Eps8抗肿瘤ctl表位肽及其应用的制作方法
【专利摘要】一种EPS8来源的抗肿瘤CTL表位肽，为九肽，其序列为：Trp-a-Gln-Asp-Met-Ile-Leu-Gln-Val，其中，a为Thr或Leu。本发明还公开了该表位肽在药物中的应用。本发明诱导的特异性CTL均能分泌一定的IFN-γ，并对HLA-A*0201和EPS8表达阳性的MCF-7细胞以及负载EPS8的T2A2细胞均表现出一定的抗原特异性杀伤效应，制成的EPS8表达阳性肿瘤的治疗性多肽疫苗，在肿瘤特异性免疫治疗领域有着巨大的开发应用潜力。
【专利说明】EPS8抗肿瘤CTL表位肽及其应用
[0001] 本申请是申请日为2013年12月23日、申请号为201310717092. 0、发明名称为 EPS8抗肿瘤CTL表位肽及其应用的中国发明专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0002] 本发明属于生物化学领域中的多肽【技术领域】，具体涉及一种EPS8来源的抗肿瘤 CTL表位肽及其在制备治疗肿瘤药物中的应用。
【背景技术】
[0003] 恶性肿瘤是新世纪人类的第一杀手。手术、放疗及化疗等传统治疗方法对某些肿 瘤尤其是晚期恶性肿瘤的治疗效果尚不理想。近年来，细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocyte, CTL)在抑制肿瘤中的作用受到极大重视，如何有效激发CTL介导的特异性细 胞免疫应答，发挥抗肿瘤效能，已经成为当今肿瘤治疗性多肽疫苗研制领域的一个重要课 题。
[0004] 肿瘤抗原的发现及其CTL表位的鉴定是肿瘤特异性免疫治疗以及肿瘤治疗性多 肽疫苗研制的重要前提。表皮生长因子受体通路底物No. 8(Epidermal Growth Factor Receptor pathway substrate No. 8, EPS8)是表皮生长因子受体（EGFR)重要的激酶活性底 物之一。近年研宄显示，EPS8在多种实体瘤（如宫颈癌、结直肠癌、垂体瘤、口腔鳞癌、胰腺 导管癌、乳腺癌、甲状腺癌、食管癌及恶性胶质瘤等）及血液系统肿瘤（如多发性骨髓瘤、急 性髓系白血病、混合系白血病等）的组织及细胞中表达异常升高，而在正常组织表达很低 或无表达。进一步的研宄显示，EPS8通过调控细胞周期促进肿瘤细胞的增殖，通过参与细 胞伪足的形成及与肌动蛋白的相互作用促进肿瘤细胞的转移，通过影响肿瘤细胞对化疗药 物的耐受性与患者的预后相关(Li Y*，Xue T, He Y, Du J. A novel oncoprotein Eps8:new target for anti-cancer therapy. Future Oncology. 2013 (Accepted))。此外，本课题组 在前期的实验研宄中发现，重组小鼠 rmHis-EpsS蛋白疫苗可有效诱导荷4T1乳腺癌小鼠产 生特异性抗肿瘤免疫应答，抑制小鼠体内肿瘤细胞的增殖，延长其生存时间，而对小鼠脑、 心、肝、肾、小肠、附睾组织无明显的毒性作用。（He YJ, Zhou .T，Li Y*，et al. Eps8vaccine exerts prophylactic antitumor effects in a murine model: a novel vaccine for breast carcinoma. Mol Med Rep. 2013Aug;8 (2) :662-8)。因此，EPS8 是肿瘤诊断和抗肿瘤 治疗的新靶点，在肿瘤免疫治疗中具有巨大潜力。
[0005] 免疫原性弱和免疫耐受极大地限制了天然CTL表位在肿瘤治疗性多肽疫苗中的 应用，因此，有效提高天然CTL表位的免疫原性并打破机体的免疫耐受成为肿瘤治疗性多 肽疫苗发展的关键。在众多肿瘤治疗性多肽疫苗的增强策略中，对天然CTL表位进行分子 改造被认为是最行之有效的方法之一。由于CTL表位与主要组织相容性复合体（MHC)- I 类分子的结合是诱导CTL免疫应答的关键因素，而CTL表位与MHC- I类分子结合的重要基 础是锚定残基，因此，可通过改变锚定残基或其相邻位置的氨基酸残基以达到增强免疫原 性而不影响特异性的目的。研宄发现，在九肽CTL表位中，第二位及第九位为HLA-A2. 1分 子的主要锚定位点，二位为Leu或Met，九位为Leu、Val或lie，能将表位与MHC结合的能力 提高10?100倍，而在一位引入Tyr则可依靠其侧链苯环的疏水作用以及酚羟基的氢键作 用增强表位肽与HLA分子的相互作用。
[0006] 本申请主要采用理论和实验相结合的方法，修饰并初步鉴定出与MHC- I类分子 具有强结合力并有效诱导抗肿瘤免疫应答的EPS8来源的候选CTL表位肽及其类似物。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的一个技术问题是针对上述的技术现状而提供一种肿瘤抗原 EPS8来源的HLA-A*0201限制性CTL表位，该表位能够以高亲和力结合HLA-A*0201分子，所 形成的复合物稳定，能够诱导肽特异性的CTL免疫应答，表现为刺激肽特异性CTL分泌高水 平的IFN-γ并对肿瘤细胞产生特异性杀伤效应。
[0008] 本发明所要解决的另一个技术问题是针对上述的技术现状而提供一种在肿瘤原 EPS8来源的HLA-A*0201限制性CTL表位肽在制备治疗肿瘤药物中的应用。
[0009] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
[0010] EPS8 抗肿瘤 CTL 表位肽，为九肽，其序列为：Trp-a-Gln-Asp-Met-Ile-Leu-Gln-V al，其中，a 为 Thr 或 Leu ;b-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Phe-Phe_c，其中，b 为 Ile 或 Tyr，c 为 Ile 或 Val ;Phe-Leu-Phe-Thr-Pr〇-Leu-Asn-Met-Val ;d-Leu-Ala-Glu-Ser-Val-Ala-Asn-V al，其中，d为Gln或Tyr。
[0011] 当 a 为 Thr 时，序列为 Trp-Thr-Gln-Asp-Met-Ile-Leu-Gln-Val (即 WTQDMILQV，记 为 EPS8-101);
[0012] 当 a 为 Leu 时，序列为 Trp-Leu-Gln-Asp-Met-Ile-Leu-Gln-Val (WLQDMILQV，记为 EPS8-101-2L)；
[0013] 当 b 为 lie，c 为 Ile 时，序列为 Ile-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Phe-Phe-Ile (即 ILDDIEFFI，记为 EPS8-276);
[0014] 当 b 为 lie，c 为 Val 时，序列为 Ile-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Phe-Phe-Val (艮P ILDDIEFFV，记为 EPS8-276-9V);
[0015] 当 b 为 Tyr，c 为 Val 时，序列为 Tyr-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Phe-Phe-Val (艮P YLDDIEFFV，记为 EPS8-276-1Y9V);
[0016] Phe-Leu-Phe-Thr-Pro-Leu-Asn-Met-Val (即 FLFTPLNMV，记为 EPS8-360);
[0017] 当 d 为 Gln 时，序列为 Gln-Leu-Ala-Glu-Ser-Val-Ala-Asn-Val (即 QLAESVANV，记 为 EPS8-455);
[0018] 当 d 为 Tyr 时，序列为 Tyr-Leu-Ala-Glu-Ser-Val-Ala-Asn-Val (即 YLAESVANV，记 为 EPS8-455-1Y)。
[0019] 此外，本发明涵盖经过修饰的肽，其中替代或添加了一个、两个或更多个氨基酸而 得到的序列，只要经过修饰的肽保留原始的CTL诱导能力。
[0020] 所述肿瘤抗原EPS8来源的HLA-A*0201限制性CTL表位在制备肿瘤治疗性多肽疫 苗中的应用。
[0021] 其中，所述EPS8阳性肿瘤包括宫颈癌、结直肠癌、垂体瘤、口腔鳞癌、胰腺导管癌、 乳腺癌、甲状腺癌、食管癌、恶性胶质瘤、多发性骨髓瘤、急性髓系白血病、混合系白血病等。
[0022] 本发明的有益效果在于：本发明公开了来源于肿瘤抗原EPS8的天然CTL表位肽及 模拟表位肽，该CTL表位能够肽能够诱导肽特异性的CTL免疫应答，表现为可刺激肽特异性 CTL分泌高水平IFN-γ并对EPS8阳性肿瘤细胞产生特异性杀伤效应；由于肿瘤抗原EPS8 广泛表达于不同类型的肿瘤组织中，因此，本发明的CTL表位肽可作为活性成分，和药学上 课接受的载体组成组合物，或者，与其它具有药理活性的提取物和/或合成药物和药学上 课接受的载体组成组合物，再按照药学领域的常规方法制备基于抗原EPS8的肿瘤疫苗，用 于治疗和/或预防EPS8表达阳性的肿瘤，和/或预防其手术后复发，在肿瘤免疫治疗领域 具有很好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1为本发明表位肽诱导的特异性CTL分泌IFN-γ能力的检测结果；
[0024] 图2为本发明表位肽诱导的特异性CTL对肿瘤细胞特异性杀伤效应的检测结果；
[0025] 图3为本发明表位肽EPS8-101诱导的特异性CTL对肿瘤细胞特异性杀伤效应的 HLA-A*0201限制性检测结果；
[0026] 图4为本发明表位肽EPS8-276诱导的特异性CTL对肿瘤细胞特异性杀伤效应的 HLA-A*0201限制性检测结果；
[0027] 图5为本发明表位肽EPS8-360诱导的特异性CTL对肿瘤细胞特异性杀伤效应的 HLA-A*0201限制性检测结果；
[0028] 图6为本发明表位肽EPS8-455诱导的特异性CTL对肿瘤细胞特异性杀伤效应的 HLA-A*0201限制性检测结果；
[0029] 图7为本发明表位肽EPS8-101-IY诱导的特异性CTL对肿瘤细胞特异性杀伤效应 的HLA-A*0201限制性检测结果；
[0030] 图8本发明表位肽为EPS8-276-9V诱导的特异性CTL对肿瘤细胞特异性杀伤效应 的HLA-A*0201限制性检测结果；
[0031] 图9为本发明表位肽EPS8-276-1Y9V诱导的特异性CTL对肿瘤细胞特异性杀伤效 应的HLA-A*0201限制性检测结果；
[0032] 图10为本发明表位肽EPS8-455-1Y诱导的特异性CTL对肿瘤细胞特异性杀伤效 应的HLA-A*0201限制性检测结果；
【具体实施方式】
[0033] 为以下将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
[0034] 一、EPS8HLA-A*0201 限制性 CTL 表位的预测
[0035] 1、生物学软件预测CTL表位
[0036] 本发明所述的EPS8来源的抗肿瘤CTL表位肽类似物，是根据抗原的一级结构，采 用免疫信息学手段，运动在线生物学软件SYFPEITHI、BIMAS和NetMHC 3. 2对EPS8抗原结 构的HLA-A*0201限制性进行预测分析，筛选WTQDMILQV(记为EPS8-101)、ILDDIEFFI (记 为 EPS8-276)、FLFTPLNMV (记为 EPS8-360)及 QLAESVANV (记为 EPS8-455)作为候选 CTL表位肽，并根据HLA-A*0201限制性表位基序及其它位置上不同氨基酸残基对表位 与HLA-A*0201分子亲和力的影响，对上述天然CTL表位的主要锚定残基或其相邻位置 的氨基酸残基进行替换，使CTL表位不包含不利于结合的氨基酸残基或有利于结合的氨 基酸残基多余不利于结合的氨基酸残基，由此设计出4个模拟CTL表位：WLQDMILQV(记 为 EPS8-101-2L)、ILDDIEFFV (记为 EPS8-276-9V)、YLDDIEFFV (记为 EPS8-276-1Y9V)和 QLAESVANV (记为 EPS8-455)。
[0037] 二、候选模拟CTL表位的合成
[0038] 候选模拟CTL表位委托杭州中肽生化有限公司采用标准Fmoc方案进行合成，并采 用反相高效液相色谱法进行纯化和纯度分析，质谱法进行鉴定和分子量测定。结果显示，各 候选模拟CTL表位的纯度均高于95%，分子量与理论值相符。
[0039] 所得候选CTL表位肽用二甲基亚砜（DMSO)溶解制成储备液，置温度-70 °C保存，临 时前用磷酸盐缓冲液（PBS)稀释。固相合成步骤可参考现有的技术。
[0040] 三、上述制备的CTL表位肽，可用于制备肿瘤治疗性多肽疫苗，其应用实验如下：
[0041] 3. 1、候选CTL表位肽与HLA-A*0201分子亲和力试验
[0042] (I) 800rpm离心收集HLA-A2. 1表达阳性且缺失内源性抗原加工处理能力的T2细 胞（ATCC公司），PBS洗涤3次，无血清RPMI-1640培养基重悬细胞至细胞密度为I X IO6/ ml，接种于24孔板；
[0043] (2)每孔加入CTL表位肽、阳性对照肽（流感基质蛋白MP58_66:GILGFVFTL)或阴 性对照肽（Idi 〇type98_1Q6:AHTKDGFNF)至终浓度为50 μ g/ml (内含β 2微球蛋白3 μ g/ml)， 37°C，5% CO2、饱和湿度条件下孵育18h ;
[0044] (3)冰PBS洗涤3次后，加入FITC标记的HLA-A2. 1抗体，4°C避光孵育30min ;
[0045] (4)冰PBS洗涤3次后，流式细胞仪于波长488nm处测定平均荧光强度，并计算荧 光系数FI :FI=(样品平均荧光强度-背景平均荧光强度）/背景平均荧光强度检测。FI > 1. 5为高亲和力，I. 0 < FI < 1. 5为中等亲和力，FI < I. 0为低亲和力。
[0046] 结果：如表1所示，EPS8-276、EPS8-360及EPS8-455表位肽与HLA-A2. 1分子具有 高亲和力，EPS8-101表位肽具中等亲和力；且改造肽与HLA-A2. 1分子的结合力均高于母体 肽。
[0047] 3. 2、候选CTL表位肽/HLA-A2. 1分子复合物稳定性分析
[0048] (I) 800rpm离心收集T2A2细胞，用冰PBS洗涤3次，无血清RPMI 1640培养基（含 100ng/ml人β 2微球蛋白）重悬至细胞密度为I. 0 X l〇7ml，接种于24孔培养板；
[0049] (2)每孔加入CTL表位肽至终浓度为100 μ mol/ml，37°C、5% 0)2及饱和湿度条件 下孵育Wh ;
[0050] (3)冰PBS洗涤细胞4次，除去未结合的游离肽；
[0051] (4)每孔加入 Brefeldin A(BFA，Sigma 公司）至终浓度为 10 μ g/ml，37°C、5% CO2 及饱和湿度条件下孵育Ih ;
[0052] (5)冰PBS洗涤细胞1次；
[0053] (6)加入含0. 5 μ g/ml BFA的无血清1640培养基，于37°C、5% CO2及饱和湿度条 件下分别孵育〇h、2h、4h、6h、8h ;
[0054] (7)孵育结束后，冰PBS洗涤3次，加入FITC标记的HLA-A2. 1抗体，4°C避光反应 30min ；
[0055] (8)冰PBS洗涤3次后，流式细胞仪于波长488nm处测定平均荧光强度。结果用表 位肽/HLA-A2. 1分子复合物的半衰期DC50表示。
[0056] 结果：如表1所不，8条表位肽/HLA-A2. 1复合物的半衰期均大于6h。
[0057] 表1表位肽与HLA-A2. 1分子结合力及稳定性试验结果
[0058]
【权利要求】
1. 一种EPS8抗肿瘤CTL表位肽，为九肽，其序列为：Trp-a-Gln-Asp-Met-Ile-Leu-Gln -Val，其中，a 为 Thr 或 Leu。
2. 根据权利要求1所述的EPS8抗肿瘤CTL表位肽，其特征在于：在a为Thr时，其序 列为：Trp-Thr-Gln-Asp-Met-Ile-Leu-Gln-Val 〇
3. 根据权利要求1所述的EPS8抗肿瘤CTL表位肽，其特征在于：在a为Leu时，其序 列为：Trp-Leu-Gln-Asp-Met-Ile-Leu-Gln-Val 〇
4. 根据权利要求1所述的EPS8抗肿瘤CTL表位肽，其特征在于：采用固相合成法制备 CTL表位肽。
5. 权利要求1?3任意一项权利要求所述的EPS8抗肿瘤CTL表位肽在制备治疗肿瘤 药物中的应用。
【文档编号】C07K14/47GK104497124SQ201410857491
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2013年12月23日 优先权日:2013年12月23日
【发明者】李玉华, 周炜均 申请人:南方医科大学