量脫氨酸向精胺班巧酸的转化或精胺班巧 酸向精氨酸和富马酸的转化的测定）等等。
[0136]因此，本发明提供了用于治疗患者的癌症，缓解其症状，或抑制其进展的方法，其 包括向所述患者施用包含本文所述的ADIr的组合物，其中所述癌症显示出ASS或A化表达 或活性的降低，或二者，其中所述癌症包括但不限于，肝细胞癌、白血病（例如急性髓细胞 样白血病和复发性急性髓细胞样白血病）、黑色素瘤（包括转移性黑色素瘤）、肉瘤（包括， 但不限于，转移性肉瘤、子宫平滑肌肉瘤）、膜腺癌、前列腺癌（例如，但不限于，激素难治性 前列腺癌）、间皮瘤、淋己白血病、慢性粒细胞白血病、淋己瘤、小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、 结肠直肠癌、胃部癌（包括但不限于，胃腺癌）、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤多形、视网膜母 细胞瘤、神经母细胞瘤、非小细胞肺癌（NSCLC)、肾癌（包括但不限于肾细胞癌）、膀脫癌、子 宫癌、食管癌、脑癌、头颈癌（包括但不限于，头颈部鱗状细胞癌；舌癌）、宫颈癌、睾丸癌、胆 囊胆管癌和胃癌。
[0137]文献中的各种研究表明，ASS在下述肿瘤中是缺陷的：急性髓细胞性白血病 (AML)、膀脫癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胃部癌、胶质母细胞瘤、HCC、淋己瘤、黑素瘤、间皮瘤、 非小细胞肺癌、卵巢癌、膜腺癌、前列腺癌、肾脏癌、肉瘤和小细胞肺癌。因此，本文中可具 体地预期到运些ASS缺陷型癌症的治疗，只使用ADIr-PEG或与其它治疗组合，包括先利用 ADI-PEG20 治疗。
[013引本发明还提供了用于治疗患者的癌症，缓解其症状，或抑制其进展的方法，其包括 向所述患者施用包含如本文所述的ADIr(例如，ADIr-PEG且具体地讲ADIr-PEG20)，与自 嗜抑制剂的组合的组合物。在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗患者癌症的方法，其 包括向所述患者施用治疗有效量的包含本文所述的ADIr和自嗜抑制剂的组合的组合物， 其中所述癌症为膜腺癌或小细胞肺癌。
[0139]在某些实施方案中，本发明提供了治疗方法，其中包含本文所述的ADIr的组合物 的施用消耗血浆中的精氨酸至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更长。在 另一个实施方案中，本发明提供了治疗方法，其中在检测到抗-ADI-PEG20抗体而终止用 ADI-PEG20的治疗后，包含本文所述的ADIr的组合物的施用消耗血浆中的精氨酸至少1个 月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更长。 实施例
[0140] 实施例1
[0141] 与患者抗-ADI-PEG20抗体的交叉反应性较低的ADI酶的筛选和选择
[0142]本实施例描述了与患者抗-ADI-PEG20抗体的交叉反应性较低的ADI酶的筛选和 选择。
[014引从大量ADI酶中，表1列出了针对它们相对于人型支原体ADI的序列百分比同一 性所筛选的24种ADI酶。从文献可知，人型支原体、精氨酸支原体和关节炎支原体ADI氨 基酸序列相关性密切并且运些酶具有良好的催化特性。最近，发现了具有与运=个密切相 关的序列的额外的ADI酶。虽然已识别出相关性较远的支原体ADI酶，但关于它们的了解 不多。存在来源于细菌和其它来源的相关性甚至更远的ADI酶。
[0144]
[0146] 公共数据库中可用的一些蛋白质序列并非全长ADI序列。在那些情况下，公开可 用的序列在需要时基于已知的ADI序列延伸W制备全长ADI。在某些情况下，在别处对ADI蛋白进行修饰（例如，C251S替换）。运些合成的ADI序列WSEQIDNO:26-32提供并对应 于精氨酸支原体（C251S)、关节炎支原体（C251S)、海豹脑支原体、猫支原体、海豹支原体、 奥氏嗜热盐丝菌和牛分支杆菌的延伸和/或修饰的ADI序列。
[0147] 对来源于各种生物体的大量ADI酶进行表征W确定哪个酶期望被去除并维持精 氨酸在患者血液中的低浓度，甚至在抗-ADI-PEG20抗体存在下。表2(如下）列出了所 研究的来自表1的ADI酶的选定的子集。具体如下，运些研究数据表明，来自基于序列同 一性与人型支原体密切相关的多种物种的ADI具有足够好的酶催化性质并具有减弱的与 抗-ADI-PEG20抗体的交叉反应性。
[0148]ADI的制备。对重组ADI酶进行克隆、表达和纯化W根据如下所述的标准方案 进行试验，例如，Gallego等，化OSOne, 7(10):日47886, 2012 ;Monsta化和Holldo计， Biochem.J. 273 :739-745,1990;JooNoh等，MoleculesandCells. 13:137-143,2002;? 及Sugimura等，InfectiionandImmunity. 58 :2510-2515,1990。
[0149]人杭-ADI-PEG20杭体的纯化。抗-ADI-PEG20抗体是由在临床研究期间接受 过ADI-PEG20的患者的血浆样品纯化得到的。将来自8个不同患者的总共60ml的血浆汇 集在一起，运些患者已经达到了通过化ISA测定确定的对ADI-PEG20的高滴度（滴度>/ = 4)。使用两步纯化，先进行蛋白"A"色谱（GEHealthcare),然后进行ADI亲和色谱。得 到~20mg纯化抗体并W多份储存在-80°C下，直至需要。
[0150]ADI酶测定。精氨酸脱亚胺酶（ADI)催化k精氨酸向k瓜氨酸和氨的转化。 k瓜氨酸的量可通过比色终点测定（参见，例如，Knipp和Vasak,Anal^icalBiochem, 286 :257-264,2000)检测并与已知量的心瓜氨酸的标准曲线对比W计算出ADI的比活性， WlU/mg蛋白质表示。IIU酶活性被定义为在所测试的抑和溫度下，每分钟产生1ymol瓜 氨酸的酶量。标准测定条件在37°C下于肥阳S生理缓冲液（P皿)50mM肥阳S、160mM化Cl pH7. 4 化ang和Zander,ClinChemL油Med. 37 :563-571,1999)加上 0. 1 %BSA中进行。所 有样品和标准在条件允许的情况下一式两份或一式=份进行。
[015。 通过采用上述活性测定的变型确定Km和Kcat值。对于活性测定，所有反应均在 37°C下于P皿加上0. 1%BSA中进行。对ADI或ADIr结构体中每一个进行酶浓度、反应时 间、W及底物浓度范围的调整W导致它们活性差异。一般来讲，2nM酶、5分钟反应时间W及 0-160yM精氨酸被用作初始条件。条件优化时，需特别注意消耗的底物量占加入反应的全 部底物的百分比。瓜氨酸的检测下限为IyM,且定量下限为2iiM。对每块板进行瓜氨酸标 准曲线并用于量化通过酶反应产生的瓜氨酸。
[0152] 活性测定也用于评价在抗-ADI-阳G2存在下的酶活性（抗体中和情况）。运些测 定如上所述并在 800nM、400nM、200nM、lOOnM、50nM、25nM、12. 5nM和OnM抗-ADI-PEG20 抗体 存在下进行。
[0153] 化基。利用瓜氨酸标准曲线计算并平均化每个反应孔中产生的瓜氨酸浓度（yM)。 然后，WyM/min/50nMADI计算每个反应的速率。通过将该值乘W"IU"因子（IU因子是通 过ADI的分子量和反应体积计算得到的）计算比活性（lU/mg或Jimol产物/min/mgADI)。 所得结果总结于下表2中。
[0154]
[015引运些数据表明与人型支原体ADI高度同源的（约50-100%同一性）ADI酶保持了 非常好的催化活性。它们也显示出，通过在抗-ADI-PEG20抗体存在下的酶活性测定的对 患者抗-ADI-PEG20抗体的亲和力例如相对于人型支原体有所减弱。因此，运些ADI酶可 具有用于治疗癌症的疗法的治疗效用，单独使用或在ADI-PEG20治疗后使用，W延长和/ 或增强精氨酸消耗疗法的效果。
[0156] 可组合上述的各种实施方案W提供进一步的实施方案。在本说明书中提及的和/ 或申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公布案、美国专利申请、外国专利、外 国专利申请和非专利公布案的全文W引用的方式并入本文中。可对实施方案的多个方面进 行修改，必要时可使用多个专利、申请和公开案的概念，W提供更进一步的实施方案。
[0157] 可根据W上详述的具体方式对实施方案进行运些及其它改变。一般来讲，在W上 权利要求中，所用术语并不视为将权利要求限制于说明书和权利要求中所公开的具体实施 方案，但应解释为包括所有可能的实施方案W及运些权利要求受权的等效项的全部范围。 因此，权利要求不受限于公开内容。
【主权项】
1. 一种治疗组合物，其包含分离的精氨酸脱亚胺酶，或其具有ADI活性的片段，和药学 上可接受的载体，其中所述分离的精氨酸脱亚胺酶具有减弱的与患者抗-ADI-PEG20抗体 的交叉反应性。2. 如权利要求1所述的治疗组合物，其中所述分离的精氨酸脱亚胺酶不来源于人型支 原体。3. 如权利要求2所述的治疗组合物，其中所述分离的精氨酸脱亚胺酶来源于表1中所 列的生物体。4. 如权利要求1所述的治疗组合物，其中所述分离的精氨酸脱亚胺酶具有相当于或优 于ADI-PEG20的一种或多种性质。5. 如权利要求4所述的治疗组合物，其中所述一种或多种性质为Kcat、Km、最适pH、稳 定性、体内蛋白质水解稳定性、或不需要已经不存在于血液中的离子或辅因子、或其任何组 合。6. 如权利要求1所述的治疗组合物，其中与人型支原体的精氨酸脱亚胺酶相比，所述 分离的精氨酸脱亚胺酶具有至少20个表面残基变化。7. 如权利要求1所述的治疗组合物，其中与人型支原体的精氨酸脱亚胺酶相比，所述 分离的精氨酸脱亚胺酶具有20个至135个之间的表面残基变化。8. 如权利要求1所述的治疗组合物，其中与人型支原体的精氨酸脱亚胺酶相比，所述 分离的精氨酸脱亚胺酶具有40个至100个之间的表面残基变化。9. 如权利要求1所述的治疗组合物，其中与人型支原体的精氨酸脱亚胺酶相比，所述 分离的精氨酸脱亚胺酶具有30个至60个之间的表面残基变化。10. 如权利要求1所述的治疗组合物，其中与人型支原体的精氨酸脱亚胺酶相比，所述 分离的精氨酸脱亚胺酶具有80个至100个之间的表面残基变化。11. 如权利要求1所述的治疗组合物，其中与人型支原体的精氨酸脱亚胺酶相比，所述 分离的精氨酸脱亚胺酶具有100个至120个之间的表面残基变化。12. 如权利要求1所述的治疗组合物，其中所述分离的精氨酸脱亚胺酶来源于精氨酸 支原体、关节炎支原体、海豹脑支原体、猫支原体、海豹支原体、鸽支原体、衣阿华支原体、鳄 鱼支原体、短吻鳄支原体、奥氏嗜热盐丝菌、或牛分支杆菌。13. 如权利要求1所述的治疗组合物，其中所述分离的精氨酸脱亚胺酶包含SEQID NO:2-32中任一个所示的氨基酸序列。14. 如前述权利要求中任一项所述的治疗组合物，其中所述分离的精氨酸脱亚胺酶已 经被修饰以去除至少一个聚乙二醇化位点。15. 如前述权利要求中任一项所述的治疗组合物，其中至少1个赖氨酸残基已经被氨 基酸替换所修饰。16. 如权利要求15所述的治疗组合物，其中至少5个赖氨酸残基已经被氨基酸替换所 修饰。17. 如权利要求15所述的治疗组合物，其中至少10个赖氨酸残基已经被氨基酸替换所 修饰。18. 如权利要求15所述的治疗组合物，其中至少15个赖氨酸残基已经被氨基酸替换所 修饰。19. 如权利要求15所述的治疗组合物，其中至少20个赖氨酸残基已经被氨基酸替换所 修饰。20. 如前述权利要求中任一项所述的治疗组合物，其中所述精氨酸脱亚胺酶通过接头 共价结合于PEG分子。21. 如权利要求20所述的治疗组合物，其中所述精氨酸脱亚胺酶共价结合于一个以上 的PEG分子。22. 如权利要求20所述的治疗组合物，其中所述精氨酸脱亚胺酶共价结合于约1个至 约10个PEG分子。23. 如权利要求20所述的治疗组合物，其中所述精氨酸脱亚胺酶共价结合于约2个至 约8个PEG分子。24. 如权利要求20所述的治疗组合物，其中所述PEG分子为直链或支链PEG分子。25. 如权利要求20所述的治疗组合物，其中所述PEG具有约1，000至约40, 000的总重 均分子量。26. 如权利要求20所述的治疗组合物，其中所述PEG具有约10, 000至约30, 000的总 重均分子量。27. 如权利要求20所述的分离的精氨酸脱亚胺酶，其中所述接头为琥珀酰基、酰胺基、 酰亚胺基、氨基甲酸酯基、酯基、环氧基、羧基、羟基、碳水化合物、酪氨酸基团、半胱氨酸基 团、组氨酸基团，亚甲基、或其任何组合。28. 如权利要求27所述的治疗组合物，其中所述琥珀酰基的来源为琥珀酸琥珀酰亚胺 酯。29. -种分离的精氨酸脱亚胺酶，或其具有ADI活性的片段，其中所述分离的精氨酸脱 亚胺酶与患者的抗-ADI-PEG20抗体具有减弱的交叉反应性。30. 如权利要求29所述的分离的精氨酸脱亚胺酶，其中所述分离的精氨酸脱亚胺酶不 来源于人型支原体。31. 如权利要求30所述的分离的精氨酸脱亚胺酶，其中所述分离的精氨酸脱亚胺酶来 源于表1中所列的生物体。32. 如权利要求29所述的分离的精氨酸脱亚胺酶，其中所述分离的精氨酸脱亚胺酶具 有相当于或优于ADI-PEG20的一种或多种性质。33. 如权利要求32所述的分离的精氨酸脱亚胺酶，其中所述一种或多种性质为Kcat、 Km、最适pH、稳定性、体内蛋白质水解稳定性、或不需要已经不存在于血液中的离子或辅因 子、或其任何组合。34. 如权利要求29所述的分离的精氨酸脱亚胺酶，其中与人型支原体的精氨酸脱亚胺 酶相比，所述分离的精氨酸脱亚胺酶具有至少20个表面残基变化。35. 如权利要求29所述的分离的精氨酸脱亚胺酶，其中与人型支原体的精氨酸脱亚胺 酶相比，所述分离的精氨酸脱亚胺酶具有20个至135个之间的表面残基变化。36. 如权利要求29所述的分离的精氨酸脱亚胺酶，其中与人型支原体的精氨酸脱亚胺 酶相比，所述分离的精氨酸脱亚胺酶具有40个至100个之间的表面残基变化。37. 如权利要求29所述的分离的精氨酸脱亚胺酶，其中与人型支原体的精氨酸脱亚胺 酶相比，所述分离的精氨酸脱亚胺酶具有30个至60个之间的表面残基变化。38. 如权利要求29所述的分离的精氨酸脱亚胺酶，其中与人型支原体的精氨酸脱亚胺 酶相比，所述分离的精氨酸脱亚胺酶具有80个至100个之间的表面残基变化。39. 如权利要求29所述的分离的精氨酸脱亚胺酶，其中与人型支原体的精氨酸脱亚胺 酶相比，所述分离的精氨酸脱亚胺酶具有100个至120个之间的表面残基变化。40. 如权利要求29所述的分离的精氨酸脱亚胺酶，其中所述分离的精氨酸脱亚胺酶来 源于精氨酸支原体、关节炎支原体、海豹脑支原体、猫支原体、海豹支原体、鸽支原体、衣阿 华支原体、鳄鱼支原体、短吻鳄支原体、奥氏嗜热盐丝菌、或牛分支杆菌。41. 如权利要求29所述的分离的精氨酸脱亚胺酶，其中所述分离的精氨酸脱亚胺酶包 含SEQIDNO:2-32中任一个所示的氨基酸序列。42. 如前述权利要求中任一项所述的分离的精氨酸脱亚胺酶，其中所述分离的精氨酸 脱亚胺酶已经被修饰以去除至少一个聚乙二醇化位点。43. 如前述权利要求中任一项所述的分离的精氨酸脱亚胺酶，其中至少1个赖氨酸残 基已经被氨基酸替换所修饰。44. 如权利要求43所述的分离的精氨酸脱亚胺酶，其中至少5个赖氨酸残基已经被氨 基酸替换所修饰。45. 如权利要求15所述的分离的精氨酸脱亚胺酶，其中至少10个赖氨酸残基已经被氨 基酸替换所修饰。46. 如权利要求15所述的分离的精氨酸脱亚胺酶，其中至少15个赖氨酸残基已经被氨 基酸替换所修饰。47. 如权利要求15所述的分离的精氨酸脱亚胺酶，其中至少20个赖氨酸残基已经被氨 基酸替换所修饰。48. 如前述权利要求中任一项所述的分离的精氨酸脱亚胺酶，其中所述精氨酸脱亚胺 酶通过接头共价结合于PEG分子。49. 如权利要求20所述的分离的精氨酸脱亚胺酶，其中所述精氨酸脱亚胺酶共价结合 于一个以上的PEG分子。50. 如权利要求20所述的分离的精氨酸脱亚胺酶，其中所述精氨酸脱亚胺酶共价结合 于约1个至约10个PEG分子。51. 如权利要求20所述的分离的精氨酸脱亚胺酶，其中所述精氨酸脱亚胺酶共价结合 于约2个至约8个PEG分子。52. 如权利要求20所述的分离的精氨酸脱亚胺酶，其中所述PEG分子为直链或支链 PEG分子。53. 如权利要求20所述的分离的精氨酸脱亚胺酶，其中所述PEG具有约1，000至约 40, 000的总重均分子量。54. 如权利要求20所述的分离的精氨酸脱亚胺酶，其中所述PEG具有约10, 000至约 30, 000的总重均分子量。55. 如权利要求20所述的分离的精氨酸脱亚胺酶，其中所述接头为琥珀酰基、酰胺基、 酰亚胺基、氨基甲酸酯基、酯基、环氧基、羧基、羟基、碳水化合物、酪氨酸基团、半胱氨酸基 团、组氨酸基团、亚甲基、或其任何组合。56. 如权利要求27所述分离的精氨酸脱亚胺酶，其中所述琥珀酰基的来源为琥珀酸琥 珀酰亚胺酯。57. -种编码如前述权利要求中任一项所述的分离的精氨酸脱亚胺酶的多核苷酸。58. -种含有如权利要求57所述的多核苷酸的载体。59. -种含有如权利要求58所述的载体的分离的宿主细胞。60. 如前述权利要求中任一项所述的治疗组合物，其还包含化疗剂。61. 如权利要求60所述的治疗组合物，其中所述化疗剂选自多西他赛、卡铂、环磷酰 胺、吉西他滨、顺铂、索拉菲尼、舒尼替尼和依维莫司。62. -种用于治疗癌症，缓解其症状，或抑制其进展的方法，其包括向有此需要的患者 施用治疗有效量的如前述权利要求中任一项所述的治疗组合物，从而治疗癌症，缓解其症 状，或抑制其进展。63. 如权利要求62所述的方法，其中所述有此需要的患者已被确定具有抗-ADI-PEG 20抗体。64. 如权利要求62或63所述的方法，其中所述癌症选自肝细胞癌、黑色素瘤、转移性黑 色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、间皮瘤、淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、 淋巴瘤、肝癌、肉瘤、白血病、急性髓细胞样白血病、复发性急性髓细胞样白血病、乳腺癌、卵 巢癌、结肠直肠癌、胃部癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、非小细胞性肺癌（NSCLC)、肾 癌、膀胱癌、子宫癌、食管癌、脑癌、头颈癌、子宫颈癌、睾丸癌和胃癌。65. -种用于治疗癌症，缓解其症状，或抑制其进展的方法，其包括向有此需要的患者 施用治疗有效量的包含ADI-PEG20的组合物，以及一段时间后，向所述患者施用如前述权 利要求中任一项所述的治疗组合物，从而治疗癌症，缓解其症状，或抑制其进展。66. 如权利要求65所述的方法，其中所述一段时间通过检测所述患者中抗-ADI-PEG 20抗体的预定水平确定，其中所述治疗组合物在检测所述抗-ADI-PEG20抗体的所述预定 水平后施用。67. 如权利要求65所述的方法，其中所述一段时间通过检测所述患者中ADI活性确定， 其中所述治疗组合物在检测ADI活性的预定或降低水平后施用。68. -种如前述权利要求中任一项所述的分离的精氨酸脱亚胺酶在制造用于治疗癌 症，缓解其症状，或抑制其进展的药物中的用途。
【专利摘要】本发明一般涉及分离的精氨酸脱亚胺酶(ADI)蛋白、包含所述ADI蛋白的组合物、以及治疗精氨酸依赖性疾病或相关疾病如癌症的相关方法，所述ADI蛋白与ADI-PEG？20相比具有减弱的与抗-ADI-PEG？20抗体的交叉反应性，但其可具有相当于或优于ADI-PEG？20的功能特征。
【IPC分类】C07K14/00, A61K39/04, A61K38/46, C07K17/00, C07K1/00, A61K39/02
【公开号】CN105188739
【申请号】CN201480026318
【发明人】R·阿尔马西, R·E·肖沃尔特, J·A·汤姆森, W·西森, W-J·西亚, L-C·陈, L·杨
【申请人】波拉里集团
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2014年3月13日
【公告号】CA2901795A1, EP2968482A2, EP2968482A4, US20140348814, WO2014151982A2, WO2014151982A3