolinodoxorubicine) (2P-D0X)、氰基吗啉代阿霉素(cyano-morpholino doxorubicin)、葡糖苷酸阿霉素(doxorubicin glucuronide)、葡糖苷酸表柔比星 (epirubicin glucuronide)、雌氮芥、表叶毒素(印idophyllotoxin)、雌激素受体结合剂、 依托泊苷(VP16)、葡糖苷酸依托泊苷(etoposide glucuronide)、磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)、氟尿苷(FUdR)、3'，5' _0_ 二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他米特、法尼基蛋白转移酶抑制剂、吉西他滨、羟基脲、去甲氧正定霉素、异环磷酰胺、L-天冬酰胺酶、来那度胺(Ienolidamide)、亚叶酸、环己亚硝脲、二氯甲基二乙胺、美法仑、巯嘌呤、 6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、米拉霉素、丝裂霉素、米托坦、诺维本、亚硝基脲、普卡霉素、丙卡巴胼、紫杉醇、喷司他丁、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、链佐星、它莫西芬、紫杉酚、 替莫唑胺(temazolomide) (DTIC的含水形式)、反钼、萨立多胺、硫鸟嘌呤、噻替派、替尼泊苷、托泊替康、尿嘧啶氮芥、长春瑞滨、长春花碱、长春新碱和长春花生物碱。
有用的毒素可以包括篦麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA 酶)如豹蛙酶、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素Α、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。
在某些实施例中，治疗剂可以是免疫调节剂。免疫调节剂是存在时会改变、抑制或刺激身体免疫系统的试剂。有用的免疫调节剂可以包括细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、成血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、促红细胞生成素、促血小板生成素及其组合。特别有用的是诸如肿瘤坏死因子(TNF)的淋巴毒素、诸如白介素(IL)的成血因子、 诸如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的集落刺激因子、诸如干扰素-α、干扰素-β或干扰素-Y的干扰素以及诸如称为“Si因子”的干细胞生长因子。
在各实施例中，治疗剂可以包括一种或多种细胞因子，如淋巴因子、单核因子、生长因子和传统多肽激素。包括在细胞因子中的有生长激素，如人生长激素、N-蛋氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原； 糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体化激素(LH)；胎盘生长因子(PlGF)；肝细胞生长因子；前列腺素；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘泌乳素；OB蛋白；肿瘤坏死因子_α和肿瘤坏死因子；缪勒氏管抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽； 抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；促血小板生成素(TPO)；神经生长因子， 如NGF-β ；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β ；胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II ；促红细胞生成素(EPO)；骨生成诱导因子；干扰素，如干扰素-α、干扰素-β和干扰素-Y ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF (M-CSF)；白介素 (IL，例如 IL-U IL-I a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25 ；LIF ；kit-配基或 FLT-3 ； 厄洛替尼；血小板反应蛋白；内皮他丁 ；肿瘤坏死因子(TNFJn TNF-a )和LT。有用的趋化因子可以包括 RANTES、MCAF、MIPl-a、MIPl-β 和 IP-IO0 抗血管生成剂包括厄洛替尼、baculostatin、血管能抑制素、乳腺丝抑蛋白、抗 VEGF抗体、抗PlGF肽和抗体、抗血管生长因子抗体、抗Flk-I抗体、抗Flt-I抗体和肽、抗 Kras抗体、抗cMET抗体、抗MIF(巨噬细胞移动抑制因子)抗体、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素-12、IP-10、Gro-β、 血小板反应蛋白、2-甲氧基雌甾二醇、多育曲菌素相关蛋白、羧胺三唑、CM101、马马司他、戊糖多硫酸盐、血管生成素-2、干扰素-α、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、利诺胺 (罗喹美克)、萨立多胺、己酮可可碱、染料木黄酮、TNP-470、内皮他丁、紫杉醇、accutin、厄洛替尼、西多福韦、长春新碱、博莱霉素、AGM-1470、血小板因子4或米诺环素会是有用的。
其它有用的治疗剂可以包括寡核苷酸，特别是优选针对致癌基因和致癌基因产物的反义寡核苷酸，如bcl-2或p53。治疗性寡核苷酸的优选形式是siRNA。
诊断剂 诊断剂可选自放射性核素、放射造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记物、化学发光标记物、超声造影剂和光敏剂。这种诊断剂是公知的，并且可以使用任何这种已知的诊断剂。 诊断剂的非限制性例子可以包括放射性核素，如licIrKmIrKmLiul8Fj2Fh62Ciu64Ciu67Ciu
67n 68n 86v 90w 89v 94mT 94T 99mT 120T 123T 124T 125T 131T 154—158广 j 32n Il^ 13λτ 15n 186n
Ga> Ga> Y、 Y、 Lx、 1c、 1c、 1c、丄、丄、丄、丄、 丄、 Gd、 P、 C、 N、 0、 Re、
188Re、51Mn、52mMn、55C0、72AS、75Br、76Br、82mRb、83Sr 或其它 Y _、β -或正电子-发射体。有用的顺磁离子可以包括铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、 钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)或铒(III)。金属造影剂可以包括镧(III)、金(III)、铅(II)或铋(III)。超声造影剂可以包括脂质体，如充气脂质体。不透射线诊断剂可为选自钡化合物、镓化合物和铊化合物的化合物。各种荧光标记物是本领域中已知的，包括但不限于异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。有用的化学发光标记物可以包括鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶酯、 咪唑、吖啶盐或草酸酯。
免疫缀合物 在某些实施例中，抗癌疫苗DNL构建体可以与一种或多种治疗或诊断剂缀合。治疗剂不需要相同，可以是不同的，例如药物和放射性同位素。例如，131I可结合到抗体或融合蛋白的酪氨酸当中，而药物连接于赖氨酸残基的ε-氨基。治疗和诊断剂还可以连接于例如还原的SH基和/或连接于碳水化合物侧链。许多用抗体或融合蛋白制造治疗或诊断剂的共价或非共价缀合物的方法是本领域中已知的，并且可以利用任何这种已知的方法。
治疗或诊断剂可经由二硫键的形成而连接在还原抗体组分的铰链区。作为另外的选择，这种试剂可使用异型双官能交联剂(如N-琥珀酰基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯 (SPDP))来连接。Yu等，Int. J. Cancer 56:244(1994)。这种缀合的通用技术是本领域中已知的。例如，参见 Wong，CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING(CRC Press 1991) ；Upeslacis 等，"Modification of Antibodies by Chemical Methods，，， MONOCLONAL ANTIBODIES PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch 等(编辑)，187-230 页 (ffiley-Liss, Inc.1995) ；Price, " Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies, “ MONOCLONAL ANTIBODIES PRODUCTION， ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter 等(编辑)，60-84 页(Cambridge University Press 1995)。作为另外的选择，治疗或诊断剂可以经由抗体的Fc区中的碳水化合物部分缀合。碳水化合物基团可用于增加与硫醇基结合的相同试剂的负载，或者碳水化合物部分可用于结合不同的治疗或诊断剂。
通过抗体碳水化合物部分将肽与抗体组分缀合的方法是本领域技术人员熟知的。例如，参见，Shih 等，Int. J. Cancer 41 :832(1988) ；Shih 等，Int. J. Cancer 46 1101(1990)；和Siih等，美国专利No. 5，057，313，它们全文以引用的方式并入本文。一般方法涉及使具有氧化的碳水化合物部分的抗体组分与具有至少一个游离胺官能团的载体聚合物反应。这一反应产生初始的席夫碱(亚胺)键，其可以通过还原到仲胺而稳定化，从而形成最终缀合物。
如果用作免疫缀合物的抗体组分的抗体是抗体片段，则可以没有Fc区。然而，有可能将碳水化合物部分引入到全长抗体或抗体片段的轻链可变区。例如，参见，Leimg等，I Immunol. 154 :5919 (1995) ；Hansen 等，美国专利 No. 5，443，953 (1995) ；Leung 等，美国专利 No. 6，254，868，它们全文以引用的方式并入本文。改造的碳水化合物部分用于连接治疗或诊断剂。
在一些实施例中，可以将螯合剂连接于抗体、抗体片段或融合蛋白，并用于螯合治疗或诊断剂(如放射性核素)。示例性螯合剂包括但不限于DTPA (如Mx-DTPA)、D0TA、TETA、 NETA或Ν0ΤΑ。缀合以及使用螯合剂将金属或其它配体连接于蛋白质的方法是本领域中熟知的(参见例如，美国专利申请No. 12/112，观9，其全文以引用的方式并入本文)。
在某些实施例中，放射性金属或顺磁离子可以通过与具有长尾的试剂反应而连接于蛋白质或肽，所述的长尾可连接用于结合离子的诸多螯合基团。这样的尾可以是聚合物(如聚赖氨酸)、多糖或具有可结合螯合基团(例如已知可用于此目的的乙二胺四乙酸 (EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、聚胺、冠醚、双缩氨基硫脲、聚肟等)的侧基的其它衍生化或可衍生化的链。
螯合物可以直接连接于抗体或肽，例如，如美国专利4，拟4，659中所公开的，其公开内容以引用的方式并入本文。特别有用的金属-螯合物组合包括2-苄基-DTPA及其单甲基和环己基类似物，其与一般能量范围在60至4，OOOkeV的诊断同位素(如1251、1311、1231、 124I、62CU、64CU、18F、mIn、67Ga、raGa、99mTCJ4mTc^d15OjeBr) 一起用于放射成像。当与非放射性金属(如锰、铁和钆)络合时，相同的螯合物可用于MRI。大环螯合物(如N0TA、D0TA 和TETA)可与多种金属和射电金属一起使用，特别是分别与放射性核素镓、钇和铜一起使用。这种金属-螯合络合物可以通过使环的大小适应于所关注的金属而变得非常稳定。可用于稳定结合核素(如对于RAIT的223Ra)的其它环形螯合物(如大环聚醚)包括在内。
最近，已公开了可用于PET扫描技术的18F标记方法，例如通过使F-18与金属或其它原子(如铝)反应。18F-Al缀合物可以与直接连接于抗体或用于在预靶向方法中标记可靶向构建体的螯合基团(如D0TA、N0TA或NETA)络合。这种F-18标记技术公开在2008年 4月30日提交的美国专利申请No. 12/112，289中，其全文以引用的方式并入本文。
治疗处理的方法 各种实施例涉及治疗受试者(如哺乳动物，包括人、驯养动物或宠物，如狗和猫)) 的癌症(如，多发性骨髓瘤)的方法。该方法可包括对受试者施用有效量的抗癌疫苗DNL 构建体。在优选实施例中，抗癌疫苗DNL构建体包含抗-CD74抗体或其片段和CD20异种抗原，如在下面实例中进一步的详述。
可以通过同时或顺序地施用有效量的另一种抗体来补充抗癌疫苗DNL构建体的施用，所述另一种抗体与靶细胞表面上的另一种抗原结合或与之反应。优选的附加 MAb包括至少一种人化、嵌合或人MAb，其选自可与⑶209 (DC-SIGN)、⑶34、⑶74、⑶205、 TLR2 (铎样受体 2)、TLR 4、TLR 7、TLR 9、BDCA-2、BDCA-3、BDCA-4 禾口 HLADR 反应的 MAb0 各种有用的抗体是本领域技术人员已知的，如上面所讨论。例如，参见，(ihetie等，Cancer Res. 48 :2610 (1988) ；Hekman 等，Cancer Immunol. Immunother. 32 :364(1991) ；Longo, Curr. Opin. Oncol. 8 :353 (1996)；美国专利 No. 5，798，554 ；No. 6，187，287 ；No. 6，306，393 ； No. 6，676，924 ；No. 7，109，304 ；No. 7，151，164 ；No. 7，230，084 ；No. 7，230，085 ； No. 7，238，785 ；No. 7，238，786 ；No. 7，282，567 ；No. 7，300，655 ；No. 7，312，318 和美国专利申请公开 No. 20080131363 ；No. 20080089838 ；No. 20070172920 ；No.20060193865 ； No. 20060210475 ；No. 20080138333和20080146784，各引用专利或申请的实例部分以引用的方式并入本文。
在可供选择的实施例中，针对另一树突状细胞抗原的抗体或其片段(如， CD209 (DC-SIGN)、CD34、CD205、TLR 2 (铎样受体 2)、TLR 4、TLR 7、TLR 9、BDCA-2、BDCA-3、 BDCA-4或HLA-DR)可替换DNL复合体中的抗⑶74抗体。这种抗体可得自像美国模式培养物保藏所之类的公共来源或得自商业抗体供应商。例如，针对CD209 (DC-SIGN)、CD34、 BDCA-2、TLR2、TLR 4、TLR 7 禾口 TLR 9 的抗体可以购自 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz，CA)。针对 CD205 和 BDCA-3 的抗体可以购自 Miltenyi Biotec Inc. (Auburn, CA)。抗体的众多其它商业来源是本领域技术人员已知的。
可以通过同时或顺序地施用至少一种治疗剂来进一步补充抗癌疫苗DNL构建体治疗。用于治疗多发性骨髓瘤的治疗剂包括地塞米松、萨立多胺/地塞米松、环磷酰胺、 VAD (长春新碱、阿霉素和地塞米松)、DVd(D0XIL (聚乙二醇化阿霉素)、长春新碱和还原的schedule地塞米松)、BCNU、美法仑、卡莫司汀、硼替佐米(VELCADE )、泼尼松和皮质类固醇。单个治疗剂可单独使用，或以本领域中已知的各种组合的方式使用，如CP(环磷酰胺、泼尼松)、CT(环磷酰胺、萨立多胺)、VBMCP(长春新碱、BCNU、美法仑、环磷酰胺、 美法仑)、VMCP (长春新碱、美法仑、环磷酰胺、泼尼松)、DT-PACE (地塞米松、萨立多胺、顺钼、阿霉素、环磷酰胺、依托泊苷)、MPT(美法仑、泼尼松、萨立多胺)、CVAD(环磷酰胺和 VAD)、EDAP(依托泊苷、地塞米松、阿糖胞苷、顺钼)、MTD(美法仑、萨立多胺、地塞米松)、 VT (VELCADE 、萨立多胺)、VDT (VELCADE 、阿霉素、萨立多胺)、VADT (VELCADE 、阿霉素、 萨立多胺、地塞米松)或DCEP (地塞米松、环磷酰胺、依托泊苷、顺钼)。
在干细胞移植之前进行的多发性骨髓瘤的化学治疗被称为诱导治疗。本文列出的某些化学治疗剂比其它更适于诱导治疗。可用于MM诱导治疗的化学治疗剂的例子包括地塞米松、萨立多胺/地塞米松、环磷酰胺、VAD和DVd。因为MM常常对化学治疗具有抗性，治疗剂的施用可以按比常规化学治疗更高的剂量进行。这种高剂量化学治疗通常产生骨髓毒性，常与干细胞移植结合使用。MM化学治疗的剂量和时程是本领域中公知的，可以结合抗癌疫苗DNL构建体的施用采取任何这种已知的剂量和/或时程。
在DNL疫苗用于匪以外的其它类型癌症的情况下，其它化学治疗方案是已知的。 例如，“CVB” (1. 5g/m2环磷酰胺、200-400mg/m2依托泊苷和150-200mg/m2卡莫司汀)是用于治疗非何杰金氏淋巴瘤的方案。Patti等，Eur. J.Haematol. 51 :18(1993)。其它合适的组合化学治疗方案是本领域技术人员熟知的。参见例如Freedman等，“Non-Hodgkin' s Lymphomas, “ CANCER MEDICINE, VOLUME 2，3rdEdition，Holland 等(编辑)，2028-2068 页 (Lea&Febiger 1993)。作为例示，治疗中度非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的第一代化学治疗方案包括C-MOPP (环磷酰胺、长春新碱、丙卡巴胼和泼尼松)和CHOP (环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松)。有用的第二代化学治疗方案是m-BAC0D(甲氨蝶呤、博莱霉素、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松和亚叶酸)，而合适的第三代方案是MACOP-B(甲氨蝶呤、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、泼尼松、博莱霉素和亚叶酸)。针对其它类型癌症可用的化学治疗剂包括但不限于5-氟尿嘧啶、阿普立啶、阿扎立平、阿纳托唑、蒽环霉素、苯达莫司汀、博莱霉素、硼替佐米、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、卡钼、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、 西乐葆、瘤可宁、顺钼、Cox-2抑制剂、依立替康(CPT-Il)、SN-38、卡钼、克拉屈滨、喜树碱、 环磷酰胺、阿糖胞苷、氮烯唑胺、多西他奇、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、2-吡咯啉并阿霉素(2P-D0X)、氰基吗啉代阿霉素、葡糖苷酸阿霉素、葡糖苷酸表柔比星、雌氮芥、表叶毒素、 雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP 16)、葡糖苷酸依托泊苷、磷酸依托泊苷、氟尿苷(FUdR)、 3'，5' -0-二油酰基-FudR(FUdR-d0)、氟达拉滨、氟他米特、法尼基蛋白转移酶抑制剂、吉西他滨、羟基脲、去甲氧正定霉素、异环磷酰胺、L-天冬酰胺酶、来那度胺、亚叶酸、环己亚硝脲、二氯甲基二乙胺、美法仑、巯嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、米拉霉素、丝裂霉素、米托坦、诺维本、亚硝基脲、丁酸苯酯、普卡霉素、丙卡巴胼、紫杉醇、喷司他丁、PSI-341、 雷洛昔芬、司莫司汀、链佐星、它莫西芬、紫杉酚、替莫唑胺(DTIC的含水形式)、反钼、萨立多胺、硫鸟嘌呤、噻替派、替尼泊苷、托泊替康、尿嘧啶氮芥、长春瑞滨、长春花碱、长春新碱和长春花生物碱。
配方 可以根据已知制备药用组合物的方法来配制抗癌疫苗DNL构建体，由此使抗癌疫苗DNL构建体在混合物中与药用辅料结合。消毒磷酸盐缓冲盐水是药用辅料的一个例子。其它合适的辅料是本领域中公知的。参见例如Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,5th Edition(Lea&Febiger 1990)和 Gennaro(编辑)REMINGTON' S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition (Mack Publishing Company 1990)及其修订版本。
抗癌疫苗可以配制成用以通过例如团注或连续输注来进行静脉内施用。可以按单位剂型提供用于注射的制剂，例如在安瓶或多剂量容器中并添加防腐剂。组合物所采取的形式可以为例如在油或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液，并且可以含有配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。作为另外的选择，在使用前，活性成分可以为与合适的载体(例如消毒无热原水)配合的粉末形式。
可以采用另外的制药方法来控制抗癌疫苗的作用持续时间。可以通过使用聚合物来复合或吸附抗癌疫苗DNL构建体来制备缓释制剂。例如，生物相容性聚合物包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物基质和硬脂酸二聚体与癸二酸的聚酸酐共聚物基质。Sherwood 等，Bio/Technology 10:1446(1992)。从这种基质中释放的速率取决于抗癌疫苗DNL构建体的分子量、基质内的抗癌疫苗量以及分散粒子的尺寸。Saltzman等，Biophys. 1 55: 163(1989) ；Sherwood 等，上文· Other solid dosage forms are described in Ansel 等， PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,5th Edition(Lea&Febiger 1990)和 Gennaro (编辑)，REMINGTON' S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition (Mack Publishing Company 1990)及其修订版本。
也可以对哺乳动物皮下或甚至通过其它非肠道途径施用抗癌疫苗DNL构建体。此外，施用可以通过连续输注或通过单次或多次团注进行。优选地，通过皮下注射方式以单次或多次团注施用抗癌疫苗。
一般来讲，对人施用的抗癌疫苗DNL构建体的剂量随诸如患者年龄、体重、身高、 性别、一般体格状况和既往病史之类的因素而不同。可取的是为接受者提供的抗癌疫苗DNL 构建体的剂量范围是单次施用为lmg/kg至25mg/kg，但视情况而定，也可以施用较低或较高的剂量。例如，对于70kg患者来说，l-20mg/kg的剂量是70-1，400mg,或者对于1. 7m患者来说，为41-82%ig/m2。为诱导免疫反应，根据需要可以重复该剂量。
在优选实施例中，疫苗DNL构建体可用于癌症的治疗。癌症的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、成胶质细胞瘤、黑色素瘤、肉瘤和白血病、骨髓瘤或淋巴恶性肿瘤。此类癌症的更具体的例子如下所述，包括鳞状细胞癌(如，上皮鳞状细胞癌)、尤因肉瘤、维尔姆斯瘤、星形细胞瘤、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、 肝细胞瘤、肝细胞癌、神经内分泌瘤、甲状腺髓质癌、分化型甲状腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。术语“癌症”包括原发恶性细胞或肿瘤(例如，其细胞尚未迁移到受试者体内初始恶性肿瘤或肿瘤部位以外的部位的那些)和次发性恶性细胞或肿瘤(例如，由转移-恶性细胞或肿瘤细胞迁移到不同于初始肿瘤部位的次发部位-引起的那些)。
癌症或恶性肿瘤的其它例子包括但不限于急性儿童成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、成人 (原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成人急性骨髓性白血病、成人何杰金氏淋巴瘤、成人淋巴细胞性白血病、成人非何杰金氏淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、艾滋病相关淋巴瘤、艾滋病相关恶性肿瘤、肛门癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、肾盂输尿管癌、中枢神经系统(原发性) 淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星状细胞瘤、宫颈癌、儿童(原发性) 肝细胞癌、儿童(原发性)肝癌、儿童急性成淋巴细胞白血病、儿童急性骨髓性白血病、儿童脑干胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星状细胞瘤、儿童颅外生殖细胞肿瘤、儿童何杰金氏病、儿童何杰金氏淋巴瘤、儿童小丘脑及视通路胶质瘤、儿童成淋巴细胞白血病、儿童成神经管细胞瘤、儿童非何杰金氏淋巴瘤、儿童松果体及幕上原始神经外胚层肿瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视通路及下丘脑胶质瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠癌、皮肤T淋巴细胞瘤、内分泌胰岛细胞癌、内分泌癌、子宫内膜癌、室鼓膜瘤、上皮癌、食管癌、尤因肉瘤及相关肿瘤、外分泌胰腺癌、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌、女性乳腺癌、高歇氏病、胆囊癌、胃癌、胃肠类肿瘤、胃肠肿瘤、生殖细胞肿瘤、妊娠性滋养层细胞瘤、毛细胞性白血病、头颈癌、 肝细胞癌、何杰金氏淋巴瘤、高丙种球蛋白血症、咽下癌、肠癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞胰腺癌、卡波济氏肉瘤、肾癌、喉癌、唇及口腔癌、、肝癌、肺癌、淋巴增生性障碍、巨球蛋白血症、男性乳腺癌、恶性间皮瘤、恶性胸腺瘤、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤、转移性不明原发性颈部鳞状细胞癌、转移性原发颈部鳞状细胞癌、转移性颈部鳞状细胞癌、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞赘生物、骨髓增生异常综合征、粒细胞性白血病、骨髓性白血病、骨髓增生障碍、鼻腔及鼻旁窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非何杰金氏淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、不明原发转移性颈部鳞状细胞癌、口咽癌、骨纤维/恶性纤维肉瘤、骨肉瘤恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低度恶性潜能肿瘤、胰腺癌、异常蛋白血症、真性红细胞增多症、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂输尿管癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、伯克氏肉样肉瘤、 塞扎莱综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、颈部鳞状细胞癌、胃癌、幕上原发性神经外胚层及松果体肿瘤、T-细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂及输尿管的移行细胞癌、移行肾盂及输尿管癌、滋养叶瘤、输尿管及肾盂细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视通路及下丘脑胶质瘤、外阴癌、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、维尔姆斯氏瘤以及除了位于上面所列器官系统中的生瘤以外的任何其它的增生过多疾病。
本文所述并要求保护的方法和组合物可用于治疗恶性或恶化前的症状以及防止恶化成肿瘤或恶性肿瘤状态，包括但不限于上述的那些疾病。这种用途显示在已知或疑似为肿瘤形成或癌症的前期病变的病症中，特别是已发生包括增生、转化的非肿瘤细胞生长，最具体地说，出现发育异常的情况(关于这种异常生长状态的综述，参见RcAbins和 Angell, Basic Pathology,2d Ed. , W.B.Saunders Co. , Philadelphia,68-79 M (1976))。
发育异常往往是癌症的先兆，主要见于上皮。其为非肿瘤细胞生长的最无序形式， 涉及个体细胞一致性和细胞结构定向的丧失。发育异常典型地出现在有慢性刺激或炎症的地方。可以治疗的发育异常病症包括但不限于无汗性外胚层发育异常、面前发育异常、窒息性胸廓发育异常、心房-手指发育异常、支气管肺发育异常、大脑发育异常、宫颈非典型增生、软骨外胚层发育异常、锁骨颅骨发育异常、先天性外胚叶发育异常、颅骨骨干发育异常、 颅腕跗发育异常、颅骨干骺端发育异常、牙本质发育异常、骨干发育异常、外胚层发育异常、 珐琅质发育异常、脑性眼球发育异常、偏侧骨骺发育异常、多发性骨骺发育异常、点状骨骺发育异常、上皮异常增生、面-指(趾)-生殖器发育异常、家族性颂骨纤维异常增殖症、家族性黏膜白色皱襞发育异常、纤维肌性发育异常、骨纤维异常增殖症、旺盛骨性发育异常、 遗传性肾视网膜发育异常、出汗性外胚层发育异常、少汗性外胚叶发育异常、淋巴细胞减少性胸腺发育异常、乳腺发育异常、下腭面骨发育异常、干骺端发育异常、蒙底尼发育异常、单骨纤维发育异常、粘膜上皮发育异常(mucoepithelial dysplasia)、多发性骨骺发育异常、眼耳脊椎发育异常、眼齿指发育异常、直肠椎骨发育异常(culovertebral dysplasia)、牙源性发育异常、opthalmomandibulomelic dysplasia、根尖周牙骨质异常增生、多发性骨纤维性发育异常、假性软骨发育不全性脊椎骨骺发育异常、视网膜发育不全、视-隔发育异常、脊椎骨骺发育异常和脑室桡骨发育异常。
可以治疗的另外的肿瘤前病症包括但不限于良性异常增生疾病(例如，良性肿瘤、纤维囊性病症、组织肥大、肠息肉或腺瘤和食管癌前病变)、粘膜白斑病、角化病、博文氏病、慢性光化性皮炎、日光性唇炎和日光性角化病。
在优选实施例中，本发明的方法用于抑制癌症(特别是上面所列那些)的生长、恶化和/或转移。
另外的增生过多性疾病、病症和/或症状包括但不限于如下的恶性肿瘤及相关病症的恶化和/或转移白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病(包括成髓细胞、前髓细胞、髓单核细胞、单核细胞和红白血病))及慢性白血病 (例如，慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞性白血病))、真性红细胞增多症、淋巴瘤(如，何杰金氏病和非何杰金氏病)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、 重链病和实体瘤，包括但不限于肉瘤和癌瘤，如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、 成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、 基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳突状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、 小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室鼓膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
试剂盒 各实施例可涉及容纳适于治疗或诊断患者病变组织的组分的试剂盒。示例性试剂盒可以含有至少一种或多种如本文所述的抗癌疫苗构建体。如果含施用组分的组合物不是配制成经由消化道递送(如通过口服)，则可以包括能够通过一些其它途径递送试剂盒组分的装置。对于诸如非肠道施用之类的应用而言，一种类型的装置是用来向受试者体内注入组合物的注射器。也可以使用吸入装置。在某些实施例中，可以以含消毒液制剂或冻干制剂的预装注射器或自动注射笔的形式提供治疗剂。
试剂盒组分可以包装在一起或分装在两个或多个容器中。在一些实施例中，容器可以是小瓶，所述小瓶中含有适于调配的组合物的消毒冻干制剂。试剂盒还可以含有一种或多种适于调配和/或稀释其它试剂的缓冲剂。可以使用的其它容器包括但不限于袋、盘、 盒、管等等。试剂盒组分可以消毒地包装并保存在容器内。可以包括在内的另一部分是用户使用试剂盒的使用说明书。
表达载体 另外一些实施例可以涉及包含编码抗癌疫苗构建体或其组成融合蛋白的核酸的 DNA序列。融合蛋白可以包含连接于不同肽或蛋白质(如，用于DNL构建体形成的AD和DDD 肽)的抗CD74抗体或CD20异种抗原，其将在下面的实例中更详细描述。作为另外的选择， 编码的融合蛋白可以包含连接于不同抗体或异种抗原的DDD或AD部分。
各实施例涉及包含编码DNA序列的表达载体。载体可以含有编码人免疫球蛋白的轻链和重链恒定区以及铰链区的序列，嵌合、人化或人可变区序列可连接于上述序列。载体可另外含有表达选定宿主细胞中的编码蛋白的启动子、增强子和信号或前导序列。特别有用的载体是pdHL2或GS。更优选地，轻链和重链恒定区以及铰链区可来自于人EU骨髓瘤免疫球蛋白，其中任选地，至少一个异型位置上的氨基酸被改成见于不同IgGl异型中的氨基酸，且其中任选地，基于EU数体系的EU的重链的氨基酸253可以用丙氨酸替换。参见 Edelman 等，Proc. Natl. Acad, ki USA 63:78-85(1969)。在其它实施例中，IgGl 序列可以转换为IgG4序列。
本领域技术人员会意识到，基因改造表达构建体并插入宿主细胞以表达改造的蛋白质的方法是本领域中公知的，只需进行例行的试验。例如，2005年7月25日提交的美国专利申请No. 11/187，863,2005年10月20日提交的No. 11/253，666以及2006年7月14 日提交的No. 11/487,215中已描述了表达克隆抗体或片段的宿主细胞及方法，它们每个的实例部分以引用的方式并入本文。
实例 提供下面的实例以说明(但不限制)本发明的权利要求。
实例1.对接和锁定(DNL)构建体的制备 DDD和AD融合蛋白 DNL技术可以用来制备包含几乎任何抗体或其片段或其它效应子部分的二聚体、 三聚体、四聚体、六聚体等。对于某些优选实施例而言，IgG抗体、F(ab' )2抗体片段和异种抗原(例如CD20异种抗原)可以被制成含二聚及对接域(DDD)或锚定域(AD)序列的融合蛋白。尽管在优选实施例中，DDD和AD部分被制成融合蛋白，但本领域技术人员会意识到， 在权利要求的方法和组合物的范围内可以利用其它的缀合方法，如化学交联。
可以通过将例如抗⑶74抗体的Fab-DDD融合蛋白与⑶20-AD融合蛋白结合而形成DNL构建体。作为另外的选择，可以制备将IgG-AD融合蛋白与CD20-DDD融合蛋白结合的构建体。所述技术不是限制性的，任何可用的蛋白质或肽都可以制成用于结合到DNL构建体当中的AD或DDD融合蛋白。在利用化学交联的情况下，AD和DDD缀合物不限于蛋白质或肽，可以包括能通过本领域中已知的任何交联技术与AD或DDD序列交联的任何分子。
可以为每个DDD或AD融合蛋白开发独立的转基因细胞系。一旦产生，可根据需要纯化模块，或保存在细胞培养上清液中。在产生之后，可以将任何DDD融合蛋白模块与任何 AD融合蛋白模块结合以产生DNL构建体。对于不同类型的构建体而言，可以利用不同的AD 或DDD序列。下面提供了示例性的DDD和AD序列。
DDDl SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA (SEQ ID NO: 10) DDD2 CGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA (SEQ ID NO 11) ADl:QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO :12) AD2 :CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SEQ ID NO :13) 表达载体 质粒载体pdHL2被用于产生多种抗体和基于抗体的构建体。参见Gillies等，J Immunol Methods(1989)，125 :191-202 ；Losman 等，Cancer (Phila) (1997) ,80 :2660_6。双顺反子哺乳动物表达载体主导IgG的重链和轻链的合成。对许多不同的IgG-pdHL2构建体来说，载体序列大部分是相同的，区别仅在可变域(VH和VL)序列。使用本领域技术人员已知的分子生物学工具可以将这些IgG表达载体转变成Fab-DDD或Fab-AD表达载体。为了产生Fab-DDD表达载体，重链的铰链、CH2和CH3域的编码序列用编码铰链前4个残基、14残基Gly-Ser连接体和人RII α的前44个残基的序列替换(被称为DDD1)。为了产生Fab-AD 表达载体，IgG的铰链、CH2和CH3域的序列用编码铰链前4个残基、15残基Gly-Ser连接体和称为AKAP-IS的17残基合成AD的序列替换(被称为ADl)，上述序列的产生利用了生物信息学和肽阵列技术，显示出与RII α 二聚体的高亲和力结合(0.4ηΜ)。参见Alto等， Proc. Natl. Acad. Sci.，U. S. A (2003)，100 4445-50 设计两种穿梭载体以帮助IgG_pdHL2载体转为Fab-DDDl或Fab-ADl表达载体，如下所述。
CHl的制备 使用pdHL2质粒载体为模板，通过PCR扩增CHl域。左侧PCR引物由CHl域的上游 (5')端和McII限制性核酸内切酶位点组成，该位点为CHl编码序列的5'。右侧引物由编码铰链(PKSC(SEQ ID NO :29)的前4个残基且后面有4个甘氨酸和丝氨酸的序列组成， 最后两个密码子(GS)包含Barn HI限制性位点。将410bp PCR扩增引物克隆到PGEMT PCR克隆载体( 1 01^64 ,111(3.)，并筛选用于17(5')方向的插入物的克隆。
公开为(SEQID NO 14)的(G4S)2DDDK(G4S)2 的构建 由Sigma GENOSYS (Haverhill，UK)合成双链寡核苷酸(名称为 (QS)2DDDl (Oi4S)2,公开为SEQ ID NO 14))以编码前面有连接肽的11个残基的氨基酸序列 DDD 1，前两个密码子包含BamHI限制性位点。终止密码子和fegl限制性位点附于3'端。 编码的多肽序列在下面示出。
GSGGGGSGGGGSHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVE YFTRLREARA(SEQ ID NO: 15) 合成两种寡核苷酸(名称为RIIA1-44顶部和RIIA1-44底部，由其3'端上的30 个碱基对重叠)(Sigma GENOSYS )，结合以包含174bpDDD 1序列的中央154碱基对。对寡核苷酸退火并使之经受与Taq聚合酶的引物延伸反应。引物延伸后通过PCR扩增双链。 将扩增引物克隆到PGEMT ，并筛选用于T7(5')方向的插入物。
公开为SEQ ID NO 14)的(G4S)2-ADK(G4S)2 的构建 合成双链寡核苷酸(名称为(G4S)2-ADl((G4S)2,公开为 SEQ ID NO 14)) (Sigma GENOSYS )以编码前面有连接肽的11个残基的氨基酸序列ADl，前两个密码子包含BamHI 限制性位点。终止密码子和fegl限制性位点附于3'端。编码的多肽序列在下面示出。
GSGGGGSGGGGSQIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO :16) 合成编码上述肽序列的两条互补重叠寡核苷酸(名称为AKAP-IS顶部和AKAP-IS 底部)并退火。通过PCR扩增双链。将扩增引物克隆到PGEMT 载体并筛选用于T7(5') 方向的插入物。
连接DDDl 与 CHl 用BamHI和NotI限制性内切酶从PGEMT 上切下编码DDDl序列的190bp片段， 然后连接到CH1-PGEMT⑧中的相同位点以产生穿梭载体CH1-DDD1-PGEMT ‘ 。
连接ADl 与 CHI 用BamHI和NotI从PGEMT 上切下含AD 1序列的IlObp片段并连接到 CH1-PGEMT 中的相同位点以产生穿梭载体CH1-AD1-PGEMTO 。
将CHl-DDDl或CH1-AD1克隆到基于pdHL2的载体 通过这种模块化设计可以将CHI-DDDl或CHl-ADl结合到pdHL2载体中的任何 IgG构建体当中。通过将McII/fegl限制性片段(CH1-CH3)从pdHL2中移除并用从相应的pGemT穿梭载体上切下的CHl-DDDl或CHl-ADl的McII/fegl片段替换，由此将整个重链恒定域被上述构建体之一替换。
h679-Fd-ADl_pdHL2 的构建 h679-Fd-ADl_pdHL2是用以产生h679 Fab的表达载体，后者带有经由14个氨基酸残基组成的柔性Gly/Ser肽间隔物与Fd的CHl域的羧基末端偶联的AD1。通过用 CHl-ADl片段替片段而将含h679的可变域的基于pdHL2的载体转变成 h679-Fd-ADl-pdHL2，所述 CH1-AD1 片段是用 SacII 和 Eagl 从 CH1-AD1-SV3 穿梭载体上切下的。
C-DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2 的构建 C-DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2 是用以产生含有两个融合蛋白 C_DDDl-Fab-hMN_14 的拷贝的稳定二聚体的表达载体，其中DDDl经由柔性肽间隔物在CHl的羧基末端与 hMN-14 Fab连接。通过用SacII和fegl限制性核酸内切酶消化以移除CH1-CH3域并插入CHl-DDDl片段，由此将已被用来产生hMN-14 IgG的质粒载体hMN_14 (I)-pdHL2转变成 C-DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2，所述 CH1-DDD1 片段是用 SacII 和 fegl 从 CH1-DDD1-SV3 穿梭载体上切下的。
已经利用相同的技术产生用于各种已知抗体(如，hLLl、hLL2、hPAM4、hRl、hRS7、 hMN-14、hMN15、hA19、hA20及许多其它抗体)的Fab表达的质粒。一般来讲，抗体可变区编码序列存在于pdHL2表达载体，并且如上所述转变该表达载体以产生AD-或DDD-融合蛋白。
C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2 的构建 C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2 是用以产生 C-DDD2_FabhMN_14 的表达载体，后者具有经由14氨基酸残基GlyAer肽附于hMN-14的Fd的羧基末端的DDD2的二聚及对接域序列。 分泌的融合蛋白由通过DDD2域的非共价相互作用保持在一起的两个相同的hMN-14 Fab的拷贝组成。
表达载体的改造如下。以合成方式制备两条重叠互补的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含部分连接肽(GGGGSGGGCG，SEQ ID NO 17)的编码序列和DDD2的1_13残基。寡核苷酸退火并用T4 PNK磷酸化，在5'和3'端上产生悬垂部分，所述悬垂部分对与分别用限制性核酸内切酶BamHI和I^stI消化的DNA的连接是相容的。
双链DNA与通过用BamHI和I3StI消化制备的穿梭载体CHI-DDDI-PGEMT ’ 连接以产生穿梭载体 CH1-DDD2-PGEMT 。用 SacII 和 EagI 从 CHl-DDD2-PGEMT 上切下 507bp 片段，并与通过用SacII和fegl消化制备的IgG表达载体hMN-14(I)-pdHL2连接。最终表达构建体被称为C-DDD2-FdhMN-14-pdHL2。类似的技术已被用于产生许多不同人化抗体的 Fab片段的DDD2融合蛋白。
h679-Fd-AD2-pdHL2 的构建 h679-Fd-AD2-pdHL2是用以产生h679-Fab-AD2表达载体，后者具有经由14氨基酸残基Gly/Ser肽连接体附于CHl域的羧基末端的AD2的锚定域序列。AD2在ADl的锚定域序列之前具有一个半胱氨酸残基，在其后具有另一个半胱氨酸残基。
表达载体的改造如下。以合成方式制备两条重叠互补的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含AD2的编码序列和部分连接体序列。寡核苷酸退火并用T4 PNK磷酸化，在5'和3' 端上产生悬垂部分，所述悬垂部分对与分别用限制性核酸内切酶BamHI和Spel消化的DNA 的连接是相容的。
将双链DNA连接到通过用BamHI和Spel消化制备的穿梭载体CH1_AD1_PGEMT 以产生穿梭载体CH1-AD2-PGEMT ‘ 。用SacII和fegl限制性内切酶从穿梭载体上切下含CHl 和AD2编码序列的4 碱基对片段并连接到通过用那些相同的酶消化制备的h679-pdHL2 载体。最终的表达载体是h679-Fd-AD2-pdHL2。
TF2三聚DNL构建体的产生 通过使C-DDD2-Fab-hMN-14与h679_Fab_AD2反应获得被称为TF2的三聚DNL构建体。如下产生试验批量的TF2，产率> 90%。按1.4 1的摩尔比混合蛋白L-纯化的 C-DDD2-Fab-hMN-14 (200mg)与 h679_Fab_AD2 (60mg)。在含有 ImM EDTA 的 PBS 中的总蛋白浓度为5mg/ml。后续步骤涉及TCEP还原、HIC色谱法、DMSO氧化和IMP 291亲合色谱法。 在添加TCEP之前，SE-HPLC不显示任何￡1213形成的迹象。添加5mM TCEP迅速导致形成与二元结构所预计的157kDa蛋白质一致的a2b复合体。通过IMP 291亲合色谱法将TF2纯化到接近同质(未示出)。IMP 291是含有679Fab与之结合的HSG半抗原的合成肽(Rossi等， 2005, Clin Cancer Res 11 :7122s_29s)。IMP291 未结合部分的 SE-HPLC 分析证实了 ￡i4、a2 和游离κ链从产物中的移除(未示出)。
非还原性SDS-PAGE分析证实了大部分TF2存在为大共价结构，IgG结构的附近有相对的移动性(未示出)。还原性SDS-PAGE表明，因为只有表示TF2的组成多肽的带是明显的(未示出)，所以在非还原凝胶中明显的任何附加带都与产物相关(未示出)。然而， 四种多肽中的每种的相对移动性太接近而不能分辨。MALDI-T0F质谱法(未示出)显示 156，434Da的单峰，其在TF2计算质量(157，319Da)的99. 5%之内。
通过BIAC0RE ⑧试验确定 TF2 的官能度。将 TF2、C-DDDl-hMN-14^679_ADl (用作非共价￡i2b复合体的对照样品)或C-DDD2-hMN-14^679-AD2 (用作未还原的ει2和b组分的对照样品)稀释到1 μ g/ml (总蛋白)，并通过用HSG固定的传感芯片。TF2的响应是两个对照样品的大约两倍，表明只有对照样品中的h679-Fab-AD组分与传感芯片结合并保持在其上。随后注射WI2 IgG(hMN-14的抗个体基因型抗体)表明，只有TF2具有与h679_Fab_AD 紧密结合的DDD-Fab-hMN-14组分，如附加的信号响应所指示的那样。由WI2与固定在传感芯片上的TF2结合引起的响应单元的额外增加与两个全功能结合位点相对应，每个所述结合位点由C-DDD2-Fab-hMN-14的一个亚单元提供。TF2与WI2的两个Fab片段结合的能力证实了这一点(未示出)。
实例2. CH3-AD2-IgG 表达载体 产生质粒穿梭载体以帮助将任何IgG_pdHL2载体转变成CH3-AD2_IgG-pdHL2载体。 使用pdHL2载体为模板和以下的寡核苷酸引物，通过PCR扩增Fc的基因(CK2和Ch3域) Fc BglII 左侧 AGATCTGGCGCACCTGAACTCCTG(SEQ ID NO 8) Fc Bain-EcoRI ^iM GAATTCGGATCCTTTACCCGGAGACAGGGAGAG(SEQ ID NO :9)。
扩增引物在pGemT PCR克隆载体(Promega)中克隆。用)(ba I和Bam HI从 pGemT上切下Fc插入片段并与通过用Xba I和Bam HI消化h679-Fab_AD2-pdHL2 (Rossi 等，Proc Natl Acad Sci USA 2006，103 :6841-6)制备的 AD2_pdHL2 载体连接，从而产生穿梭载体 ^-Α02-ρ(1Η 2。为了将IgG-pdHL2表达载体转变成CH3-AD2_IgG-pdHL2表达载体，从前者上切下861bp BsrG I/Nde I限制性片段，并用从Fc-AD2-pdHL2载体上切下的 952bp BsrG I/Nde I限制性片段替换。下面是已产生并用以生产重组人化IgG_AD2模块的 CH3-AD2-IgG-pdHL2表达载体的部分列表 CH3-AD2-IgG-hA20 (抗 CD20)
CH3-AD2-IgG-hLL2 (抗 CD22) CH3-AD2-IgG-hL243 (抗 HLA-DR) CH3-AD2-IgG-hLLl (抗 CD74) CH3-AD2-IgG-hRl (抗 IGF-1R) CH3-AD2-IgG-h734 (抗铟-DTPA)。
实例3. CH3-AD2-IgG 的生产 稳定CH3-AD2_IgG分泌细胞系的转染和选择 所有细胞系生长在Hybridoma SFM(Invitrogen, Carlsbad CA)中。 CH3-AD2-IgG-pdHL2载体(30 μ g)通过用Ml I限制性核酸内切酶消化而线性化，并通过电穿孔(450伏，25 μ F)转染到Sp2/0-Agl4(2.8xl06细胞)。pdHL2载体含允许通过甲氨蝶呤 (MTX)克隆选择和基因扩增的二氢叶酸还原酶的基因。
在转染之后，将细胞涂布在96孔板上，并在含0. 2 μ M MTX的培养基中选择转基因克隆。使用涂以特定抗个体基因型MAb的96孔微量滴定板，通过夹心ELISA对克隆进行CH3-AD2-IgG产率的筛选。将推定克隆的条件培养基转移至微板的孔中，通过辣根过氧化物酶缀合的山羊抗人IgGF(ab' )2进行融合蛋白的检测(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) 0扩增给出最强信号的孔并最终用于生产。
CH3-AD2_IgG模块的生产和纯化 为生产融合蛋白，以2xl05细胞/ml接种滚瓶培养物，并在5% CO2和37°C下于滚瓶培养箱中进行培养，直到细胞活力下降到25%以下(-10天)。通过离心澄清肉汤培养物，过滤并通过超滤浓缩到50倍。为了纯化CH3-AD2-IgG模块，将浓缩的上清液装载到蛋白 A (MAB选择)亲和柱上。柱用PBS冲洗至基线，用0. IM甘氨酸(pH2. 5)洗脱融合蛋白。
实例4. DDD2-mCD20 (136-178)的产生和 DDD2_mCD20 (136-178)-pdHL2 的构建 DDD2-mCD20 (136-178)-pdHL2 是 DDD2_mCD20 (136-178)的表达载体，后者包含 DDD2-连接体 _mCD20 (136-178)-HHHHHH (HHHHHH 被公开为 SEQ ID NO 30)。小鼠⑶20(mCD20)的胞外域被称为mCD20 (136-178)，包含下示序列的136至178氨基酸残基 TLSHFLKMRRLELIQTSKPYVDIYDCEPSNSSEKNSPSTQYCN(SEQ ID NO :18) 小鼠CD20异种抗原的氨基酸序列在下面示出。
MSGPFPAEPTKGPLAMQPAPKVNLKRTSSLVGPTQSFFMRESKAL GAVQIMNGLFHITLGGLLMIPTGVFAPICLSVWYPLWGGIMYIISG SLLAAAAEKTSRKSLVKAKVIMSSLSLFAAISGIILSIMDIL匪TLS HFLKMRRLELIQTSKPYVDIYDCEPSNSSEKNSPSTQYCNSIQSVFL GILSAMLISAFFQKLVTAGIVENEWKRMCTRSKSNVVLLSAGEKN
EQTIKMKEEIIELSGVSSQPKNEEEIEIIPVQEEEEEEAEINFPAPPQE QESL PVENEIAP(SEQ ID NO 7) 使用全长鼠⑶20 cDNA克隆为模板和下示的两种引物，通过PCR获得包含 mCD20 (136-178)的核苷酸序列且两侧有BamHl和Biol限制性位点的DNA片段。
上游引物BamHImCD20 引物(30-mer) 5' -GGATCCACACTTTCTCATTTTTTAAAAATG(SEQ ID NO 31) 下游引物=XhoImCD20 引物(30-mer) 5' -CTCGAGGTTACAGTACTGTGTAGATGGGGA(SEQ ID NO 32) 将PCR 扩增引物(141bp)克隆到 PGEMT 载体(PROMEGA )。制备 DDD2_pdHL2 哺乳动物表达载体，例如，N-DDD2-hG-CSF-His-pdHL2，用以通过用XbaI和Bam HI限制性核酸内切酶消化与扩增引物连接。用)(bal和Barn HI从PGEMT 上切下mCD20_扩增引物， 并连接到DDD2-pdHL2载体以产生表达载体DDD2_mCD20 (136-178)-pdHL2。
转染并筛选以获得表达DDD2_mCD20 (136-178)的克隆 载体DDD2_mCD20 (136-178)通过用Mil酶消化而线性化，并通过电穿孔稳定地转染到SpESF骨髓瘤细胞(参见，例如，美国专利7，537，930，其实例部分以引用的方式并入本文)。通过ELISA发现许多克隆具有可检测水平的DDD2-mCD20 (136-178)，由其中选出最佳生产的克隆并随后通过在五周内将甲氨蝶呤(MTX)浓度从0. 1提高到0.8 μ M来进行扩增。 在此阶段，其通过限制稀释来亚克隆，并扩增最高产的亚克隆。
用0. 8 μ M MTX将克隆扩增到含总共20L无血清Hybridoma SFM的34个滚瓶中， 并使之达到末期培养。通过离心使上清液澄清并过滤(0.2 μ Μ)。滤液渗滤进入IX结合缓冲液(IOmM咪唑，0. 5Μ NaCl, 50mM NaH2PO4, pH 7. 5)，并在制备时浓缩到310mL，用于通过固定化金属亲和色谱法(IMAC)进行纯化。将浓缩物装载至30-mL Ni-NTA柱，该柱已经用Tween 20在IX结合缓冲液中的0. 02%溶液500mL的清洗，然后经^OmL的30mM咪唑、 0. 02% Tween 20、0. 5M NaCl、50mM NaH2PO4 (pH 7. 5)清洗。产物用 IlOmL 的 250mM 咪唑、 0. 02% Tween 20、150mM NaCl、50mM NaH2PO4(pH 7.5)洗脱。在还原条件下通过 SDS-PAGE 测定 DDD2-mCD20 (136-178)的纯度。
实例5.产生包含连接于四个mCD20(136-178)的拷贝的hLLl IgG的74_mCD20 DNL
疫苗 如实例2和实例3所述制备CH3-AD2-IgG_hLLl (抗CD74)。构建体包含连接于hLLl IgG的每个重链C末端的AD2部分。如实例4所述制备DDD2-mCD20(136-178)。通过在含 ImM还原谷胱甘肽的PBS中混合hLLl IgG_AD2和DDD2_mCD20 (136-178)来进行DNL反应。在次日加入氧化的谷胱甘肽至2mM的最终浓度，M小时后在蛋白A柱上纯化反应混合物。 在此实施例中，两个DDD2-mCD20的拷贝连接于每个AD2部分，产生包含一个hLLl IgG部分和四个mCD20异种抗原部分的DNL复合体。
在一个可供选择的实施例中，hLLl的Fab连接于DDD2，mCD20 (136-178)连接于AD2。如上所述形成的DNL构建体导致形成名称为hLLl-F(ab)2-mCD20(136-178)的匪疫苗，其包含连接于hLLl的两个Fab部分的单个mCD20 (136-178)。实例6描述了 AD2-mCD20 (136-178)的产生。
对患有MM 的受试者施用 74-mCD20 (136-178)或 hLLl-F (ab) 2_mCD20 (136-178)诱导针对CD138MgCD20+推定干细胞的免疫反应。免疫反应能有效地减少或消除受试者的MM 病细胞。
实例6.重组 AD2_mCD20 (136-178)的产生 AD2-mCD20 (136-178)-pdHL2 是重组 AD2_mCD20 (136-178)的表达载体，后者包含 AD2-连接体-mCD20 (136-178)-HHHHHH(HHHHHH被公开为 SEQ ID NO :30)。使用全长鼠 CD20 cDNA克隆为模板和下示的两种引物，通过PCR获得包含mCD20 (136-178)的核苷酸序列且两侧具有Bgl2和fegl限制性位点的DNA片段。
上游引物Bgl2_mCD20引物(30-mer) 5' -AGATCTACACTTTCTCATTTTTTAAAAATG(SEQ ID NO 33) 下游引物Eagl_mCD20引物(48-mer) 5' CGGCCGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTTACAGTACTGTGT AGATGG (SEQ ID NO :34) 将PCR扩增引物(162bp)克隆到PGEMT 载体(PROMEGA. )。制备AD2_pdHL2 哺乳动物表达载体，例如，N-AD2-hTransferrin-His-pdHL2，用以通过用Bgl2和fegl限制性核酸内切酶消化与扩增弓丨物连接。用Bgl2和fegl从PGEMT 上切下mCD20_扩增引物，并连接到AD2-pdHL2载体，从而产生表达载体AD2-mCD20 (136-178) -pdHL2。如实例4所述获得表达 AD2-mCD20 (136-178)的克隆，并使用 Ni_select 由培养上清液纯化 AD2_mCD20 (136-178)。
实例7. AD和DDD序列变体 在某些优选实施例中，结合到DNL复合体的AD和DDD序列包含氨基酸序列 AD2 (SEQ ID NO :13)禾口DDD2(SEQ ID NO :11)，如上所述。然而，在可供选择的实施例中，AD和 /或DDD部分的序列变体可用于构建细胞因子-MAb DNL复合体。AD和DDD域的结构-功能关系已成为研究的主题(参见,如,Burns-Hamuro 等，2005，Protein Sci 14 =298292 ；Carr 等， 2001，J Biol Chem 276 :17332-38 ；Alto等，2003，Proc Natl Acad Sci USA 100 :4445-50 ； Hundsrucker等，2006，Biochem J 396 :297-306 ；Stokka 等，2006，Biochem J 400 :493-99 ； Gold 等，2006，Mol Cell 24 :383-95 ;Kinderman 等，2006，Mol Cell24 :397-408)。
例如，Kinderman等Q006)检查了 AD-DDD结合相互作用的晶体结构，并得出结论认为，人DDD序列含有许多在二聚体形成或AKAP结合中重要的保守氨基酸残基，在下面的 SEQ ID NO :10中加以下划线(参见Kinderman等的图1，2006)。本领域技术人员会意识到， 在设计DDD序列的序列变体时，期望要避免改变任何加下划线的残基，而对在二聚和AKAP 结合中不那么重要的残基可以进行保守的氨基酸替换。
来自蛋白激酶A的人DDD序列 SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO :10) Alto等Q003)进行了各种AKAP蛋白的AD序列的生物信息学分析，用以设计被称 ^ AKAP-IS (SEQ ID NO 12)的RII选择性AD序列，其对DDD的结合常数为0. 4nM。AKAP-IS 序列被设计为AKAP与PKA结合的肽拮抗剂。在AKAP-IS序列中，若进行替换往往会降低与 DDD的结合性的残基在下面的SEQ ID NO 12中加下划线表示。
AKAP-IS 序列 QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO 12) 类似地，Gold(2006)利用结晶学和肽筛选开发出SuperAKAP-IS序列(SEQ ID NO 19)，其显示出对PKA的RII异形体的选择性比RI异形体的高五个数量级。加下划线的残基表示相对于AKAP-IS序列的氨基酸替换位置，这种替换可提高RII α与DDD部分的结合性。在此序列中，N末端Q残基被编为4号残基，C末端A残基是20号残基。可以进行替换以影响RII α亲和力的残基是8、11、15、16、18、19和20号残基(Gold等，2006)。可设想在某些可供选择的实施例中，SuperAKAP-IS序列可以替换AKAP-IS AD部分序列以制备细胞因子-MAb DNL构建体。可替换AKAP-IS AD序列的其它替代性序列示于SEQ ID NO: 20-22。相对于AKAP-IS序列的替换以下划线表示。可预计的是，与SEQ ID NO 19中所示的AKAP-IS序列一样，AD部分也可以包括额外的N-末端残基半胱氨酸和甘氨酸以及C末端残基甘氨酸和半胱氨酸。
SuperAKAP-IS QIEYVAKQIVDYAIHQA(SEQIDNO19) 替代性AKAP序列 QIEYKAKQIVDHAIHQA(SEQIDNO20) QIEYHAKQIVDHAIHQA(SEQIDNO21) QIEYVAKQIVDHAIHQA(SEQIDNO22) Stokka等Q006)还开发了 AKAP与PKA结合的肽竞争物，示于SEQ ID NO :23_25。 肽拮抗剂名称为 Ht31(SEQ ID NO :23)、RIAD (SEQ ID NO :24)和 PV-38 (SEQ ID NO :25)。 Ht-31肽显示出PKA对RII异形体更大的亲和力，而RIAD和PV-38显示出对RI更大的亲和力。
Ht31 DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY(SEQ ID NO :23) RIAD LEQYANQLADQIIKEATE (SEQ ID NO :24) PV-38 FEELAffKIAKMIffSDVFQQC(SEQ ID NO :25) Hundsrucker等Q006)开发了另外其它的AKAP与PKA结合的肽竞争物，PKA的 RII形式对DDD的结合常数低至0. 4nM。各种AKAP肽拮抗剂的序列提供在Hundsrucker等 (以引用方式并入本文)的表1中。在不同AKAP蛋白的AD域中高度保守的残基参照AKAP IS序列(SEQ ID N0 12)以下划线表示。所述残基与Alto等(2003)所观察的相同，加上C 末端丙氨酸残基(参见Hundsrucker等Q006)的图4，其以引用方式并入本文)。具有特别高RII DDD序列亲和力的肽拮抗剂的序列示出在SEQ ID NO :26- 中。
AKAP-IS QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO: 12) AKAP7δ-wt-pep PEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQY(SEQ ID NO :26) AKAP7δ-L304T-p印 PEDAELVRTSKRLVENAVLKAVQQY(SEQ ID NO :27) AKAP7δ_L308D_p印 PEDAELVRLSKRDVENAVLKAVQQY(SEQ ID NO :28) Carr等Q001)检查了来自人和非人蛋白的不同AKAP结合DDD序列之间的序列同源程度，并鉴别了 DDD序列中看起来在不同DDD部分中最高度保守的残基。这些参照SEQ ID N0:10的人PKA RII α DDD序列加下划线表示。特别保守的残基用斜体字进一步指出。 所述残基与Kinderman等认为对与AKAP蛋白结合重要的残基重叠但不完全相同。

SmOIPFGLTELLOGYTVEVLRQOPmLYEFAWEYFTRLREARA (SEQ ID NO: 10) 本领域技术人员会意识到，一般而言，在来自不同蛋白的DDD和AD序列中高度保守的那些氨基酸残基是优选在进行氨基酸替换中保持不变的那些，而更容易改变不那么高度保守的残基，以产生本文所述的AD和/或DDD序列的序列变体。
本领域技术人员会意识到，DNL构建体的抗体部分或连接体部分中的这些或其它氨基酸替换可以用来增强所得DNL构建体的治疗和/或药物动力学特性。
实例8. hLLl对DC的影响-hLLl与APC的不同亚群的有效结合 早期研究表明⑶74在包括血液DC、B细胞、单核细胞在内的大多数抗原呈递细胞中表达。为了进一步表征⑶74在APC中的表达模式，我们检查了⑶74在人PBMC的不同亚群中以及在离体单核细胞源性DC中的表达。使用图IA所示的门控策略(gating strategy), 我们发现所有的血液DC亚群、骨髓DC KMDC 1)及DC2(MDC2)和类浆细胞DC (PDC)均表达 ⑶74，MDC2表达最高水平的⑶74(图1B)。⑶74也在单核细胞源性未成熟DC中表达，表达水平比在LPS成熟DC中高得多(图2A)。与⑶74表达模式一致，hLL 1与血液DC亚群、B 细胞、单核细胞和单核细胞源性未成熟DC高效结合(图1C、图2B)，但不与LPS成熟DC结合(图2B、图2C)。hLLl在这些APC亚群中的结合效率与其⑶74表达水平密切相关。这些数据提供了通过对接和锁定技术使用hLLl为靶载体将抗原体内靶向至APC的基础。
hLLl对⑶74的细胞毒性效应-表达恶性B细胞，但对正常DC没有影响 因为⑶74在未成熟DC中的高度表达，而hLLl与未成熟DC高效结合，如图IA和图IB所示，我们想知道hLLl是否在DC中具有与其在CD74表达B细胞淋巴瘤中相同的细胞毒性，后者在前面示出(Stein等，Blood 2004，104 :3705-11)。为此目的，利用MTS试验和显微镜成像，将hLLl对B细胞恶性肿瘤Daudi细胞和人单核细胞源性DC的细胞活力的影响进行并列对比。结果表明，在存在GAH(山羊抗人抗体)一用于hLLl交联的第二抗体一的情况下，hLLl显著降低了 Daudi细胞的细胞活力，但没有降低DC的细胞活力(图3A)，如上所示，DC通常表达高水平的⑶74。显微镜成像显示，用以GAH交联的hLLl处理的Daudi 细胞集结并浓缩，而DC在相同处理后维持正常的形态(图3C、图3D)。以GAH交联的hLLl对Daudi细胞的细胞毒性与Mein等Q004)的早期研究一致，显示hLLl在离体和体内对 B细胞恶性肿瘤是有细胞毒性的。在细胞凋亡试验中进一步证实了 hLLl加上GAH对DC没有细胞毒性，该试验显示亚二倍体细胞核群不受以GAH交联的hLLl的影响(未示出)。
为了进一步证实hLLl对DC没有细胞毒性，我们使用流式细胞仪进行了细胞凋亡试验。细胞核从用未成熟DC处理的hLLl获得，并用PI染色用于流式细胞仪分析。PI+粒子首先被门控，并且首先通排门控出低SSC粒子而排除碎屑。通过测量亚二倍体细胞核群来分析所得门控的细胞核的细胞凋亡(图2A)。结果证明hLLl在存在或不存在用于交联 (GAH,F(ab' )2 GAH IgG Fc γ-特异性)的第二 mAM20 μ g/ml)的情况下对两个供体中的 DC细胞凋亡没有影响(图2B、图2C)。这些数据证明，不像其对B细胞恶性肿瘤的细胞毒性作用那样，hLLl对同样表达CD74表面抗原的正常树枝状细胞具有很少细胞毒性。
通过hLLl适度增强DC组成性成熟 人IgG可以通过FcR连接与DC相互作用，并且根据所涉及的FcR的亚型，其可对 DC成熟具有相反作用。作为人化IgG，hLLl不仅可以通过⑶74也可以通过在DC上表达的 FcR与人DC相互作用。为此，我们推测hLLl可以通过与⑶74或FcR或两者相互作用来影响DC功能。为了研究这种情况，我们测试了在存在hGM-CSF和hIL-4的情况下，hLLl在单核细胞的离体培养期间对DC组成性成熟的作用。
因为DC成熟通常反映在其形态变化，所以我们也检查hLLl处理对DC形态是否具有任何作用。如图3B所示，在不存在或存在GAH交联的情况下，用hLLl以不同剂量处理不同天数的DC看起来健康完整。hLLl处理的DC显示出以纤维样细胞为特征的一些微小的形态变化，所述变化类似于LPS处理的DC(未示出)，但较不明显。
因为成熟DC主要在抗原呈递和共刺激分子表达的上调、改变的细胞因子产生以及增强的T细胞刺激能力方面不同于未成熟DC，我们随后研究了 hLLl对DC中的抗原递呈分子HLA-DR和共刺激分子(⑶M和⑶86)的表达水平是否具有任何作用(图4)。结果显示hLLl可以在0. 05-5ug/ml的hLLl浓度范围内以剂量依赖性方式上调HLA-DR、⑶讨和 CD86 (图4A)。然而，因为在5 μ g/ml hLLl与Oug/ml相比的情况下，HLA-DR和共刺激分子 (⑶M和⑶86)的表达仅上调了 10% (图4B)，所以效果不强烈。在最高浓度(50 μ g/ml) 条件下，HLA-DRjDM和⑶86的表达与在5 μ g/ml hLLl下相比没有进一步的上调，而是略有减少(图4B)。这些结果表明，尽管不是非常有效，但hLLl可以增强DC的组成性成熟。
hLLl处理的DC对T细胞扩增没有显著影响 未成熟DC和成熟DC之间的功能差别在于，成熟DC有较强的刺激T细胞增殖和扩增的能力。因为hLLl可以通过上调DC中的HLA-DR、⑶讨和⑶86的表达来增强组成性成熟(图4B)，所以我们想确定是否可以通过被DC增强的T细胞扩增来反映这种DC成熟作用。如图5所示，用0.05至50 μ g/ml hLLl处理的DC不影响DC介导的T细胞扩增，包括总T细胞(⑶4+和⑶4-T细胞)(图5)。此结果表明hLLl增强的DC组成性成熟不够强烈， 不能被转化为增强的T细胞刺激能力。
原态⑶4+T细胞通过hLLl处理DC向Thl效应子细胞的极化 然而，DC具有另一重要功能极化原态CD4 T细胞，以分化为不同的效应子细胞 Thl、Th2、Thl7以及新定义的Thl7-1细胞。Thl细胞对针对细胞内病原体和癌症的细胞免疫是至关重要的，而Th2细胞的诱导是体液免疫的原因。产生IL-17的Thl7和Thl7-1细
40胞是其它的极化细胞群体，该细胞群体在对某些病原体和自身免疫炎症的免疫方面具有多种功能。这些效应子细胞的极化主要通过DC对DC/T细胞突触中的T细胞提供的DC分泌的细胞因子(所谓的“信号3”)来介导。CD4+原态T细胞可以分化为介导不同效应子功能的Thl、Th2和ThO细胞，其中Thl效应子细胞在维持针对癌症和传染病的CTL反应方面发挥重要作用。我们已证明0. 05至50 μ g/ml的hLLl可以以微弱但剂量依赖的方式增强DC 组成性成熟，但用这些浓度的hLLl处理的DC不影响DC介导的T细胞扩增(图5)。我们随后关注hLLl处理的DC是否可以影响⑶4+原态T细胞的极化。如图5所示，hLLl处理的 ⑶极化⑶4+原态T细胞，以向越来越多的Thl效应子细胞以及越来越少的Th2和Tnp细胞分化。这些结果表明DC可以通过hLLl被功能性调节。因为Thl在针对肿瘤和传染病的适应性免疫方面发挥关键作用，hLLl在用于疫苗接种时可以具有辅剂样活性。
实例9. 74-mCD20的离体特性一通过人PBMC中的74_mCD20诱导hCD20特异性免疫 ⑶20是在B细胞中正常表达的自体抗原，其因免疫耐受性在理论上难以通过疫苗方法靶向。然而，已通过用编码人⑶20胞外域的小基因(I^lomba等，Clin Cancer Res 2005 ；11 370-9)或包含人CD20胞外域和含QS21辅剂的载体蛋白的缀合物(Roberts 等，Blood2002 ；99 :3748-55)接种而在荷瘤小鼠中实现对⑶20的特异性T细胞免疫反应。若干其它报道也证明使用异种抗原来打破免疫耐受性的可行性，如动物模型中(Ding 等，Blood 2008 ；112 :2817-25 ；Soares 等，J Immunol 2001 ； 166 :6555-63)以及在患者中 (Ramanathan 等，Cancer Immunol Immunother 2005 ；54 :254-64)的 MUCl 所示。为了测试 74-mCD20是否可以成功诱导hCD20特异性免疫，并克服CD20的免疫耐受性，进行下面的试验。
通过在存在hGM-CSF和hIL_4的情况下培养5天，从PBMC中产生人DC。对未成熟 DC加载74-m⑶20，并通过LPS加上IFN- γ而成熟化。成熟DC被用来刺激自体PBMC 10天。 每周两次进行用相同加载DC的重新刺激。在最后一次重新刺激后，通过在由分选的CD20 阳性MM癌干细胞刺激时测量细胞因子反应(IFN-γ)来检验T细胞的抗原特异性。T细胞显示对CD20阳性匪癌干细胞的阳性反应，但对对照CD20阴性匪细胞没有阳性反应。
74-mCD20在离体的各种抗原递呈细胞中的特异性结合、内在化和细胞内定位 我们的初步数据已显示hLLl与不同的APC(包括骨髓DCl和骨髓DC2、类浆细胞 DC、B细胞和单核细胞)有效和特异性地结合。为了证实4-mCD20在与APC结合方面具有与单独hLLl相同的效率和特异性，进行了下面的试验。
使用74-mCD20和对照Ml-mCD20(包含连接于四个mCD20的拷贝的抗MUCl抗体)。 结合试验进行如下。简而言之，按制造商的说明，用ΖΕΝ0ΝΤΜ ALEXA FLU0R. 488人IgG标记试剂盒(INVITR0GEN )标记15 μ g的74_mCD20或Ml_mCD20。书标记的制剂被用来染色人PBMC，如下所述。
在4°C用人FcR阻断试剂(MiltenyiBiotec, 1 20稀释)对使用FIC0LL-PAQUETM 从血块黄层中分离的人PBMC处理10分钟。洗过的细胞用特异性标记的mAb染色，并通过流式细胞仪(FACSCALIBUR0)分析。用于研究的标记mAb包括FITC-标记的抗⑶74 mAb ； ALEXA FLUOR 488-标记的 74_mCD20 ；ALEXAFLU0R488 标记的 Ml_mCD20 ；PE 缀合的抗 ⑶19 mAb (用于B细胞)；PE缀合的抗⑶14 mAb (用于单核细胞)；和APC缀合的mAb至BDCA-I (用于MDC1)、BDCA_2 (用于PDC)或BDCA-3 (用于MDC2)。门控策略被用于鉴别B细胞、单核细胞、MDC1、MDC2和PDC。数据通过FlowJo软件分析平均荧光强度和表达表面标记物的阳性细胞群。
为了解74_mCD20是否被内在化到用以进一步处理成MHC II级呈递和MHC I级交叉呈递的内涵体，进行下面的试验。使74-mCD20或Ml_mCD20与人PBMC混合，在4°C下培养1小时，然后进行充分的冲洗。然后将细胞转到37°C，在不同时间点(0、15、30或45分钟)固定，并在进行或不进行前期透化的情况下用ALEXAFLU0R. 标记的抗人IgG第二抗体染色。通过流式细胞仪确定平均荧光，通过从在不同时间点以固定和透化的细胞(内在化且表面结合)记录的荧光中减去固定细胞(表面结合)中的平均荧光来计算内在化的抗体量。
结果显示74-mCD20DNL复合体在与APC结合方面具有与单独hLLl相同的效率和特异性。
实例10.通过74_mCD20离体诱导h⑶20特异性免疫反应 将⑶34+人脐血细胞(HLA Al健康供体)肝内注入受辐照的新生 Rag2-/" Y C-/"小鼠以产生用于重组人适应性免疫系统(包括人T、B和DC细胞以及构建的一级和二级淋巴器官)的动物模型(Huff等，J Clin Oncol. 2008,26 :2895900 Jang和 Chang, Cancer Invest. 2008，26 :741-55)。这些小鼠被称为 Hu-Rag2_/- y c_/_ 小鼠。
为了评估由74-mCD20诱导的免疫反应，用74_mCD20或Ml_mCD20 (每个小鼠50yg)，结合或不结合用于体内DC成熟的CpG(每个小鼠50yg)，每周对在 Rag2-/" Y C-/"小鼠中重组的人⑶34+细胞免疫三次。在最后一次免疫之后五天，分离每个动物的脾细胞并用HLA配型MM癌干细胞重新刺激，用于产生细胞因子(INF- y )，通过用流式细胞仪的细胞内细胞因子染色进行评估。通过钙黄绿素AM释放试验评估针对MM癌干细胞的特异性细胞毒性，以MM癌干细胞为靶细胞。使用磁珠从MM细胞系RPMI182 中分离⑶20+MM癌干细胞。通过用醛脱氢酶染色来验证干细胞特性。结果表明74-mCD20能够在体内诱导抗hcd20特异性免疫反应。
实例11. 74-mCD20针对匪癌干细胞的治疗潜力通过hPBMC/NOD/SCID小鼠模型或继承性转移的体内评价。
体内评价74_mCD20的治疗效果的最佳方法是对可以同时支持MM生长以及人适应性免疫系统发育的动物模型进行免疫。因为人⑶34+细胞重组的Rag2-/_ y c-/_小鼠是有免疫能力的，其可能不支持MM生长，使用hPBMC/NOD/SCID小鼠模型检验74_mCD20对MM 干细胞的治疗效果。N0D/SCID 小鼠已被 Matsui 等(Blood 2004,103 :2332-6 ；Cancer Res 2008,68 :190-7)用于植入克隆源性多发性骨髓瘤干细胞。
N0D/SCID小鼠也被用于通过肿瘤细胞和hPBMC的共植入评价治疗效果。通过仔细地调节注入的细胞数量，这个模型可以同时支持肿瘤生长和hPBMC植入，并已被用于检验体内疫苗靶向DC-SIGN的效果。
用300cGy 照射四至六周龄雌性 N0D/SCID 小鼠(Jackson Laboratories, Barr Harbor ,Maine)(使用137Cs γ辐照器，別cGy/min)。12-16小时后，经由背侧尾部静脉注射分选的CD20+MM癌干细胞O百万个)。同时，对小鼠皮下注入人PBMC(3百万个)、未成熟 DC (30，000)和DNL疫苗的混合物。在某时间点(天)，将小鼠无痛处死，从长骨中收获骨髓，通过人⑶138+MM细胞染色来确定植入和治疗效果。
为了进一步评价74_mCD20的治疗潜力，采用通过继承性转移的替代方法来检验疫苗引发的针对匪干细胞的细胞毒性。人⑶34+细胞重组的Rag2-/_ y c-/_小鼠用 74-mCD20免疫，如上所述。收获脾细胞并经尾静脉注入植以⑶20+MM癌干细胞的N0D/SCID 小鼠内。在某时间点(天)，将小鼠无痛处死，从长骨中收获骨髓，通过人⑶138+MM细胞染色来确定植入和治疗效果。结果证实74-mCD20能够在体内诱导针对⑶20+MM干细胞的免疫反应。
实例12. DDD2-mPAP和DNL疫苗复合体的产生 根据实例4的方法由鼠前列腺酸性磷酸酶产生DDD2缀合的PAP异种抗原。前面已公开了基于树枝状细胞的通过PAP异种抗原的疫苗接种的效力(Rmg等，J Immunol 2001， 167 :7150-56)。如实例4所述构建DDD2_mPAP-pdHL2表达载体，并根据实例4所述在细胞培养物中表达DDD2-mPAP异种抗原融合蛋白。在NCBI数据库中(Accession No.AAF23171) 公开了例如鼠前列腺酸性磷酸酶序列。如实例4所述，DDD2-mPAP-6His融合蛋白被表达并通过固定化金属亲和色谱法(IMAC)纯化。
根据实例5的方法来制备包含一个CH3-AD2-IgG-hLLl (抗⑶74)的拷贝和四个 DDD2-mPAP的拷贝的DNL构建体。hLLl IgG部分包含连接于hLLl IgG的每个重链的C末端的AD2序列。通过在含ImM还原谷胱甘肽的PBS中混合hLLl IgG_AD2和DDD2_mPAP来进行DNL反应。在次日，加入氧化的谷胱甘肽至2mM的最终浓度，24小时后在蛋白A柱上纯化反应混合物。两个DDD2-mPAP的拷贝连接于每个AD2部分，产生包含一个hLLl IgG部分和四个mPAP异种抗原部分的DNL复合体。
对患有前列腺癌的受试者施用DNL疫苗抗⑶74-mPAP诱导针对表达前列腺癌干细胞的PAP的免疫反应。所述免疫反应能有效地减少或消除受试者的前列腺癌细胞。
实例13. DDD2-mEGFR和DNL疫苗复合体的产生 根据实例4的方法由鼠EGFR产生DDD2缀合的EGFR异种抗原。前面已公开了 EGFR 异种抗原在诱导体液免疫反应方面的效力(Fang等，ht J Mol Med 2009，23 :181-88)。 如实例4所述构建包含鼠EGFR胞外域的DDD2-mEGFR-pdHL2表达载体，并根据实例4在细胞培养物中表达DDD2-mEGFR异种抗原融合蛋白。鼠EGFR序列公开在例如NCBI数据库中 (Accession No. AAG43241)。如实例4所述，DDD2_mEGFR-6His融合蛋白被表达并通过固定化金属亲和色谱法(IMAC)纯化。
根据实例5的方法来制备包含一个CH3-AD2-IgG-hLLl (抗CD74)(抗CD74)的拷贝和四个DDD2-mEGF的拷贝的DNL构建体。hLLlIgG部分包含连接于hLLl IgG的每个重链的 C末端的AD2序列。通过在含ImM还原谷胱甘肽的PBS中混合hLLl IgG_AD2和DDD2_mEGFR 来进行DNL反应。在次日，加入氧化的谷胱甘肽至2mM的最终浓度，24小时后在蛋白A柱上纯化反应混合物。两个DDD2-mEGFR的拷贝连接于每个AD2部分，产生包含一个hLLl IgG 部分和四个mEGFR异种抗原部分的DNL复合体。
对带有表达NSCLC的EGFR的受试者施用DNL疫苗抗⑶74_mEGFR诱导针对表达癌干细胞的EGFR的免疫反应。所述免疫反应能有效地减少或消除受试者的EGFR阳性癌细胞。
本领域技术人员会意识到，可以根据本文所述的技术构建和利用基于DNL的疫苗，所述疫苗结合了对应于各种肿瘤相关抗原的异种抗原部分。
43 在无需进行过度实验的情况下，可以根据本发明的内容制造和使用本文所公开并要求保护的所有组合物和方法。尽管已按照优选实施例描述了所述组合物和方法，但是对本领域技术人员显而易见的是，在没有背离本发明的构思、实质和范围的情况下，本文所述方法的步骤或步骤顺序的变化可应用于所述组合物和方法。更具体地说，化学和生理学相关的某些试剂可以代替本文所述的试剂，同时可以达到相同或相似的结果。对本领域技术人员显而易见的是，所有这种相似的替换和修改被认为在由所附权利要求书所限定的本发明的实质、范围和构思内。
权利要求
1.一种DNL (对接和锁定)抗癌疫苗复合体，包含a)与树突状细胞结合的抗体部分，其中所述抗体部分连接于DDD(二聚及对接域)部分，其中所述DDD部分具有来自蛋白激酶A的二聚及对接域的肽序列；和b)连接于AD(锚定域)部分的异种抗原部分，其中所述AD部分具有来自AKAP (A激酶锚定蛋白)的锚定域的肽序列；其中所述DDD部分形成二聚体，所述二聚体与所述AD部分结合以形成所述DNL复合体。
2.根据权利要求1所述的DNL复合体，其中所述抗体部分是抗CD74抗体或其抗原结合片段。
3.根据权利要求1所述的DNL复合体，其中所述异种抗原选自碳酸酐酶IX、甲胎蛋白、 α -辅肌动蛋白-4、A3、Α33 抗体特异性抗原、ART-4、Β7、Ba 733、BAGE、BrE3-抗原、CAl25、 CAMEL、CAP-I、CASP-8/m、CCCL19、CCCL21、CD1、CDla、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CDl 1A、CD 14、 CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、 CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54, CD55、CD59、CD64、CD66a_e、CD67、CD70、CD74、CD79a、 CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK_4/m、CDKN2A、结肠特异性抗原-P(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-U EGP-2、ELF2-M、 EpCAM、Flt-U Flt-3、叶酸盐受体、G250 抗原、GAGE、gplOO、GROB, HLA-DR、HMl. 24、人体绒毛膜促性腺激素(HCG)及其亚单元、HER2/neu、HMGB-l、缺氧诱导因子(HIF-I)、HSP70-2M、 HST-2、la、IGF-1R、IFN- y、IFN- α、IFN- β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、 IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、胰岛素生长因子-1 (IGF-I)、KC4 抗原、KS-I 抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/FUT、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、 MART-1、MART-2、NY-ESO-l、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、 MUC4、MUM-1/2, MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、PAM-4 抗体特异性抗原、胎盘生长因子、p53、 前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME, PSMA、PlGF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES, TlOU SAGE, S100、存活素、存活素 2B、TAC、TAG-72、腱生蛋白、TRAIL 受体、TNF- α、Tn 抗原、 TF(Thomson-Friedenreich)抗原、肿瘤坏死抗原、VEGFR、ED_B 纤连蛋白、WT-1、17-1A 抗原、 补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管生成标记物、bcl_2、bcl_6、Kras, cMET、致癌基因标记物和致癌基因产物。
4.根据权利要求2所述的DNL复合体，其中所述异种抗原是CD20。
5.根据权利要求1所述的DNL复合体，进一步包含所述DDD与AD部分之间的二硫键。
6.根据权利要求1所述的DNL复合体，其中所述DDD部分包含选自SEQID NO :11和 SEQ ID NO 10的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的DNL复合体，其中所述DDD部分包含氨基酸序列SEQID NO 11。
8.根据权利要求1所述的DNL复合体，其中所述AD部分包含选自SEQID NO 13, SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、 SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 26、SEQ ID N0:27 禾口 SEQ ID NO 28 的氨基酸序列。
9.根据权利要求8所述的DNL复合体，其中所述AD部分包含氨基酸序列SEQID NO13。
10.根据权利要求1所述的DNL复合体，其中所述抗体部分选自IgG抗体和抗原结合抗体片段。
11.根据权利要求10所述的DNL复合体，其中所述抗体部分是包含轻链可变互补决定区(CDR)序列 CDRl (RSSQSLVHRNGNTYLH ；SEQ ID NO 1)、CDR2 (TVSNRFS ;SEQ ID NO 2) 和 CDR3 (SQSSHVPPT ；SEQ ID NO 3)以及重链可变区 CDR 序列 CDRl (NYGVN ；SEQ ID NO 4)、 CDR2 (WINPNTGEPTFDDDi7KG ；SEQ ID NO 5)和 CDR3 (SRGKNEAWFAY ；SEQ ID NO 6)的人化或嵌合LLl抗CD74抗体或其抗原结合片段。
12.根据权利要求4所述的DNL复合体，其中所述CD20异种抗原部分包含氨基酸序列 SEQ ID NO :7。
13.根据权利要求4所述的DNL复合体，其中连接于DDD部分的抗CD74抗体部分形成第一融合蛋白，连接于AD部分的CD20异种抗原部分形成第二融合蛋白。
14.根据权利要求1所述的DNL复合体，其中所述DNL复合体用于抗癌疫苗，所述抗癌疫苗能够诱导针对CD138mgCD20+MM干细胞的免疫反应。
15.根据权利要求1所述的DNL复合体，其中所述抗体部分与选自⑶209(DC-SIGN)、 CD34、CD74、CD205、TLR 2 (铎样受体 2)、TLR 4、TLR 7、TLR 9、BDCA-2、BDCA-3、BDCA-4 和 HLA-DR的抗原结合。
16.一种DNL抗癌疫苗复合体，包含c)与树突状细胞结合的抗体部分，其中所述抗体部分连接于AD部分，其中所述AD部分具有来自AKAP (A激酶锚定蛋白)的锚定域的肽序列；和d)连接于DDD部分的异种抗原部分，其中所述DDD部分具有来自蛋白激酶A的二聚及对接域的肽序列；其中所述DDD部分形成二聚体，所述二聚体与所述AD部分结合以形成所述DNL复合体。
17.根据权利要求16所述的DNL复合体，其中所述抗体部分的每一重链在其C末端连接于AD部分，且所述复合体包含一个抗体部分和四个异种抗原部分。
18.根据权利要求16所述的DNL复合体，其中所述抗体部分与选自⑶209(DC-SIGN)、 CD34、CD74、CD205、TLR 2 (铎样受体 2)、TLR 4、TLR 7、TLR 9、BDCA-2、BDCA-3、BDCA-4 和 HLA-DR的抗原结合。
19.根据权利要求16所述的DNL复合体，其中所述抗体部分与CD74结合。
20.根据权利要求19所述的DNL复合体，其中所述抗体部分是包含轻链可变互补决定区(CDR)序列 CDRl (RSSQSLVHRNGNTYLH ；SEQ ID NO 1)、CDR2 (TVSNRFS ；SEQ ID NO 2) 和 CDR3 (SQSSHVPPT ；SEQ ID NO 3)以及重链可变区 CDR 序列 CDRl (NYGVN ；SEQ ID NO 4)、 CDR2 (WINPNTGEPTFDDDi7KG ；SEQ ID NO 5)和 CDR3 (SRGKNEAWFAY ；SEQ ID NO 6)的人化或嵌合LLl抗CD74抗体或其抗原结合片段。
21.根据权利要求16所述的DNL复合体，其中所述异种抗原选自碳酸酐酶IX、甲胎蛋白、α -辅肌动蛋白-4、Α3、Α33抗体特异性抗原、ART-4、B7、Ba 733、BAGE、BrE3抗原、CA125、 CAMEL、CAP-I、CASP-8/m、CCCL19、CCCL21、CD1、CDla、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CDl 1A、CD 14、 CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a_e、CD67、CD70、CD74、CD79a、 CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK_4/m、CDKN2A、结肠特异性抗原-P(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-U EGP-2、ELF2-M、 Ep-CAM、Flt-1、Flt-3、叶酸盐受体、G250 抗原、GAGE、gplOO、GROB, HLA-DR、HMl. 24、人体绒毛膜促性腺激素(HCG)及其亚单元、HER2/neu、HMGB-l、缺氧诱导因子(HIF-I)、HSP70-2M、 HST-2、la、IGF-1R、IFN- y、IFN- α、IFN- β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、 IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、胰岛素生长因子-1 (IGF-I)、KC4 抗原、KS-I 抗原、KSl-4、Le-Y、LDR/FUT、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE_3、MART-1、 MART-2、NY-ES0-1、TRAG-3、mCRP、MCP-U MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUCl、MUC2、MUC3、MUC4、 MUM-l/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、PAM-4抗体特异性抗原、胎盘生长因子、p53、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME, PSMA, PlGF, ILGF, ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES, TlOl、SAGE、 S100、存活素、存活素-2B、TAC、TAG-72、腱生蛋白、TRAIL受体、TNF-α、Τη抗原、TF抗原、肿瘤坏死抗原、VEGFR、ED-B纤连蛋白、WT-I、17-1Α抗原、补体因子C3、C3a、C3b、Cfe、C5、血管生成标记物、bcl-2、bcl-6、Kras, cMET、致癌基因标记物和致癌基因产物。
22.根据权利要求16所述的DNL复合体，其中所述异种抗原是CD20。
23.一种治疗癌症的方法，包括a)获得根据权利要求1所述的抗癌疫苗DNL复合体；以及b)对患有癌症的受试者施用所述复合体。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述癌症选自上皮癌、间质癌、血液系统癌、神经系统癌、癌瘤、黑色素瘤、肉瘤、神经母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、神经胶质瘤和骨髓瘤。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述异种抗原是CD20，且所述抗原部分是抗 CD74抗体或其抗原结合片段。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述癌症是B细胞癌。
27.根据权利要求沈所述的方法，其中所述癌症选自B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、弥漫性B细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、伯基特淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述癌症是多发性骨髓瘤。
29.根据权利要求23所述的方法，进一步包括对所述受试者施用一种或多种治疗剂。
30.根据权利要求39所述的方法，其中在施用所述抗癌疫苗DNL复合体之前或同时对所述受试者施用所述治疗剂。
31.根据权利要求四所述的方法，其中所述治疗剂连接于所述抗癌疫苗DNL复合体。
32.根据权利要求四所述的方法，其中所述治疗剂选自放射性核素、免疫调节剂、抗血管生成剂、细胞因子、趋化因子、生长因子、激素、药物、前体药物、酶、寡核苷酸、siRNA、促凋亡剂、光敏治疗剂、细胞毒素剂、化学治疗剂、毒素、其它抗体及其抗原结合片段。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述药物选自氮芥、乙撑亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲、吉西他滨、三氮烯、叶酸类似物、蒽环霉素、紫杉烷、C0X-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗生素、酶抑制剂、表鬼白毒素、钼配位络合物、长春花生物碱、取代脲、甲基胼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、激素拮抗剂、内皮他丁、紫杉酚、喜树碱、SN-38、阿霉素及其类似物、抗代谢物、烷化剂、抗有丝分裂物质、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、mTOR抑制剂、热休克蛋白(HSP90)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、HDAC抑制剂、促凋亡剂、甲氨蝶呤和 CPT-I1。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述毒素选自篦麻毒素、相思豆毒素、α毒素、 皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素Α、商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。
35.根据权利要求32所述的方法，其中所述放射性核素选自llUn、177Lu、212Bi、 213Bi、211At、62Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、lllAg、67Ga、142Pr、153Sm、 161Tb、152Dy、166Dy、161Ho、I66H0、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、 77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au、211Pb、58Co、 80mBr、99mTc、103mRh、109Pt、119Sb、189m0s、192Ir、219Rn、215Po、221Fr、217At、255Fm、 11C、13N、150、75Br、224Ac、1261、1331、77Br、113mIn、95Ru、97Ru5、103Ru、105Ru、107Hg、 203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、143Pr、57Co、51Cr、75Se、 201Tl、76Br 和 169%。
36.根据权利要求32所述的方法，其中所述酶选自苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、 δ -V型类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α -磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β -半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
37.根据权利要求32所述的方法，其中所述免疫调节剂选自细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、成血因子、集落刺激因子(CSF)、白介素(IL)、干扰素(IFN)、干细胞生长因子、促红细胞生成素、促血小板生成素、肿瘤坏死因子(TNF)、粒细胞集落刺激因子 (G-CSF)、粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-、和被称为“Si因子”的干细胞生长因子。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述细胞因子选自人生长激素、N-蛋氨酰人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、糖蛋白 促卵泡素(FSH)、促甲状腺素(TSH)、黄体化激素(LH)、胎盘生长因子(PlGF)、肝细胞生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘泌乳素、OB蛋白、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、缪勒氏管抑制物质、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、激活素、血管内皮生长因子、整联蛋白、促血小板生成素(TPO)、NGF-β、血小板生长因子、TGF-α、TGF-β、胰岛素样生长因子-I、胰岛素样生长因子-II、促红细胞生成素(EPO)、骨诱导因子、干扰素-α、 干扰素-β、干扰素-Y、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、IL-I、IL-I α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、 IL-21、11^-25、1^正、卩1^-3、厄洛替尼、血小板反应蛋白、内皮他丁3咿-0和LT。
39.根据权利要求28所述的方法，进一步包括诱导针对⑶138neg⑶20+MM干细胞的免疫反应。
40.根据权利要求28所述的方法，进一步包括诱导⑶138neg⑶20+MM干细胞的细胞凋亡。
41.根据权利要求28所述的方法，其中所述能有效地抑制或消除MM干细胞。
42.一种治疗癌症的方法，包括a)获得根据权利要求16所述的抗癌疫苗DNL复合体；以及b)对患有癌症的受试者施用所述复合体。
全文摘要
本发明涉及采用对接和锁定技术形成抗癌疫苗DNL复合体的方法和组合物。在优选的实施例中，抗癌疫苗DNL复合体包含与树突状细胞结合的抗体部分，如抗CD74抗体或其抗原结合片段，其连接于AD(锚定域)部分；和连接于DDD(二聚及对接域)部分的异种抗原，如CD20，其中两个DDD部分的拷贝形成与AD部分结合的二聚体，导致形成DNL复合体。该抗癌疫苗DNL复合体能够诱导针对表达异种抗原的癌细胞(如CD138negCD20+MM干细胞)的免疫反应，并且诱导癌细胞的细胞凋亡以及抑制其生长或将其消除。用于癌症治疗的对接和锁定(DNL)疫苗。
文档编号A61K39/00GK102186499SQ200980141590
公开日2011年9月14日 申请日期2009年8月20日 优先权日2008年8月20日
发明者C-H·张, D·M·古德伯格 申请人:Ibc医药公司