专利名称：：用于重症肌无力的治疗或预防疗法的疫苗的制作方法用于重症肌无力的治疗或预防疗法的疫苗本发明涉及至少具有与重症肌无力所涉及的乙酰胆碱受体的主要免疫原区域的互补序列的互补肽，更特别的，及其用于重症肌无力(特别是在宠物或人中)治疗或预防疗法的疫苗组合物。重症肌无力(MG)是一种神经肌肉疾病，其特征为骨骼肌的虛弱和疲乏。其本质缺陷为由于抗体介导的自身免疫攻击造成的神经肌肉接头处的可用乙酰胆碱受体(AChRs)数量的减少。在神经肌肉接头处，乙酰胆碱(ACh)在运动神经末梢中合成并储存于小嚢泡(quanta)中。当动作电位进行到运动神经并到达神经末梢时，ACh从150到200个小囊泡中释放出来并和密集填充于突触后折叠顶点中的AChRs结合。当ACh结合到AChR的结合位点上时，AGhRs中的通道打开了，允许阳离子(主要是钠)快速进入，产生肌纤维运动终板区域的去极化。如果去极化足够大，就能够启动动作电位，该动作电位沿着肌纤维传递，触发肌肉收缩。乙酰胆碱酯酶(AChE)水解ACh以及ACh扩散离开受体都能快速终止该过程。.在MG中，基本缺陷是突触后肌膜上的可用乙酰胆碱受体数量的减少。此外，突触后襞呈平扁的或者"简单化的，，。这些改变导致神经肌肉传递效率的下降。因此，虽然ACh释放正常，但是，释放的是小的终板电位，不能触发肌肉动作电位。在许多神经肌肉接头处的传递失败会导致肌肉收缩减弱。MG中的神经肌肉异常是由特异性抗AChR抗体所介导的自身免疫反应所引起的。抗AChR抗体被称为病原抗体，并能通过3种不同的机制减少神经肌肉接头处的可用AChRs的数量(l)通过一种涉及受体交联和快速胞吞作用的机制来加速AChRs的周转；(2)阻断AChR的活性位点，即，正常结合ACh的位点；和(3)通过抗体和补体，破坏突触后肌膜。病原抗体是IgG，并且是T细胞依赖的。临床证据表明自身免疫疾病MG和神经肌肉接头处存在这些病原抗体有关。到目前为止，只有少数几种既是症状治疗又是免疫治疗的疗法。这些长效的、但是需要相当多的临床操作的疗法能够给患者带来临床效果。此外，在许多患者中目前这些治疗方案只有部分疗效，并且大部分的患者需要改变生活方式。自身免疫疾病的理想疗法应该是通过消除或使自体反应细胞克隆无效来选择性地抑制免疫反应的病原部分(即，病原抗体)。将肽设计为自身免疫主要抗原的抗原受体模拟物(ARM)并进行免疫，对动物自身免疫疾病模型表现出异常显著的临床效果，参见美国专利号5212072。看来尽管它们是异源的，但是这种疗法诱使特异性针对这些免疫显性蛋白的自体反应克隆失效，并且使使针对其它附近抗原的响应变得迟钝。这意味着，使用外形和自身免疫主要抗原非常互补的肽疫苗可以引起抗原特异性的、抗原受体类型无差别的抗个体型(Id)反应。这些肽(被称为互补肽)能结合靶决定子，并且从某种意义上表现为抗原(Ag)受体的模拟物(ARM)。结果，当被用作疫苗时，它们诱导出针对某种自体反应淋巴细胞上的抗原结合位点的抗个体型(Id)和抗克隆型抗体(抗体)反应。因此，在大鼠上研究重症肌无力，可以用人工方法诱导出重症肌无力，即实验自身免疫重症肌无力(ExperimentalAutoimmunemyastheniaGravis，EAMG)。在EAMG中，用纯化的AChR免疫大鼠，发展出相似的疾病。根据概念抗原和抗体通过所谓的水疗互补发生相互作用，人们寻找利用和AChR的主要免疫原区域(MIR)互补的肽进行疫苗接种来诱导针对病原抗体的抗Id免疫的方法。已经发现受体AChR的主要免疫原区域是受体AChR的ex-链的61-76残基。互补肽被称为RhCA67-16。用结合在钥孔血蓝蛋白(KLH)上的互补肽RhCA67-16接种免疫大鼠。从免疫抗体结合，并且和KLH免疫以及未处理的对照的发病率(90。/。)相比，在那些接种疫苗大鼠中发病率显著降低(25。/。)，在患病动物中临床严重性评分平均为1.0，而阳性对照为3.5。此外，在疾病诱导过程中对大鼠被动给予(passiveadministration)单克隆抗Id抗体，也相似地降低EAMG发病率和严重程度[AragaA等人，PreventionofExperimentalAutoimmuneMyastheniaGravisbyaMonoclonalAntibodytoaComplementaryPeptidefortheMainImmunogenicRegionoftheAcetylcholineReceptor.JImmunol.157，386-392(1996)]。根据上述的用互补肽RhCA67-16进行疫苗接种的结果，得出如下结论免疫原和病原抗体的互补位具有结构相似性，因此可以将该疫苗看作B细胞Ag受体模拟物(ARM)。为了证实利用互补肽RhCA67-16所得到的结果，制备了第二批RhCA67-16肽。第二批肽显示出预期的理论分子量。在大鼠中再次检测了第二批RhCA67-16肽，但不幸的是，没有观察到以前获得的良好的疾病发病率结果。本发明的一个目标是提供一种具有抗原行为的肽，其能用于治疗哺乳动物重症肌无力，尤其是在宠物狗和人中(在猫中MG是无对照轶话的(anecdotal))。最后，本发明提供了一种互补肽，其特征为该互补肽至少具有位置8是色氨酸的SEQ.ID.N01序列，且所述色氨酸至少携带一个任意取代的烃基。有利的是，肽的序列和AChR的ct-链的61-76残基互补。至少具有和受体AChR的主要免疫原区域(MIR)互补的序列的肽是肽RhCA67-16。这种互补肽在位置8包含一个色氨酸。到目前为止还不太了解为什么，但是令人惊讶的是已经发现烃基对肽和针对病原抗体的抗Id抗体的结合具有决定性的作用，所述病原抗体以狗受体AChR的a-链61-76残基为靶点。的烷基，特别是任选地被取代的苯曱基，更优选的是被至少一个烃氧基取代的苯曱基，最优选的是2，4，6-三甲氧苯甲基。因为犬和人MG的特点是具有主要(68%)针对MIR(AChR的a-链61-76残基)的AChR抗体(病原抗体)反应，所以认为提供一种指向MIR的互补肽有可能是有益的，来获得能够用于治疗哺乳动物MG的治疗组合物，来进一步开发人疫苗。犬MG和人MG是非常相似的。该相似性包括该疾病的天然存在，人和狗共享环境，相似的临床表现，相关表位特异性的诊断AChR自身抗体，以及MG和其它自身免疫疾病的同患多病。因此本发明的另一个目标是提供一种治疗组合物，该组合物包含所述的至少具有SEQIDN01序列的互补肽的和至少一种栽体。如前面所述，在犬和人MG中，病原抗体靶向于AChR的MIR。通过提供一种和该MIR互补的肽，应该有可能诱导出指向于互补肽的抗体(抗独特型抗体)。该抗独特型抗体将具有和AChR的MIR相似的抗原结合位点，因为该肽和这种结合位点互补。因此，该抗独特型抗体将能够中和病原抗体，并将诱导出B细胞介导的反应。为了获得在哺乳动物中给出良好结果的组合物，需要优化该组合物。因此已经发现，在0.5ml磷酸盐緩冲液中，至少具有SEQIDNOl序列的肽的量的存在范围应该在750到25毫克之间，优选为500到50毫克之间，有益的是在IOO到50毫克之间。有益的是，有意将治疗组合物用作治疗或预防MG的疫苗组合物。该疫苗组合物优选包含佐剂和肽载体，用于增强免疫反应。因为该组合物意图增强B细胞介导的反应，所以使用已知的用于此目的佐剂是有用的。这种佐剂和载体是本领域技术人员所熟知的。示例性的佐剂可以是油包水佐剂，特别是TiterMax、Alum佐剂，弗氏(Freund)佐剂等。示例性的栽体可以是白喉类毒素、破伤风类毒素、钥孔血蓝蛋白等。在McAnallyJL，XuL，VillainM，BlalockJE.:Theroleofadjuvantsintheefficacyofapeptidevaccineformyastheniagravis.ExpBiolMed2001;226:307-311(在此处引用作为参考)中对这些用于大鼠MG治疗的佐剂和载体进行了详细描述。还有报道说在重症肌无力中T细胞免疫反应是活动的。事实上，病原抗体是IgG-T-细胞依赖的。因此，除了B-细胞介导的免疫反应所涉及的AChRa61-76区域以外，正在寻找应该存在被T细胞所识别的受体的另一个区域。在[AragaS.etal.，ApeptidevaccinethatpreventsexperimentalautoimmunemyastheniagravisbyspecificallyblockingT-cellhelp,FASEBjournalvol14，2000]中已经报道，在路易斯大鼠(Lewisrat)中特异性针对AChR的oc链100到116残基的T细胞帮助病原抗体的产生。AragaS.等人用和受体AChR的ot链100到116残基(被称为RhCA611-001)互补的肽免疫路易斯大鼠。观察发现，所得到的抗ARM抗体/抗原受体相互作用干扰自体反应T细胞，帮助并使自体反应B细胞无应答，因此减少AChR反应性自身抗体的滴度，导致显著的临床改善，死亡率降低和在路易斯大鼠中肌肉AChR水平的保持。和受体AChR的a链的100-116这些残基互补的肽是肽RhCA611-001，至少具有SEQIDN02序列。在大鼠中检测了这种肽，来确定包含和受体AChR的T细胞识别位点互补的肽的治疗疫苗组合物的潜力。已经发现，至少具有SEQIDN02序列的互补肽有可能成为用于MG的治疗性组合物的候选物。因此认为，在大鼠中联合使用互补B肽RhCA67-16和与T细胞识别位点互补的肽能够降低EAMG的发病率。不幸的是，(比较参见实施例3)在大鼠中联用这两种肽未能降低EAMG的发病率和严重程度(先后或同时使用)。在大鼠中，当同时给予两种肽时，平均严重程度和死亡百分率和至少具有SEQIDN02序列的肽相似，表明在大鼠中两种肽没有协同作用。虽然AChR在进化中是高度保守的，并且虽然T细胞免疫是高度物种依赖的，但是令人惊讶的是发现包含互补肽和至少一种栽体的组合物在狗中提供了增强的针对MG的效果，所述互补肽至少具有SEDIDN01序列，并且该肽至少具有SEQIDN02序列，该序列和乙酰胆碱受体的T细胞识别位点互补，并且至少一种载体在狗MG中提供了增强的效果。事实上，在狗中发现了B互补肽的和T互补肽的协同效果。考虑到至少具有SEQIDN02序列的肽和大鼠AChR的T细胞识别位点互补这个事实，该结果就更令人惊讶了。虽然AChR在进化中是高度保守的，但是大鼠和狗中的T细胞免疫应该是不同的。有利的是，SEQIDN02序列和乙酰胆碱受体的所述T细胞识别位点的ct链100到116残基互补。特异性针对受体AChR的ot链100到116残基的T细胞能帮助产生病原抗体。有利的是，疫苗组合物包含有每0.5ml磷酸盐緩冲液中含750到25微克，优选从500到50微克，有利的是从100到50微克的每种肽，所述肽至少具有SEQIDN01序列和/或SEQIDN(^序列，并至少含有一种佐剂。优选的，两种肽都和相同的或不同的肽载体偶联。根据本发明的不同的实施方案，包含两种肽的所述组合物包含第一种和第二种制剂。第一种制剂包含至少具有根据发明的SEQIDN01序列的肽，而第二种制剂包含至少具有SEQIDN02的肽。有利的是，第一种和第二种制剂各自都含有每0.5ml磷酸盐緩沖液中含从750到25微克，优选从500到50微克，有利的是从100到50微克的互补肽，并至少含有一种佐剂。优选的，每种制剂的肽都应该和合适的肽载体偶联。包含第一种和第二种制剂的组合物被提供用作疫苗组合物，用于哺乳动物MG的治疗或预防疗法，预计同时或先后给药每种制剂。在每个不同的实施方案中，提供该组合物用于诱导依赖B和T淋巴细胞的细胞介导的免疫的激活。该发明还提供了一种检测试剂盒，所述试剂盒包含至少具有SEQIDN01序列的互补肽，该肽用于检测重症肌无力的主要免疫原区的抗独特型抗体。至少具有SEQIDN01序列的肽有利的以肽复合体的状态存在，来用作酶联免疫吸附测定(Elisa)中的包被复合体，用于结合已经用根据发明的组合物免疫的宠物狗或人的血清中的抗独特型抗体。应该向Elisa板中的孔中加入标记有抗IgG的人或狗的碱性砩酸酶来显示结合，籍此用发色用底物检测抗Id抗体。另外，可以用辣根过氧化物酶标记抗IgG。在一个变体中，肽直接处于肽复合体状态，一方面该肽至少具有SEQIDN01序列，另一方面包含象碱性磷酸酶标记或过氧化物酶标记，用于检测抗独特型抗体的Elisa检测或蛋白质印迹(Westernblot)。本发明的目标还包括提供一种制备至少具有序列SEQIDN01的互补肽的方法，包括如下步骤-合成至少具有SEQIDN01序列的互补肽，并且-烃化位于所述SEQIDN01序列中位置8的色氨酸残基。本发明的目标还包括提供一种制备用于重症肌无力的药物的方法，包括如下步骤-合成至少具有SEQIDN01序列的互补肽，并且-用至少一种载体偶联至少具有SEQIDNOl序列的互补肽。本发明的进一步的目标还包括提供一种制备用于重症肌无力的药物的方法，包括如下步骤-合成至少具有SEQIDNOl序列的互补肽，-合成至少具有SEQIDN02序列的互补肽，并且-用至少一种栽体偶联两种互补肽。在一个不同的实施方案中，发明提供了一种制备用于重症肌无力的药物的方法，包括如下步骤-通过合成至少具有SEQIDN01序列的互补肽并和至少一种栽体偶联，制备第一种制剂，并且-通过合成至少具有SEQIDN02序列的互补肽并和至少一种栽体偶联，制备第二种制剂。有利的是，本发明的另一个目标涉及一种制备意图用于重症肌无力的治疗或预防应用的药物的方法，包括如下步骤-合成SEQIDNOl互补肽-合成SEQIDN02互补肽-将互补肽和载体偶联-将两种和载体偶联的互补肽和盐水溶液与佐剂混合。在附带的权利要求中对根据本发明的其它实施方案进行了进一步的描述。该发明还涉及一种在哺乳动物中治疗重症肌无力的方法，包括给予包含至少具有SEQIDNOl序列的互补肽的治疗性组合物和可任选的包含至少具有SEQIDN02序列的互补肽的治疗性组合物。如前所述，至少具有SEQIDNOl序列的互补肽和重症肌无力(MG)的乙酰胆碱受体(AChR)的ct链的主要免疫原区(MIR)的61-76残基互补。乙酰胆碱受体的oc链的61-76残基(AChRct61-76)的序列如下NH2-lte-AspA/al-Arg-Leu-Arg-Trp-Asn-Pr0-Ala-Asp-Tyr-Gly-Gly-lle-Lys和AChRoc61-76互补的肽具有如下序列，并被称为RhCA67-16:Asn-lle-His-Pro-Lys-Ala-PrO"Ne-Trp-Gly-lle"lle>Thr-Ser-Asn-Phe-NH2因此，SEQIDNOl如下NH2"Phe-Asn-Ser-Thr-lle-lle-Gly-Trp-lle-Pro-Ala-Lys-Pro-His-lle-Asn在Biosearch肽合成仪(9500型)上使用f-moc化学来合成至少具有SEQIDN01序列的肽，并使用反相高效液相色镨进行纯化，釆用DynamaxC18300埃15|^柱(19x300mm)，釆用90%H20(0.1%三氟乙酸)/10%乙腈(0.1%三氟乙酸)到10%H20(0.1%三氟乙酸)/90%乙腈(O.1%三氟乙酸)的梯度，60分钟以上，流速-5ml/min，保留时间为39-42分钟，带有2，4，6-三甲氧苯甲基的肽的分子量为1988。AChRot61-76的ARM肽RhCA67-16在位置8包含一个经化的色氨酸，优选烷基化或芳基化。适合这种烃化的烃基可选自于任选地被取代的芳基和任选地被取代的烷基，尤其是任选地被取代的苯甲基，优选被至少一个烃氧基所取代的苯甲基，更优选的是2，4，6-三甲氣苯甲基。优选的，所述烃基为2,4,6-三甲氧苯甲基，并且化学序列如下PC、NH-H^Asn-Ser-Thr-IleJle^Gly—jf—fl&Pro^Ala-Lys-ProHis-Il&Asn-COOHH0合成B细胞肽，并在酸性条件下(例如在用三氟乙酸洗脱过程中)将肽从固相支撑物上切下的时候通过加上Tmob将2，4，6-三甲氧苯甲基加到位置8上的色氨酸上。所述烃化，尤其是肽的芳基化发生于酸性条件下并存在Tmob的情况下将肽从固相支撑物上切下的过程中。如前所述，将肽RhCA67-16偶联到作为载体蛋白的匙孔戚血蓝素(KLH)上。使用戊二醛交联将KLH偶联到B细胞肽上，来保持KLH和肽的化学、物理和生物特征。将B细胞肽和载体蛋白(KLH)加入到戊二醛溶液中。反应如下H/HB细胞1,+0-CCH2CH2CH2C=0+2HN-KLH+B细胞肽-N-CCH2CH2CH2C-N-KLH+2H20戊二醛不以自由形式和蛋白质或肽反应，而是以具有被共轭所稳定的亚胺键的不饱和聚合物的形式和蛋白质或肽反应。根据发明，载体蛋白可以是前面提到的KLH，但是必须理解的是，也可以使用其它的载体蛋白，例如，白喉类毒素或破伤风毒素或任意的具有蛋白质性质的大分子，作为肽的支撑物，使肽不是孤单的并且太小。因此，带有载体蛋白的肽不会被免疫系统立即破坏掉，并且具有更强的免疫原性。本领域技术人员还应该，两种肽(B细胞肽和T细胞肽)可以偶联到具有相同的或不同特性的相同的或不同的载体蛋白上。对于本研究，在狗中进行了临床试验。单次给药的疫苗包含在0.5ml磷酸盐緩沖盐水中含500微克肽RhCA67-16—KLH结合物，在O.5ml的油包水佐剂中乳化，优选TiterMaxS佐剂(美国TiterMax公司，Norcross，GA)。具有SEQIDNO2序列的肽和AChR的cc链的T细胞抗原表位(100-116残基)互补。在Biosearch肽合成仪(9500型)上使用f-moc化学来合成该肽，并使用反相高效液相色镨进行纯化，采用DynamaxC18300埃15p柱(19x300mm),釆用90%H20(0.1%三氟乙酸)/10%乙腈(0.1%三氟乙酸)到10%H20(0.1°/。三氟乙酸)/90%乙腈(0.1%三氟乙酸)的梯度，60分钟以上，流速=5ml/min，保留时间为18-20分钟，分子量为2036。具有SEQIDNO2序列的互补肽具有如下序列NHjrTyr-Phe-Ser-Arg-lle-lle-Gln-Lys-Gln-Phe-Gly-His-Val-Asn-Asn-Gly-Lys如前所述，在大鼠中被单独检测了在此处还被称为B-肽的肽RhCA67-16和在此处还被称作T-肽的肽RhCA611-001。结果表明单独的B-肽或T-肽都使病原抗体水平显著下降。在未发表的实验中，在大鼠中进行检测时，和单独给予T肽相比，B和T-肽一起不能给予病原抗体水平更好地结果。这些结果表明在大鼠中使用两种肽时没有协同效果。本发明提供的在狗中的结果表明，在狗中以同时或先后给药的方式使用两种肽时，出现了意外的协同效果。在下面的非限制性实施例中将进一步详细描述本发明。实施例l.-材料和方法.在这个实验中，募集了29只被诊断为自身免疫MG并用已有的临床放射免疫检测具有阳性AChR抗体滴度(>0.6nM)的狗。5只动物(17%)死于吸入性肺炎，一只在完成疫苗接种之前进行的胸腺瘤手术之后迅速死去。本实验的死亡率和以前报告的历史对照的死亡率6/35(17%)和2/12(17%)相当。3只狗未能随访，4只狗因不顺从而退出实验；一只因为免疫部位的皮肤反应，在完成疫苗接种之前被其主人退出实验。5只动物在诊断后和疫苗接种前出现自发的病情緩解现象。因此，IO只狗(5只雄性和5只雌性，1到IO年年龄)完成了实验，这些动物都没有胸腺瘤，都没有接受皮质激素或其它免疫抑制剂。对于这些动物，从临床症状发作到采用AChR抗体检测进行确诊之间的时间为2到4周。緩解被定义为，在没有使用乙酰胆碱酯酶抑制药的情况下，AChR抗体滴度长期恢复到临床常态正常范围(<0.6nM)。暂时緩解指的是，在MG完全消退以及AChR抗体长期恢复到正常值之前，一次或多次检测出AChR抗体滴度低于0.6nM。宠物的主人给予了征得同意，并且该实验获得了佛罗里达大学实验动物管理和使用委员会(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee)的批准。表l列举了实验中使用的不同的疫苗组合物。表l:狗实验组合物<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>在狗临床试验中，在最少4个部位皮下给药组合物。对于特定动物，在确诊到诊断后4个月内进行最初的疫苗接种。以2周的间隔对动物进行免疫和增强。本发明的目标是对比评价前面提到的T和B细胞疫苗降低AChR抗体水平的能力和在宠物狗原发自身免疫MG中进行的历史对照(SheltonGDetal.，Neurology2001;(57):2139-2141)。这次未包括用处于佐剂中的栽体蛋白(没有ARM肽)免疫的肌无力宠物狗对照组，因为根据未偶联互补肽的载体蛋白(在0.5ml磷酸盐緩冲液和佐剂中)的大鼠EAMG实验，该对照组有可能缺乏效果(AragaS，等人)。使用Instat生物统计软件(GraphPadsoftware,SanDiego，CA)进行了所有的统计分析。为了比较不同组之间的血清抗体值和緩解时间，使用非配对t检验，除非因数据集的限制需要使用非配对t-检验(带有Welch校正)或秩和检验(Mann-Whitneytest);零假设为疫苗接种不能降低AChR抗体滴度或緩解时间。对于疫苗接种前和接种后的血清抗体滴度分析，使用配对t-检验。对于终末点评价，例如緩解统计，进4亍了歹iJ联表(contingencytable)分才斤，以及Fisher精确检验(Fisher'sexacttest)。结果预期结果前瞻性研究的历史对照组包含40只具有两种性别的肌无力狗，对其中35只进行了长期随访，结果已知。已经鉴定出这些动物在152只患有原发性食管扩张的狗队列中为AChR抗体阳性。将这些动物和结果已知的我们实验中的20只狗(除了胸腺瘤手术后死亡的动物以外)进行了比较。利用相同的兽医服务(UCSanDiego，ComparativeNeuromuscularLaboratory)，对所有的狗(历史对照和本实验)进行了AChR抗体检测。表2.接种疫苗的肌无力狗和历史对照的预期结果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>A:p<0.0001，B:p=0.0044，C:p=0.0022，和D:p=0.504，都是Fisher氏精确检验。每个比较都考虑了具有指征结果的狗相对于组中其它所有的狗。表2表明，和历史对照相比，在我们的群体中死于吸入性肺炎或气哽的动物数量没有显著差异(分别为17%vs.25%)。在我们的实验中，20只狗中的5只在诊断后和接种疫苗之前出现自发性緩解，长期AChR抗体水平降到正常水平(〈0.6nM)。因此，在这两组之间，自发行緩解也没有显著差异(25%vs.17%)。这些结果表明，这两个队列是非常匹配的。一个显著差异是实施安乐死的动物的数量。在历史对照组中，12只狗(34%)因为预后不良而给予安乐死。在根据发明的临床试验中，没有动物被实施安乐死。两组的总长期緩解率有高度明显的差异。在历史对照组中，35只狗中只有6只(17°/。)緩解，AChR抗体水平恢复到正常水平，在20只接种疫苗的狗中有75%緩解。除去死于吸入性肺炎或安乐死而只考虑生存下来的动物，历史对照组的緩解率为35%(6/17),而本实验的緩解率为簡(15/15)(p〈O.OOOD。这个增加的緩解率完全是因为在IO只接种疫苗的狗中有IO只狗出现了緩解。如果我们考虑历史对照的可能的最好情况和接种疫苗动物的可能的最坏情况，緩解仍然是显著增加了。特别的，如果假设对照组中未能随访的5只狗出现緩解(40只中有11只緩解，27.5%)，而假设我们实验组中的未能随访或退出实验的9只狗没有緩解U9只狗中15只緩解，51.7%)，疫苗接种仍然引起緩解率的统计学显著的增加(p=0.0482，Fisher精确检验)。和犬MG的自发緩解相比，疫苗接种导致緩解加速。对有47只自发緩解的肌无力狗的历史对照组进行了回顾分析，并在几个重要方面和10只接种疫苗的动物进行了比较。两组中的狗都未接受皮质类固醇或其它免疫抑制剂的处理；以相同的兽医服务进行了AChR抗体检测；从接种疫苗的狗出现临床征兆到确诊的时间为2到4周，该时间处于历史对照的时间段(1到5周)之内；并且两组具有大致相当的雄性和雌性比例，相似的年龄范围，并且在重叠的时期进行了实验(历史对照，1990-2000，而接种疫苗动物，1997-2003)。有趣的是，在评估历史对照的数据集时，观察到AChR抗体水平跟随两个过程中的一个。一些狗出现导致緩解的AChR抗体水平单相下降，而其它的狗在长期緩解前显示AChR抗体水平的上下波动。在接种疫苗的狗中，AChR抗体水平随时间变化情况也分为上述相同两组中的一个或另一个(见下)。因此适当的分析要求应该在组间进行比较。图1(上图)显示了狗在确诊时显示出单相下降，在接种组(n-5)和历史对照(n=40)之间，AChR抗体水平没有统计学显著的差异。但是，接种组显示出AChR抗体滴度下降加速通过在接种组中的更快速率的緩解反映了这一点。(图1，中图)。接种组中的这种加速緩解在3个月时间点处最明显，根据Fisher精确检验，接种疫苗的狗vs.对照的緩解相对可能性为3.56(p-0.019)。图2显示了确诊后历史对照(2a)和接种疫苗的动物(2b)的AChR抗体水平与时间的关系，显示了自身抗体浓度的波动。虽然初始AChR抗体滴度(nM±SEM)在接种疫苗的狗(5.98±2.33)和历史对照(4.54土1.4)之间没有显著差异，但是，接种疫苗的狗在诊断后时间里波动总振幅出现了显著的减少。相反，两组的长期緩解的平均时间是相同的。因此，这意味着虽然两组的疾病持续时间是相同的，但是接种疫苗的狗在疾病进程中处于緩解中的时间更长。这被如下观察所支持接种疫苗的狗100%(5/5)在疾病完全消退之前至少具有一段緩解时期，相比之下历史对照为29%(2/7)。为了确保暂时恢复到正常AChR抗体水平的动物的增多不是因为相对于历史对照更频繁地对接种组进行取样所造成的(以3个月的间隔取样)，只考虑诊断后3个月间隔的AChR抗体水平。该结果显示，5/5只接种疫苗的狗和2/7只历史对照在接种疫苗后和疾病完全消除之前具有至少一个AChR抗体处于正常范围(<0.6nM)内的血样。总体上，在5只接种疫苗的狗中出现8次正常AChR抗体滴度[l只狗3次，l只狗2次，3只狗1次]，相对而言，在7只历史对照中出现3次[l只狗2次，1只狗1次，5只狗0次]。因此，在接种疫苗的动物中，每3个月间隔每只狗出现暂时緩解的平均次数显著高于历史对照(P〈0.0251，曼-怀二氏检验)(图2d)。在MG长期消退之前，并考虑所有可用的血样(不仅是3个月的间隔)，对应于疫苗接种过程的起始，在5只具有震荡的AChR抗体水平的接种疫苗的狗中有4只出现一次以上的暂时緩解(2只动物发作3次，2只动物发作2次，总共10次)。图3(上图)显示了疫苗接种过程起始时间和后续緩解期开始时间之间的高度显著的相关性(r-O.955，p<0.0001)。因此，暂时性的，疫苗接种和暂时緩解具有非常强的相关性，并且不依赖于相对于诊断什么时候开始进行的疫苗接种。重要的是，这种关系的Y截距为2.4个月，非常接近地对应于AChR抗体滴度显示单相下降(图1，下图)的接种疫苗的狗的緩解平均时间(2.35±0.96个月)。当以接种疫苗和緩解之间的时间分析该数据时，緩解平均时间为1.775±0.43个月(上、下95。/。CI分别等于0.805和2.745)。这和接种疫苗并显示单相下降(图1,下图)的狗的平均緩解时间没有统计学显著的差异。因此，如果不考虑AChR抗体水平模式，接种疫苗会导致非常相似的緩解时间，表明两个过程涉及相似的才几制。在再次取样时间里(2到4周)，在所有的AChR抗体滴度波动的5只狗中观察到了单次接种疫苗事件和AChR抗体水平的降低之间还存在着的定量关系。在35次疫苗接种事件中，28(80%)次导致AChR抗体滴度的降低(图3,下图)。没有降低AChR抗体水平的7次疫苗接种事件分布于5只动物中，其中3只被观察到每只都有1次，2只被观察到每只都有2次。总体上，平均AChR抗体水平从疫苗接种之前的1.63±0.21下降到疫苗接种之后的1.14±0.17nM(P-O,0015，双尾配对t检验)。T和B细胞疫苗联合给药优于其先后给药。采用两种方法中的一种进行疫苗接种程序。同时给予T和B细胞疫苗，或者以2周间隔给予3次T-细胞疫苗并随后以2周间隔给予3次B-细胞疫苗。因为显示出单相下降的狗的疫苗接种到长期緩解的平均时间(2.35个月，图l)和具有波动AChR抗体水平的狗的疫苗接种过程起始到后来的暂时緩解的平均时间(2.4个月，图3)没有差别，并且在后一组中所述时间和诊断后接种疫苗的时间无关，所以，有可能对两种疫苗接种流程进行比较，而不用考虑AChR抗体水平的模式。图4的上图显示，从开始进行疫苗接种到第一次緩解(长期的或暂时的)的平均时间接近显著性。=0.0639，带有Welch校正的非配对t-检验)，并且同时给予T和B细胞疫苗比先后给药快2.7倍。此外，先后给予疫苗时，在7只动物中只有4只在单独接受T-细胞疫苗后表现出緩解。并且，平均来说，为了获得緩解，和同时(2.67±0.333)给予T和B细胞疫苗相比，先后给药(3.86士1.06)需要对每只动物进行更多次的疫苗接种。当我们将获得緩解的T和/或BARM疫苗的数量作为因子，并考虑緩解时间，和先后给予疫苗相比，同时给予疫苗的每次给药的緩解时间出现了显著下降(p-O.0167，双尾曼-怀二氏检验)(图4，下图)。因此，看来获得最佳效果需要一起给予两种疫苗。因为在两种疫苗接种流程中使用相同的佐剂(Tite^Max)和栽体蛋白(KLH)，所以佐剂和载体蛋白不太可能影响效果。如果这样，对于两种流程，给予等量的疫苗后有可能观察到相近的到第一次緩解的平均时间。因此，疫苗效果依赖于T和BARM肽，而不依赖于佐剂和栽体，并且在狗自发MG中，我们发现联合使用B和T-细胞疫苗能有效地加速緩解。50%的动物緩解的平均时间为2个月。该平均緩解时间比历史对照快3.2倍(6.4个月)。实施例2:在路易斯大鼠中的比较实施例用纯化的AChR免疫路易斯大鼠来发展出实验自身免疫M.G.。随后用偶联到钥孔血蓝蛋白(KLH)上的B和T-肽处理路易斯大鼠。来自于接种有互补肽的动物的血清和制备品都显示出和病原抗体结合。和用KLH免疫的动物以及未处理的对照的发病率(90。/。)相比，使用B-肽组合物，接种疫苗的动物的发病率(25%)大幅降低，而在接种疫苗的动物中患病动物的临床严重度得分平均为0.25，相比之下阳性对照为1.3。和用KLH免疫的动物以及未处理对照的发病率(89%)相比，使用T-肽组合物，接种疫苗的动物的发病率(55。/。)也下降，而在接种疫苗的动物中患病动物的临床严重度得分平均为1.2,相比之下阳性对照为2.5。此外，在疾病进程中对大鼠进行单克隆抗-Id抗体的被动注射能诱导相似的EAMG发病率和严重度降低(Araga等人，1996)。该结果显示于表3。表3.ARM疫苗用于EAMG的动物模型实验的结果汇总EAMG疾病发生率疾病严重度对照(n)处理(n)对照(n)处理(n)B-肽组合物90°/"39)25%(16)1.3(39)0.25(39)T-肽组合物89%(18)55%(18)2.5(18)1.2(18)实施例3.-:在路易斯大鼠中的比较范例为了评价对于实验性自身免疫重症肌无力(EAMG),—起接种T-肽和带有烃基的B-肽是否能够引起和单独以及分别用带有烃基的B-肽或T-肽进行注射所不同的效果，用钥孔血蓝蛋白(KLH)或偶联到KLH上的T-肽或带有烃基的B-肽单独地或者联合地免疫路易斯大鼠3次。随后用纯化的TorpedoAChR进行诱导，并监测疾病。结果列于表4中，其中可以看到，和用KLH免疫的对照大鼠相比，单独的T-肽或B-肽能够降低EAMG发病率，严重度和死亡率。和单独给予两种肽疫苗相比，同时接种T-肽和B-肽能引起微小的并且是统计学不显著的好处。因此，在路易斯大鼠中，同时接种T-肽和B-肽既不增加也不降低单独的两种肽疫苗的效果，表明在大鼠中这两种肽没有协同效果。表4疫苗严重度平均严重度死亡率(％)EAMG发病率01234(%)32142.00±0.5840.0070.00T-肽4321.22±0.5522.2255.56B-肽42121.33±0.5522.2255.56T和B-肽52121.20±0.5120.0050.00结果，犬和人MG，以及大鼠中的EAMG都具备如下特征具有主要(68。/。)针对MIR的AChR抗体反应。此外，MIR-特异性-抗体能被动传递肌无力表型。考虑到这些以及在大鼠EAMG中B-细胞疫苗能够诱导针对MIR-特异性-抗体和B-细胞的抗独特型抗体反应、降低AChR水平和緩解疾病的能力，所以这种疫苗在狗中能够降低AChR抗体的水平也就不是特别令人惊讶了。在大鼠EAMG中以及在人MG中的主要抗-MIR抗体反应相关的自发获得性犬MG中的这种效果，表明了B-肽在人疾病中的潜在效用。事实上，已经报道在40%的MG患者中有针对AChR抗体的天然发生的抗独特型抗体，并且其存在还伴随有较低的抗AChR抗体滴度和临床改善。此外，被设计为针对AChR的占优势的T-细胞表位的路易斯大鼠疫苗在狗中也明显有效。一个可能的原因是，针对T细胞疫苗的抗克隆型抗体通过和它们的T-细胞受体相互作用可以诱导或扩大新描述的和天然发生的CD25+CD4+调节T-细胞。如果该情况属实，这些细胞将特异性地和AChRot100-116反应，但是将会而非特异性地抑制其它的针对神经肌肉接头AChR的更多优势表位的自身反应T-细胞。该机制如果发生作用，将说明该疫苗可以象对犬MG—样对人也有效。在第二种物种中的这些阳性结果增加了最终在人中应用这些疫苗及其栽体/佐剂的希望。如果产生和本研究相同的结果，那么ARM疫苗有可能成为能使自身免疫疾病长期緩解的新型靶向疗法。对于在人中的预防或治疗疗法，适于人类使用的最好的载体和佐剂已被确定。使用和将来用于人中相同的肽进行了所有的动物实验，并且是本应用的对象。在实验中，它们被偶联到不同的载体上并和不同的佐剂联合。已经证实，栽体和佐剂是必要的，但是它们的真实本质不是最重要的。已经进行实验证实了在实验室动物实验中，联合使用适用于人体的载体和佐剂具有和易于操作和使用的载体和佐剂相同的效果，甚至效果更好(McAnallyJ.L.等人，2000)。表5:B-细胞Arm疫苗和不同的载体蛋白和佐剂联用预防EAMG<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>和KLH/铝相比，DT/铝联用给出了更快峰值反应，并且表对EAMG效果稍微更强一些(McAnally等人，2000)。虽然公开了发明的优选实施方案来用以进行说明，但是本领域技术人员应能理解，不同的修改，增加或替代是可能的，只要未脱离附属的权利要求所公开的发明的范围和精神。权利要求1.至少具有与重症肌无力所涉及的乙酰胆碱受体的主要免疫原性区域互补的序列的互补肽，其特征为所述互补肽至少具有在位置8是色氨酸的SEQ.ID.NO1序列，所述色氨酸至少携带一个任选地被取代的烃基。2.根据权利要求1的互补肽，其中所述的至少一个任选地被取代的烃基优选为任选地被取代的芳基或任选地被取代的烷基，特别是任选地被取代的苯甲基，更优选的是被至少一个烃氧基取代的苯甲基，最优选的是2，4，6-三甲氧基苯甲基。3.根据权利要求1的互补肽，其中SEQIDN01序列与所述的乙酰胆碱受体的主要免疫原区域的oc-链61到76位残基互补。4.治疗性组合物，其包含根据权利要求1的互补肽和至少一种载体。5.治疗性组合物，其包含根据权利要求1的互补肽和至少具有SEQIDN02序列的互补肽以及至少一种载体，所述的SEQIDN02序列和乙酰胆碱受体的T细胞识别位点互补。6.根据权利要求5的治疗性组合物，其中SEQIDN02序列和所述的乙酰胆碱受体的T细胞识别位点的oc-链100到116位残基互补。7.根据权利要求5的治疗性组合物，其包含第一种和第二种制剂，第一种制剂包含所述的至少具有SEQIDN01序列的互补肽和至少一种载体，第二种制剂包含所述的至少具有SEQIDN02序列的互补肽和至少一种载体。8.根据权利要求4的治疗性组合物，包含750到25微克，优选500到50微克，更优选的是100到50微克的所述的至少具有SEQIDN01序列的互补肽，所述互补肽在具有至少一种佐剂的0.5ml的磷酸盐緩冲液中。9.根据权利要求5的治疗性组合物，包含750到25微克，优选500到50微克，更优选的是100到50微克的每种互补肽，所述互补肽在0.5ml的磷酸盐緩沖液和至少一种佐剂中。10.根据权利要求7的治疗性组合物，其中第一种制剂包含750到25微克，优选500到50微克，更优选的是100到50微克的至少具有SEQIDNOl的互补肽，所述互补肽在0.5ml的磷酸盐緩沖液和至少一种佐剂中，并且第二种制剂包含750到25微克，优选500到50微克，更优选的是IOO到50微克的具有SEQIDN02的互补肽，所述互补肽在0.5ml的磷酸盐緩沖液和至少一种佐剂中。11.根据权利要求4的组合物在制备用于哺乳动物重症肌无力的治疗或预防疗法的疫苗中的用途。12.根据权利要求11的用途，其中所述疫苗诱导依赖B淋巴细胞的细胞介导的免疫的激活。13.根据权利要求5的组合物在制备用于哺乳动物重症肌无力的治疗或预防疗法的疫苗中的用途。14.根据权利要求13的用途，其中所述疫苗诱导依赖B和T淋巴细胞的细胞介导的免疫的激活。15.根据权利要求7的组合物在制备用于哺乳动物重症肌无力的治疗或预防疗法的疫苗中的用途，同时或先后给予所述的第一种和第二种制剂。16.根据权利要求15的用途，其中所述疫苗诱导依赖B和T淋巴细胞的细胞介导的免疫的激活。17.包含根据权利要求1的互补肽的检测试剂盒，用于检测重症肌无力的主要免疫原区域的抗独特型抗体。18.制备所述至少具有根据权利要求1的SEQIDNOl序列的互补肽的方法，包括步骤-合成至少具有SEQIDN01序列的互补肽，并且-烃化位于所述SEQIDNOl序列中位置8的色氨酸残基。19.制备用于重症肌无力的药物的方法，包括步骤-合成根据权利要求1的至少具有SEQIDNOl序列的互补肽，并且-将至少具有SBQIDN01序列的互补肽与至少一种载体相偶联。20.制备用于重症肌无力的药物的方法，包括步骤-合成根据权利要求1的至少具有SEQIDNOl序列的互补肽，-合成至少具有SEQIDN02序列的互补肽，并且-将这两种互补肽和至少一种载体混合。21.制备用于重症肌无力的药物的方法，包括步骤-通过合成根据权利要求1的至少具有SEQIDNOl序列的互补肽并和至少一种载体偶联，来制备第一种制剂，并且-通过合成至少具有SEQIDN02序列的互补肽并和至少一种载体偶联，来制备第二种制剂。22.在哺乳动物中治疗重症肌无力的方法，包括给予根据权利要求4到7中任一项至少具有治疗性组合物。全文摘要本发明涉及至少具有重症肌无力所涉及的乙酰胆碱受体的主要免疫原区的互补序列的互补肽，其特征为该互补肽至少具有位置8为色氨酸的SEQ.ID.N01序列，该色氨酸至少携带有一个任意取代的烃基。包含根据发明的互补肽的治疗性组合物，及其在制备用于治疗或预防哺乳动物重症肌无力疗法的疫苗中的使用。文档编号A61K39/00GK101443035SQ200680054482公开日2009年5月27日申请日期2006年3月23日优先权日2006年3月23日发明者E·J·布拉洛克,S·P·胡伯提申请人:库拉瓦克公司