专利名称：鸡新城疫与h9亚型禽流感二联灭活疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种鸡新城疫与H9亚型禽流感二联灭活疫苗及其制备方法，特别 是指一种免疫剂量小、免疫效果更好的鸡新城疫与H9亚型禽流感二联灭活疫苗及其制备方法。
背景技术：
新城疫病毒(Newcastledisease virus, NDV)又称亚洲鸡癌病毒、伪鸡癌病毒或禽肺脑炎病毒。在病毒分类学中的位置属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)、副黏病毒属 (Paramyxovirus)中的一个种。该病毒主要危害鸡、珠鸡和火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全群毁灭。弱毒株仅引起鸡群呼吸道感染和产蛋量下降，但可迅速康复。人类可因接触病禽和活毒疫苗而引起结膜炎或淋巴腺炎，但很快便康复。新城疫病毒被OIE规定为A类疫病，是一种急性、高度接触性传染病，发病率和死亡率都在90%以上， 1935年梁英、马闻天等首次证实我国有该病的流行，现在本病被我国列为I类疫病。禽流感(Avian influenza, Al)是由正粘病毒科流感病毒属的A型流感病毒引起的一种以侵害呼吸系统为主的急性传染病、该病发生于各种家禽和野鸟。至1878年禽流感首发于意大利，目前全球性的禽流感大流行已出现多次，特别是自2003年12月以来，高致病性禽流感横扫亚洲多国家禽养殖业，造成极大的经济损失。禽流感病毒的抗原非常容易变异，这是禽流感反复流行的重要原因，禽流感病毒存在多种亚型，在特种条件下会跨越种属界限而传染到人，2004年初在越南流行感染人的H5W再一次给人类敲响了警钟。目前新城疫、禽流感严重危害家禽养殖业的发展，在各种防控措施中，疫苗免疫仍为最重要的措施。针对新城疫、禽流感，现已有相应的单项灭活疫苗及二联灭活苗，现有疫苗免疫剂量大(1 5周龄鸡，每只0. 3ml)，免疫应激大，特别不适于对小日龄鸡的免疫。如 《鸡新城疫病毒禽流感病毒二联灭活疫苗免疫试验》(中国家禽，2009年)使用鸡新城疫_禽流感二联苗，但其注射剂量仍为0. 3ml/只(参见1. 2. 4节)，免疫效果对禽流感的保护率最高仅为5/10的保护率(参见第50页表3、表4)。又如《鸡新城疫-禽流感二联油乳剂灭活苗的研制及应用效果》(任素芳等，山东农业科学，2002年第6期第38页)一文中公开了一种鸡新城疫_禽流感二联油乳剂灭活苗，即“40只试验鸡注射0. 3ml疫苗免疫，从免疫后第 2周开始采血检测抗体”。但是该二联疫苗的免疫的剂量偏大，每只鸡为0.3ml。在这种情况下，免疫剂量大，免疫应激大，特别不适于小日龄的鸡。而且，由于油乳剂疫苗的粘连性， 给疫苗的接种带来了困难。因此，当前研制出免疫剂量小、免疫效果更好、成本更低、免疫保护期更长的新城疫、禽流感二联疫苗是一项紧迫的任务。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种预防鸡新城疫和H9亚型禽流感二联浓缩灭活疫苗组合物含有灭活的新城疫病毒LaSota株；灭活的H9亚型禽流感病毒HL株和佐剂。其中新城疫(LaSota株)抗原，疫苗中优选含灭活的鸡新城疫病毒(LaSota株) 病毒含量每0. Iml彡4X108 °EID50,灭活浓缩后HA价彡101og2 ；H9亚型禽流感HL株灭活前病毒含量每0. Iml彡4X108 °EID50,灭活浓缩后HA价彡101og2。最优选病毒含量每 0. Iml 彡 4X 108 5EID50。本发明的免疫佐剂为白油，最优选法国美孚公司白油。本发明的另一目的在于提供一种治疗和预防鸡新城疫和H9亚型禽流感二联浓缩灭活疫苗的制备方法，其步骤如下
1)生产用毒种的制备H9亚型禽流感病毒HL株和新城疫LaSota株毒种繁殖、毒种鉴定(病毒含量、纯净性、特异性)、毒种保存、毒种继代；2)制苗病毒液的制备接种、孵育与观察、收获、检验；3)制苗病毒液的浓缩浓缩装置的灭菌、病毒液浓缩、浓缩检验；4)制苗病毒液的灭活甲醛灭活；5)半成品检验无菌检验、灭活检验、病毒含量测定；6)油乳剂灭活苗的制备油相制备、水相制备、乳化制苗；7)成品检验物理性状、无菌检验、安全检验、效力检验、甲醛硫柳汞残留量测定。由本发明下面的实施例可以看出，本发明通过提高疫苗单位体积的抗原含量，使疫苗免疫剂量降低到现有疫苗的1/3剂量，即对于1 5周龄鸡，每只0. 3ml疫苗降低到 0. Iml疫苗，从而减小疫苗免疫对机体的应激反应，而且适用于小日龄鸡群，增大疫苗的适用范围。此外，在降低疫苗剂量的前提下，本发明的疫苗的免疫效果没有降低。即，本发明提供了一种免疫剂量小、免疫效果更好、成本更低、免疫保护期更长的新城疫、禽流感二联疫苗。
具体实施例方式本发明实施例的禽流感病毒A/Chicken/Henan/Luoyang/HL/2001 (H9N2)(简称 HL 株)。已于文献《鸡新城疫病毒禽流感病毒二联灭活疫苗免疫试验》(中国家禽，2007年第 29卷第16期，49-52)中公开，并在普莱柯生物股份有限公司保藏。鸡新城疫病毒Lasota 株，购自中国兽医药品监察所。实施例1鸡新城疫和H9亚型禽流感二联浓缩灭活疫苗的制备1生产用毒种的制备1. 1H9HL株毒种繁殖及鉴定1. 1. 1 毒种繁殖禽流感病毒 A/Chicken/Henan/Luoyang/HL/2001 (H9N2)(简称 HL 株)。将HL株冻干毒用灭菌生理盐水作适当稀释(10_3 10_4)，0. Iml/枚尿囊腔接种10 日龄SPF胚，于37°C孵育96h，期间48h以前的死胚弃去，48h后每隔4 6小时照胚1次， 及时取出死亡的胚。至96h全部取出，放2 8°C冰箱冷藏12h以上，分别收获鸡胚液，装入灭菌容器中，将检验无菌且HA > 1 512的鸡胚液混合，定量分装，每瓶2ml，冷冻保存。 注明收获日期、毒种代数等。1. 1. 2病毒含量测定将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-7、10_8、10-9倍稀释毒种。
上述三个稀释度经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚各5枚，每胚0. lml，37 °C继续孵育，24h前死去的胚弃去不计，在24 120h死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度的鸡胚液等体积量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至120h，取出所有活胚，逐个收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价> 1 16者判为感染，计算EID50。 EID50 彡 10_8 CI/0. 1ml。
1. 1. 3特异性HI试验毒种对抗H9亚型禽流感病毒特异性血清应为阳性反应，对抗H5亚型禽流感病毒特异性血清、抗新城疫特异性血清、抗减蛋综合症病毒特异性血清均应为阴性反应。鸡胚中和试验将毒种用灭菌生理盐水1000倍稀释，与等量抗AIV H9亚型特异性血清混合，室温中和lh，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0. 2ml ；同时SPF胚5枚为对照，尿囊腔接种1000倍稀释的毒种，每胚0. 1ml，同条件培养，观察至120h，记录观察结果。中和组鸡胚应至少有4枚健活，对照组应至少4枚感染，感染判定标准是鸡胚死亡或存活的鸡胚测定其鸡胚液血凝价> 1 16。1. 1. 4纯净按《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000版)附录448-451页方法进行，无细菌、支原体、外源病毒污染。1. 1. 5毒种保存-15°C以下保存，保存期应不超过6个月即可。1. 1.6毒种继代应不超过3代即可。1. 2新城疫病毒(下简称NDV) Lasota株毒种繁殖及鉴定1. 2. 1毒种繁殖鸡新城疫病毒Lasota株，购自中国兽医药品监察所。将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释(10_3 10_4)，按0. Iml/枚尿囊腔接种10日龄SPF胚，培养120h， 每隔4 6小时照胚1次，及时取出死亡的胚，选接种后72 120小时死亡且病痕明显的鸡胚，分别收获鸡胚液，装于灭菌容器中。将检验无菌且HA > 1 512的鸡胚液混合，定量分装，每瓶2ml，冷冻保存。注明收获日期、毒种代数等。1. 2. 2病毒含量测定将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10人10_8、10_9稀释毒种。上述三个稀释度经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚各5枚，每胚0. lml，37 °C继续孵育，48h前死去的胚弃去不计，在48 120h死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度的鸡胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至120h，取出所有活胚， 逐个收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价> 1 128者判为感染，计算EID50。 EID50 彡 108 0/0. Imlo1. 2. 3纯净按《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000版)附录448-452页方法进行，无细菌、支原体、外源病毒污染。1. 2. 4特异性将毒种用灭菌生理盐水稀释至105_°EID50/0. ImL倍稀释，与等量抗 NDV特异性血清混合，室温中和Ih后，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚10枚，每胚0. 2ml，观察至120h，在24 120h内应不引起特异性死亡，且至少存活8枚，测定血凝性，应为阴性。1. 2. 5毒种保存-15°C以下保存，不超过6个月。1.2. 6毒种继代不超过3代。2.制苗病毒液的制备2. 1鸡新城疫病毒(下简称NDV) LaSota株制苗用病毒液制备取生产用NDV LaSota株毒种，用灭菌生理盐水作200倍稀释，经尿囊腔接种10日龄非免疫鸡胚，每胚 0. 2ml。置36 37°C孵育，每4小时照蛋1次，随时取出死亡鸡胚，，直至96小时全部取出， 置2 8°C冷 却12 24小时后收取尿囊液，死胚和活胚分别收获，置-20°C保存。抽样测定HA效价及EID5tl的测定，HA效价低于1 128者弃去，同时每0. Iml病毒液的病毒含量彡 IO8 0EID5002. 2禽流感病毒(下简称AIV) HL株病毒液的制备取生产用AIV HL株毒种，用无菌生理盐水作50万倍稀释，分别经尿囊腔内接种10日龄非免疫鸡胚，每胚0.2ml。置36 37°C孵育，每4小时照蛋1次，随时取出死亡鸡胚，直至96小时全部取出，置2 8°C冷却 12 24小时后收取尿囊液，死胚和活胚分别收获，置_20°C保存。抽样测定HA效价及EID5q 的测定，每0. Iml病毒液含量> IO8 0EID5003制苗病毒液的浓缩3. 1浓缩装置的灭菌预过滤柱、容器、管道等采用高压蒸汽121°C灭菌40min。超滤膜包清洗后排净膜包内水分，用2% ν/ν甲醛溶液循环5 lOmin，关闭循环泵，使甲醛溶液在膜包内保持24h以上。使用前放掉甲醛溶液，用灭菌注射用水反复冲洗至PH7. O 7. 2。3. 2浓缩先将病毒液在无菌条件下用灭菌的二级预过滤柱滤过，除去病毒液中的残渣和其它杂质。再用上述超滤浓缩装置，将病毒液连续循环，水分不断渗出，完成病毒浓缩过程，分别将NDV和AIV病毒液按4倍体积比例进行浓缩。浓缩结束后，用蒸馏水将超滤膜包的残留物冲洗出来，然后用0. IM NaOH溶液反复循环冲洗30min，停止循环，使NaOH溶液在膜包内保持IOh以上，再用蒸馏水将NaOH洗净，用甲醛溶液浸泡消毒。3. 3浓缩效果测定2种病毒浓缩前和浓缩后，用测血凝价HA方法进行检查，并确定浓缩终点，进行4倍浓缩前后HA关系为浓缩后HA = 2+浓缩前HA。2种病毒液按上述浓缩终点进行浓缩，浓缩后的病毒应达到浓缩终点的要求，同时对浓缩过程中的废弃液应随时抽样进行检查，检查其HA为零，符合要求。4制苗病毒液的灭活将无菌的两种病毒液分别以4层纱布及一层细铜纱网滤过，混合于一个大玻璃瓶内，吸出数毫升样品备测毒价用。其余的病毒液分别加入10%甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合，甲醛溶液的终浓度为0. 1%。加甲醛溶液后最好倾倒另一瓶中，以避免瓶颈附近粘附的病毒未能接触灭活剂。然后37°c灭活16h(以瓶内温度达到37°C开始计时)期间振摇 3 4次。灭活后置2 8°C保存，保藏时间不超过1个月。5半成品检验5. 1无菌检验取灭活的病毒液按《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000版) 附录448页方法进行，无菌生长，符合要求。5. 2灭活检验5. 2. INDV灭活检验取10日龄无新城疫病毒抗体的鸡胚6枚，每个接种灭活胚液 0. 2ml，置36 37°C孵育，每日照蛋2次，弃去24h死亡的鸡胚，观察120h，鸡胚非特异性死亡不超过1枚。对所有的胚液测定血凝价，应不出现血凝，并盲传1代，测定血凝价，均不出现血凝，判为灭活完全。5. 2. 2AIV灭活检验取10日龄无禽流感病毒抗体的鸡胚6枚，每个接种灭活胚液 0.2ml，置36 37°C孵育，每日照蛋2次，观察5日，鸡胚非特异性死亡应不超过1个。对所有的胚液测定血凝价，不出现血凝，并盲传1代，测定血凝价，均不出现血凝，判为灭活完
全。 6油乳剂灭活苗的制备6. 1水相制备将上述灭活的抗原液，以NDV浓缩液AIV浓缩液按一定比例混合后， 按抗原混合液的4%加体积吐温-80，充分摇勻，使吐温-80完全溶解，即为水相。6. 2油相制备白油94份、司本-806份，混合后加硬脂酸铝1. 5份，将3种成分混合加热完全溶解后，121°C高压灭菌40min，冷却后备用，即为油相。6. 3乳化按水相油相=1 2的比例乳化。将乳化机的转子在75体积％酒精中浸泡过夜后备用。先加油相2份于灭菌容器中，开动电机慢慢搅拌，然后徐徐加入水相1 份，加完后再以2800rpm乳化4分钟。在终止乳化前加入1体积％硫柳汞溶液，使其终浓度为0. 01体积％。乳化后取IOml以3000rpm离心15min，不出现分层现象。6. 4疫苗制备配方按下表配制不同抗原含量的鸡新城疫和h9亚型禽流感二联浓缩灭活疫苗。通过对抗原的浓缩分别制备鸡新城疫和H9亚型禽流感二联浓缩疫苗，疫苗1、 2、3组分别含有不同的抗原含量。
权利要求
1.一种治疗和预防鸡新城疫和H9亚型禽流感的二联浓缩灭活疫苗，其特征在于，含有灭活的新城疫病毒LaSota株，灭活的H9亚型禽流感病毒HL株和佐剂。
2.根据权利要求1所述的二联浓缩灭活疫苗，其特征在于，所述的新城疫病毒LaSota 株的含量为每0. Iml彡4X108_°EID50，灭活浓缩后HA价彡101og2 ；所述的H9亚型禽流感 HL株病毒含量每0. Iml彡4X108 °EID50，灭活浓缩后HA价彡101og2。
3.根据权利要求1所述的二联浓缩灭活疫苗，其特征在于，所述的新城疫病毒LaSota 株的含量为每0. Iml ^ 4X 108 5EID50，所述的H9亚型禽流感HL株病毒的含量为每 0. Iml 彡 4X 108 5EID50。
4.根据权利要求1所述的二联浓缩灭活疫苗，其特征在于，所述的免疫佐剂为白油。
5.一种预防和治疗鸡新城疫和H9亚型禽流感二联浓缩灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤1)生产用毒种的制备新城疫LaSota株和H9亚型禽流感HL株毒种繁殖；2)制苗病毒液的制备接种、孵育与观察、收获、检验；3)制苗病毒液的浓缩浓缩装置的灭菌、病毒液浓缩、浓缩检验；4)制苗病毒液的灭活甲醛灭活；5)半成品检验无菌检验、灭活检验、病毒含量测定；6)油乳剂灭活苗的制备油相制备、水相制备、乳化制苗。
全文摘要
本发明提供了鸡新城疫和H9亚型禽流感二联浓缩灭活疫苗，含灭活的新城疫病毒LaSota株和灭活的H9亚型禽流感病毒HL株及佐剂。本发明还提供二联浓缩灭活疫苗的制备方法。本发明通过提高疫苗单位体积的抗原含量，使疫苗免疫剂量降低到现有疫苗的1/3剂量，即对于1～5周龄鸡，每只0.3ml疫苗降低到0.1ml疫苗，从而减小疫苗免疫对机体的应激反应，而且适用于小日龄鸡群，增大疫苗的适用范围。此外，在降低疫苗剂量的前提下，本发明的疫苗的免疫效果没有降低。因此，本发明提供了一种免疫剂量小、免疫效果更好、成本更低、免疫保护期更长的新城疫、禽流感二联疫苗。
文档编号A61P31/16GK102302775SQ20111018864
公开日2012年1月4日 申请日期2011年7月6日 优先权日2011年7月6日
发明者孙进忠, 张许科, 白朝勇 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司