用于癌症治疗的具有减弱的对adi-peg 20抗体的交叉反应性的精氨酸脱亚胺酶的制作方法
【专利说明】用于癌症治疗的具有减弱的对ADI-PEG20抗体的交叉反 应性的精氨酸脱亚胺酶
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请根据35U.S.C. § 119(e)要求2013年3月15日提交的美国临时申请 No. 61/790, 833的优先权，其全文W引用的方式并入本文中。
[0003] 关于序列表的声明
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[000引发明背景
技术领域
[0006] 本发明一般设及精氨酸脱亚胺酶（ADI)蛋白，其包括具有减弱的与ADI-PEG20抗 体的交叉反应性的ADI蛋白。此类ADI蛋白用于治疗精氨酸依赖性或相关疾病（如癌症）。
[0007] 相关技术描述
[0008] 氨基酸阻断治疗可为一些形式的癌症的有效治疗。到目前为止，已知与此方法相 关的一例临床实例，其应用了天冬酷胺酶来降低天冬酷胺的循环水平并抑制蛋白合成。此 治疗对于急性淋己细胞白血病尤其有效（Avramis2005,VieraPinheiro2004)。急性淋己 细胞白血病细胞的生长和增殖需要氨基酸天冬酷胺。相比之下，大多数正常人类细胞能够 合成天冬酷胺而不受天冬酷胺消耗影响。因此，利用天冬酷胺酶减少血清天冬酷胺可选择 性地杀死癌细胞而不会伤害正常细胞、组织和宿主。一种大肠杆菌源的天冬酷胺酶已被证 明可用于人体使用。然而，仅于微生物中发现天冬酷胺酶；运就使其在人体中有强烈的免疫 原性，而且在注射后具有短的血清半衰期（Avramis2005)。为了使天冬酷胺酶成为更有效 的药物，通过将大肠杆菌源天冬酷胺酶与聚乙二醇（PEG) -起配制来减弱此酶的免疫原性 和相关的过敏反应来最大程度地降低运些不足。此外，PEG极大地延长了天冬酷胺酶的循 环半衰期，运减少了治疗频率和治疗总费用。PEG配制的天冬酷胺酶被批准使用并W商品名 Oncaspar? (Oncaspar礙 2011、Avramis2005、VieraPinheiro2004、化 2007、Zeidan 2008)出售。
[0009] 精氨酸是人和小鼠中的另一个非必需氨基酸（综述参见Rogersl994)。在人体 内，可由瓜氨酸通过Krebs(克雷布斯）（尿素）循环酶精氨班巧酸合成酶（ASS，k瓜氨 酸：k天冬氨酸连接酶[AMP-生成]，EC6. 3. 4. 5)和精氨班巧酸裂解酶（A化，k精氨班巧 酸精氨酸-裂解酶，EC4. 3. 2.)分两步合成精氨酸化aines2011、Wu2009、Morris2006、 Husson2003、Tapiero2002、Rogers1994)。ASS催化瓜氨酸和天冬氨酸至精氨班巧酸的 转化，然后精氨班巧酸通过A化转化为精氨酸和富马酸。人的精氨酸缺乏饮食既不会引起 高血氨症、乳清酸尿，也不会改变成年人的全身一氧化氮（NO)合成速率灯apiero2002、 Castillo1995、Rogers1994、Ca;r巧 1987、Ba;rbul1986、Snyde;rman1959、Rose1949)。尽 管早产儿似乎需要精氨酸（Wu2004)，但是在婴儿、儿童和青年中，精氨酸水平与年龄无关 (Lilcke2007)。1992年，化kaku和Sugimura分别报道称人类黑色素瘤和肝细胞癌（肥C) 细胞系的生长似乎需要精氨酸。其它研究显示聚乙二醇化的ADI有效地用于黑色素瘤和肝 癌的治疗且副作用小。
[0010] ADI-PEG20治疗在一段时间内需要多剂量。多次治疗后，抗-ADI-PEG20抗体形 成，该抗体可限制其后续的疗效。因此，本领域需要具有减弱的与抗-ADI-PEG20抗体的交 叉反应性的ADI用于治疗W便于改善和扩大精氨酸消耗治疗的疗效。本发明提供了用于癌 症治疗的此优点及其它优点。
[0011] 参考文献：AvramiSVI，PanosyanEH. 2005.ClinF*ha;rmacokinet44 :367-393 ; BarbulA. 1986.JParenteralEnteralNutr10 :227-238;CareyGP，等 1987.JNutr 117 :1734-1739;CastilloL，等 1995.AmJPhysiol268(EndocrinolMetab31): ￡36〇-367;化CH，SakamotoKM. 2007.Expe;rtOpinF^harmacother8 :1977-1984Waines RJ，等 2011.IntJBiochemMolBiol2:8-23;HussonA,等 2003.EurJBiochem270: 1887-1899;LilckeT，等 2007.ClinQiemL油Med45 :1525-1530!MorrisSMJr. 2006.Am JClinNutr83(增刊）：598S-512S;RogersQR. 1994.于表彰研讨会的论文集中Willard J.Visek-来自AmmoniatoCancerandGeneExpression.特殊公开 86-1994 年四月， AgricultureExperimentStation，UniversityofIllinois，211MumfordHall，Urbana， IL61801，第 9-21 页；TapieroH，等 2002.BiomedF^harmacother56 :439-445,2002;Viera PinheiroJP，BoosJ.2004.化JHaematol125 :117-127;WuG，等2009.AminoAcids37: 153-168;WuG，等 2004.JNutrBiochem15 :442-451;ZeidanA,等 2008.ExpertOpin BiolTher9 :111-119)〇 发明概要
[0012] 本发明的一个方面提供了一种分离的精氨酸脱亚胺酶，其中所述分离的精氨酸脱 亚胺酶具有减弱的与患者抗-ADI-PEG20抗体的交叉反应性。也包括治疗或药物组合物， 其包含分离的精氨酸脱亚胺酶或其具有ADI活性的片段，和药学上可接受的载体。在某些 实施方案中，所述组合物是无菌的和/或基本上无热原（如内毒素）。在一个实施方案中， 具有减弱的与患者抗-ADI-PEG20抗体的交叉反应性的分离的精氨酸脱亚胺酶不是来自 人型支原体（M.hominis)。在另一个实施方案中，具有减弱的与患者抗-ADI-PEG20抗体的 交叉反应性的分离的精氨酸脱亚胺酶来自表1中所列的生物体。在某些实施方案中，具有 减弱的与患者抗-ADI-PEG20抗体的交叉反应性的分离的精氨酸脱亚胺酶具有相当于或 优于ADI-PEG20的一种或多种性质。就运方面来说，所述的一种或多种性质包括但不限于 Kcat、Km、最适抑、稳定性、体内蛋白质水解稳定性、或不需要已经不存在于血液中的离子或 辅因子、或其任何组合。在一个实施方案中，与人型支原体的精氨酸脱亚胺酶相比，具有减 弱的与患者抗-ADI-PEG20抗体的交叉反应性的分离的精氨酸脱亚胺酶具有至少20个表 面残基变化。在另一个实施方案中，与人型支原体的精氨酸脱亚胺酶相比，具有减弱的与患 者抗-ADI-PEG20抗体的交叉反应性的分离的精氨酸脱亚胺酶具有20个至135个之间的 表面残基变化，40个至100个之间的表面残基变化，30个至60个之间的表面残基变化，80 个至100个之间的表面残基变化，或100个至120个之间的表面残基变化。
[0013] 在另一个实施方案中，具有减弱的与患者抗-ADI-PEG20抗体的交叉反应性的分 离的精氨酸脱亚胺酶来自精氨酸支原体（M.arginini)、关节炎支原体（M.art虹itidis)、海豹脑支原体（M.地ocicerebrale)、猫支原体（M.gateae)、海豹支原体（M.地ocidae)、错 支原体（M.columbinum)、衣阿华支原体（M.iowae)、鳄鱼支原体（M.crocodyli)、短吻鳄支 原体（M.alligatoris)、奥氏嗜热盐丝菌化orenii)、或牛分支杆菌（M.bovis)。具有减 弱的与患者抗-ADI-PEG20抗体的交叉反应性的示例性精氨酸脱亚胺酶包含SEQIDNO: 2-32中任一个所示的氨基酸序列。
[0014] 在另一个实施方案中，具有减弱的与患者抗-ADI-PEG20抗体的交叉反应性的分 离的精氨酸脱亚胺酶已经被修饰W去除至少一个聚乙二醇化位点。在具有减弱的与患者 抗-ADI-PEG20抗体的交叉反应性的精氨酸脱亚胺酶的另一个实施方案中，至少一个赖氨 酸残基已经被氨基酸替换所修饰。就运方面来说，在某些实施方案中，至少5个赖氨酸残 基、至少10个赖氨酸残基、或至少20个赖氨酸残基已经被氨基酸替换所修饰。
[0015] 在另一个实施方案中，具有减弱的与患者抗-ADI-PEG20抗体的交叉反应性 的精氨酸脱亚胺酶通过接头共价结合于PEG分子。就运方面来说，具有减弱的与患者 抗-ADI-PEG20抗体的交叉反应性的精氨酸脱亚胺酶可共价结合于一个或多个阳G分子， 例如约1个至约10个或约2至约8个PEG分子。所述PEG分子可为直链或支链PEG分子并 可具有约1，000至约40, 000的总重均分子量，或约10, 000至约30, 000的总重均分子量。 在PEG通过接头共价结合于本发明的ADIr的那些实施方案中，所述接头可包含班巧酷基、 酷胺基、酷亚胺基、氨基甲酸醋基、醋基、环氧基、簇基、径基、碳水化合物、酪氨酸基团、半脫 氨酸基团、组氨酸基团、亚甲基、或其任何组合。在一个实施方案中，班巧酷基的来源为班巧 酸班巧酷亚胺醋。
[0016] 本发明的另一个方面提供了一种编码本文所述的分离的精氨酸脱亚胺酶的多核 巧酸、含有所述多核巧酸的载体、W及含有所述载体的分离的宿主细胞。
[0017] 本发明的另一个方面提供了一种组合物，其包含本文所述的具有减弱的与患者 抗-ADI-PEG20抗体的交叉反应性的分离的精氨酸脱亚胺酶和生理学上可接受的载体。在 某些实施方案中，所述组合物还包含化疗剂。示例性化疗剂包括但不限于多西他赛、卡销、 环憐酷胺、吉西他滨、顺销、索拉菲尼、舒尼替尼和依维莫司。
[0018] 本发明的另一个方面提供了一种用于治疗癌症，缓解其症状，或抑制其进展的 方法，其包括向有此需要的患者施用治疗有效量的包含本文所述的具有减弱的与患者 抗-ADI-PEG20抗体的交叉反应性的分离的精氨酸脱亚胺酶和生理学上可接受的载体的 组合物，从而治疗癌症，缓解其症状，或抑制其进展。在某些实施方案中，有此需要的患者已 被确定具有抗-ADI-PEG20抗体。在另一个实施方案中，所述癌症选自肝细胞癌、黑色素瘤 (包括转移性黑色素瘤）、膜腺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、间皮瘤、淋己细胞性白血病、慢性 髓细胞性白血病、淋己瘤、肝癌、肉瘤、白血病、急性髓细胞样白血病、复发性急性髓细胞样 白血病、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃部癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、非小细胞 性肺癌（NSCLC)、肾癌、膀脫癌、子宫癌、食管癌、脑癌、头颈癌、子宫颈癌、睾丸癌和胃癌。
[0019] 本发明的另一个方面提供了一种用于治疗癌症，缓解其症状，或抑制其进展的方 法，其包括向有此需要的患者施用治疗有效量的包含ADI-PEG20的组合物，W及一段时间 后，向所述患者施用包含本文所述的具有减弱的与患者抗-ADI-PEG20抗体的交叉反应性 的分离的精氨酸脱亚胺酶和生理学上可接受的载体的组合物，从而治疗癌症，缓解其症状， 或抑制其进展。就运方面来说，例如，可通过检测患者中抗-ADI-PEG20抗体的预定水平 和/或测定或W其它方式观察患者中ADI活性来确定所述的一段时间，其中在检测所述的 抗-ADI-PEG20抗体的预定水平和/或测定或观察患者中ADI活性的预定水平后，施用包 含具有减弱的与患者抗-ADI-PEG20抗体的交叉反应性的分离的精氨酸脱亚胺酶的组合 物。
[0020] 还包括用于制备或制造用于治疗癌症、缓解其症状，或抑制其进展的药物的本文 所述的分离的精氨酸脱亚胺酶蛋白质。
[00川发明详述
[0022] 本发明的实施方案设及选定的ADI酶，在一些实施方式中，其经工程化W具有少 量的表面赖氨酸残基，并通过稳定的接头与PEG缀合。选定的ADI酶基于它们的有利性质 选自来自不同生物体的大量ADI酶。运些性质包括酶通过ADI将精氨酸转化为瓜氨酸和氨 来建立和维持人体血液中低精氨酸浓度的能力。此外，与ADI-PEG20相比，选定的ADI分 子具有减弱的对抗-ADI-PEG20抗体的交叉反应性，此类抗体可能产生于用ADI-PEG20对 患者进行的先前治疗。
[0023] 在某些实施方案中，使本发明的酶聚乙二醇化W提供保护来应对肾清除和蛋白质 水解，W及降低的免疫原性或抗原性。为了提高聚乙二醇化的效率，对酶的修饰可被工程化 W减少表面赖氨酸残基的数量，并因此限制了可用的PEG附着位点的数量。此提供了剩余 的赖氨酸附着残基的更彻底和均一的聚乙二醇化。
[0024] 对经筛选則尋甲氧基-PEG附着于ADI的阳G接头加W选择W提供化学稳定的连 接。预期到，此将延长分子的生物活性有效期。化学稳定的接头也能消除水解和减轻免疫 反应，其可能发生在附着于酶表面的脱聚乙二醇化的接头上。
[00巧]运些累积说明产生有效地从患者血液中去除精氨酸并且不被来自先前精氨酸消 耗治疗的抗-ADI-PEG20抗体中和或清除的一个或多个分子。使分子聚乙二醇化W延迟其 自身免疫原性所引起的中和和清除。运些因素将允许它们的使用来替代ADI-PEG20或除 ADI-PEG20外（例如，作为仿制药（follow-on化Ug))W扩大精氨酸消耗治疗，并因此提高 精氨酸消耗治疗作为抗癌疗法的效力。
[0026] 因为正常细胞可由瓜氨酸W通过ASS和A化催化的两步法合成精氨酸，所W它们 的生长不需要精氨酸。相比之下，某些癌症不表达ASS。某些癌症不表达ASL而其它癌症 可弱表达，或可不表达ASS和/或ASL。因此，运些癌症是精氨酸营养缺陷型。可利用运种 代谢差异W开发安全并有效的疗法来治疗运些形式的癌症。ADI通过精氨酸双水解酶途径 催化精氨酸至瓜氨酸的转化，因而可用来清除精氨酸。
[0027] 除非相反地特别说明，否则本发明的实践将使用本领域技术范围内的病毒学、 免疫学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的传统方法，其中多个将在下文进行描 述W用于说明目的。在文献中充分解释此类技术。参见，例如，化rrentProtocolsin ProteinScience，CurrentProtocolsinMolecularBiologyorCurrentProtocols inImmunology，JohnWiley&Sons，NewYork，N.Y. (2009);Ausubel等，ShortProtocols inMolecularBiology，第 3 版，Wiley&Sons，1995;Sambrook和Russell，Molecular Cloning：ALaboratoryManual(第3 片反，2001);Maniatis等MolecularCloning：A LaboratoryManual(1982);DNACloning：APracticalApproach，第I&II卷（D.Glover 编)；OligonucIeotideSynthesis(N.Gait编，1984)；NucleicAcidHybridization度.Hames&S.Higgins编，1985)；TranscriptionandTranslation(B.Hames&S.Higgins编， 1984);AnimalCellCulture化Rreshney编，1986) ;Pe;rbal，APracticalGuideto MolecularCloning(1984)W及其它类似的参考文献。
[002引如本说明书和所附权利要求中所用，单数形式"一个"、"一种"和"所述"包括复数 指代物，除非上下文另有明确指出。
[0029] 在本说明书中，除非上下文另有要求，词语"包含（comprise)"，或例如"包含 (comprises)"或"包含（comprising)"的变化形式，否则应理解为表示含有所述的元素或 整数或元素组或整数组，但不排斥任何其它的元素或整数或元素组或整数组。
[0030] "约"意指量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度在参考量、 水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度上变化多达30 %、25 %、20 %、 15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或 1%。
[0031] 对于"统计上显著的"，其意指结果不可能是偶然发生的。统计显著性可通过本领 域已知的任意方法来确定。常用的显著性测定包括P值，如果零假设为真，其为观察的事件 发生的频率或概率。当所得的P值小于显著性水平，则零假设被拒绝。在简单情况下，显著 性水平规定为0. 05或更小的P值。
[0032] 本说明书中每一个实施方案都可作必要修正后用于其它每个实施方案，除非另有 明确说明。
[0033] 标准技术可用于重组DNA、寡核巧酸合成、W及组织培养和转化（例如，电穿孔，月旨 质体转染）。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书或如本领域通常实现的或如本文所 述来进行。运些及相关的技术和步骤一般根据本领域众所周知的W及如本说明书中所引述 并讨论的多个一般性和更具体的参考文献中所述的常规方法进行。除非提供具体定义，否 则连同本文所述的分子生物学、分析化学、合成有机化学、W及医学和药物化学使用的命名 法，W及其实验室步骤和技术是本领域众所周知并常用的那些。标准技术可用于重组技术、 分子生物学合成、微生物学合成、化学合成、化学分析、药物制备、配制、和递送、W及患者的 治疗。
[0034] "患者"或"受试者"是指动物，在某些实施方案中指哺乳动物，并且在特定的实施 方案中指人类。
[0035] "生物相容的"是指对生物功能基本没有损伤并不会产生任何程度的不可接受的 毒性（包括过敏和疾病状态）的材料或化合物。
[0036] 术语"参考序列"一般是指核酸编码序列，或氨基酸序列，另一个序列与之进行比 较。本文所述的所有多肤和多核巧酸序列包括在参考序列中，包括W名称描述的那些和在 表格和序列表中描述的那些。
[0037] 在本公开中，可W使用下列缩写；阳G，聚乙二醇；ADI，精氨酸脱亚胺酶；SS，班 巧酸班巧酷亚胺醋；SSA，班巧酷亚胺基班巧酷亚胺；SPA，丙酸班巧酷亚胺醋；N服，N-径 基-班巧酷亚胺；ASSl或ASS，精胺班巧酸合成酶;A化，精氨班巧酸裂解酶。
[0038] 在本发明中，编码ADI的多核巧酸可由任何来源（包括例如微生物、重组生物技 术或其任何组合）衍生、克隆、分离、合成或产生。例如，精氨酸脱亚胺酶可由支原体属 (Mycoplasma)、梭菌属（Clostridium)、芽抱杆菌属度acillus)、疏螺旋体属度orrelia)、 肠球菌属巧nterococcus)、链球菌属（Str巧tococ州s)、乳酸杆菌属（Xactobacillus)、 和/或贾第虫属（Giardia)微生物克隆得到。在某些实施方案中，精氨酸脱亚胺酶由 关节炎支原体（Mycoplasmaart虹itidis)、肺炎支原体（Mycoplasmapneumoniae)、人 型支原体（Mycoplasmahominis)、精氨酸支原体（Mycoplasmaarginini)、酿脈链球 菌（Steptococcuspyogenes)、肺炎链球菌（Steptococcuspneum